葡萄果渣酵素的發(fā)酵工藝優(yōu)化及其理化特性

洪厚勝，朱曼利，李 偉，郭會明

（1.南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211816；2.南京匯科生物工程設(shè)備有限公司，江蘇 南京 210009；3.南京工業(yè)大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，江蘇 南京 211816）

葡萄（Vitis vinifera）有“水果之神”的稱號，屬葡萄科，落葉藤本植物。葡萄分布在溫帶至亞熱帶地區(qū)，遍及亞洲、歐洲和美洲。葡萄果酒、果醋加工過程中產(chǎn)生大量廢棄的葡萄果渣，然而，葡萄果渣仍有大量的葡萄皮和葡萄籽，其中富含氨基酸、維生素、黃酮等有效活性成分，對提高人體免疫力、保護心腦血管、抗衰老、維持機體平衡的作用很大。將葡萄果渣制作酵素飲品，不僅能減少發(fā)酵行業(yè)帶來的廢棄物污染問題，并且能極大地提高葡萄果渣的利用率與附加值[1]。

益生菌利用果蔬中糖類、蛋白質(zhì)、維生素、花色苷等營養(yǎng)成分并代謝轉(zhuǎn)換成小分子活性物質(zhì)如氨基酸、酶類、有機酸等，不僅保留了天然果香，還增加了營養(yǎng)密度[2]。王珍珍等[3]發(fā)現(xiàn)樹莓酵素中主要微生物是酵母菌，并從樹莓酵素中分離鑒定、篩選出耐高糖、耐酸性等耐高滲特性的魯氏接合酵母。海棠果酵素中主要篩選菌株為鼠李糖乳桿菌，體外益生功能評價顯示，該菌株具有顯著降低膽固醇能力[4]。馬曉偉等[5]研究表明，火龍果酵素中添加的益生菌主要是產(chǎn)乳酸芽孢桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖桿菌，該益生菌群不僅將火龍果果香和乳酸發(fā)酵風(fēng)味完美結(jié)合，而且可使發(fā)酵后的火龍果酵素液營養(yǎng)豐富。

葡萄果渣酵素是以葡萄果渣為主要原料，利用微生物發(fā)酵得到的具有營養(yǎng)和保健作用的產(chǎn)品。葡萄果渣酵素從選材到發(fā)酵工藝不僅保留了原料本身的營養(yǎng)價值，而且通過微生物發(fā)酵不斷產(chǎn)生新的活性物質(zhì)，融合互補，協(xié)同增效[6]。本研究對多菌種發(fā)酵葡萄果渣酵素工藝條件進行了優(yōu)化，以期進一步研究工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)工藝，為多菌種酵素的廣泛應(yīng)用提供理論支持[7]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌種

葡萄果渣由南京匯科生物工程設(shè)備有限公司提供。

德氏乳桿菌保加利亞亞種（編號NJUTLO31605）、許氏醋酸菌（編號NJUTAO11605）為實驗室保藏；動物雙歧桿菌（編號21709）、嗜熱鏈球菌（編號20372）、副干酪乳桿菌（編號20241）、酵母菌（編號1001）購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 菌種培養(yǎng)基

乳酸菌通用培養(yǎng)基（MRS）：蛋白胨1 g/100 mL、牛肉浸膏1 g/100 mL、酵母抽提物0.5 g/100 mL、磷酸氫二鉀0.2 g/100 mL、檸檬酸氫二銨0.2 g/100 mL、乙酸鈉0.5 g/100 mL、葡萄糖2 g/100 mL、吐溫80 0.1 g/100 mL、硫酸錳0.025 g/100 mL、硫酸鎂0.058 g/100 mL（如為固體培養(yǎng)基，再加入1.5%～1.7%瓊脂粉），于121 ℃高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌20 min。

酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（YPD）：酵母膏1%、葡萄糖2%、魚粉蛋白胨2%（如為固體培養(yǎng)基，再加入1.5%～1.7%瓊脂粉），于121 ℃高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌20 min。

許氏醋酸菌種子培養(yǎng)基：葡萄糖0.5 g，酵母粉0.5 g，水100 mL，121 ℃、0.1 MPa滅菌20 min，冷卻至30 ℃，加入3.0 mL無水乙醇。

1.1.3 試劑

糖蜜 市售工廠制糖副產(chǎn)品；果膠酶（5 U/mg）國藥集團化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉、沒食子酸標準品、鄰苯三酚、福林酚、三氯化鐵 阿拉丁化學(xué)試劑有限公司；2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS） 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA124電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；數(shù)顯電子恒溫水浴鍋 江蘇金壇宏華儀器廠；TGL-20B高速臺式離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；UVmini-1240紫外分光光度計 日本島津有限公司；5 L自吸式攪拌發(fā)酵罐 南京匯科生物工程設(shè)備有限公司；超凈工作臺無錫一凈凈化設(shè)備廠；WBL2531H多功能攪拌機 美的集團股份有限公司；YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌鍋上海博迅有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 葡萄果渣酵素的基本工藝流程[8]

1.3.2 菌種的活化

配制各菌種所需培養(yǎng)基，分別在其中接入10%（體積分數(shù)）液態(tài)保藏的乳酸菌、酵母菌、醋酸菌菌液。乳酸菌培養(yǎng)溫度為37 ℃，厭氧培養(yǎng)48～72 h；酵母菌培養(yǎng)溫度為30℃，搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min，培養(yǎng)24 h；醋酸菌培養(yǎng)溫度為30 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min，培養(yǎng)48～72 h。

1.3.3 果膠酶酶解

經(jīng)粉碎過后的葡萄果渣中仍含有豐富果膠的葡萄皮，為使葡萄皮分解成小分子，需添加果膠酶將其酶解成易于生物體轉(zhuǎn)化和利用的糖類小分子。稱取果膠酶7.5 g，葡萄果渣料液比1∶2（g/mL），調(diào)pH 4.5，在50 ℃條件下，用0.15%果膠酶處理葡萄果渣液120 min，以分解葡萄果渣中的果膠，使細胞更易破碎，降低葡萄果渣液的黏度[9]。

1.3.4 發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方

添加比例為糖蜜∶葡萄果渣∶水=1∶2∶6（m/m）。

糖蜜的處理：將甘蔗糖蜜稀釋至25～35 °Bx，用硫酸調(diào)節(jié)pH 5.0，加熱煮沸至95 ℃，冷卻靜置12 h，盡可能除去糖蜜中膠體和色素，使用前在121 ℃條件下滅菌20 min。

輔助因子的添加：將尿素稀釋為含N量8 g/100 mL的溶液；將磷酸二氫銨稀釋為含P量8 g/100 mL；發(fā)酵罐實消后添加VB10.1 g、VB20.1 g、VB60.1 g、生物素0.05 g[10]。

1.3.5 接種發(fā)酵

將發(fā)酵罐滅菌后冷卻至室溫。加入原料和發(fā)酵培養(yǎng)液，調(diào)整底物初始pH 5.0～5.5。在初始pH 5.0～5.5、糖添加量8%、活菌接種量12%、超聲時間60 min條件下，接入菌液，酵母菌、醋酸菌分別按4%、2%的接種量接入發(fā)酵罐，30 ℃條件下發(fā)酵3 d后接入2%乳酸菌，調(diào)整溫度于37 ℃條件下共同發(fā)酵3 d，過程中測定其理化指標及抗氧化性能。

1.3.6 發(fā)酵初始條件的確定

首先考察超聲頻率、功率、溫度對不同階段微生物產(chǎn)酶及活菌率的影響，確定最佳超聲條件的基礎(chǔ)上，利用超聲輔助法制備葡萄果渣酵素的考察因素有初始pH值（4.5、5.0、5.5、6.0、6.5）、糖添加量（2%、4%、6%、8%、10%）、活菌接種量（2%、4%、8%、12%、16%）、超聲時間（0、30、60、90、120 min），研究其對葡萄果渣酵素發(fā)酵液中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力和活菌量的影響。

在單因素試驗基礎(chǔ)上，進一步采用Box-Behnken試驗設(shè)計，以SOD活力為響應(yīng)值，設(shè)計4因素3水平的響應(yīng)面分析試驗，采用Design-Expert軟件進行響應(yīng)面分析優(yōu)化葡萄果渣酵素的初始發(fā)酵條件，因素和水平如表1所示。

表 1 響應(yīng)面試驗因素及水平Table 1 Factors and levels used in Box-Behnken design

1.3.7 指標測定

酵母菌活菌數(shù)的測定：按照血球計數(shù)法操作[11-13]；乳酸菌活菌數(shù)的測定：按照美藍計數(shù)法操作[11-13]；醋酸菌活菌數(shù)的測定：按照平板計數(shù)法操作[11-13]。

可滴定酸度的測定：參考GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》中滴定法。

SOD活力的測定：按照鄰苯三酚自氧化法GB/T 5009.171—2003《保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定》操作。

總酚含量的測定：福林-酚法[14]。分別移取1 mL沒食子酸標準液和樣品液于試管中，各加入5 mL超純水和3 mL 10%福林-酚試劑，振蕩，混勻靜置5 min后加入4 mL 12%碳酸鈉溶液，最后用超純水定容至25 mL，35 ℃水浴反應(yīng)1.5 h后在700 nm波長處測定吸光度。

原花青素含量的測定：準確量取1 mL樣液，加入5 mL 5 g/100 mL的香草醛甲醇溶液及4 mL 10%鹽酸甲醇溶液，35 ℃混合搖勻靜置20 min，按照優(yōu)化后方法，測定火龍果酵素中原花青素的在波長500 nm條件下的吸光度，計算原花青素的含量[15-16]。

ABTS陽離子自由基清除能力的測定：ABTS試劑盒法[17]，以樣品質(zhì)量濃度對自由基清除率作圖并進行線性擬合，計算IC50值，IC50值定義為清除率為50%時所需抗氧化劑質(zhì)量濃度。用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液配制5 mmol/L的ABTS儲液，與MnO2反應(yīng)后過濾，再用PBS（pH 7.4）稀釋到734 nm波長處吸光度為0.68～0.72，-20 ℃保存?zhèn)溆?。在反?yīng)體系中，于10 mL比色管中加入50 μL不同質(zhì)量濃度的樣品或參比溶液（二甲基亞砜），再加入3 mL的ABTS反應(yīng)溶液，振蕩搖勻，于室溫下避光靜置6 min，測定溶液在734 nm波長處的吸光度。以不同質(zhì)量濃度Trolox為標準品，繪制標準曲線，結(jié)果表示為每克干物質(zhì)的Trolox當量[18-20]。

式中：A為樣品管的吸光度；A0為對照管的吸光度。

有機酸含量的測定[21-25]：Agilent 1200高效液相色譜儀檢測[26]，色譜柱：Inertsil ODS-2（150 mm×4.6 mm）；流動相：0.02 mol/L KH2PO4溶液；液相條件：等梯度洗脫20 min，流速1 mL/min，溫度30 ℃，進樣量10 μL，檢測波長210 nm。樣品用超純水稀釋10 倍，用0.22 μm濾膜過濾后直接進樣，每個樣品平行3 次。

1.3.8 感官評價標準

感官評價標準[27]見表2。

表 2 葡萄果渣酵素感官評價標準Table 2 Criteria for sensory evaluation of fermented grape pomace

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

本實驗采用Origin、Design-Expert軟件對數(shù)據(jù)進行處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲條件的確定

圖 1 超聲對菌體不同生長階段的活菌數(shù)影響Fig. 1 Effects of ultrasonic treatment on the number of viable cells at different growth stages

應(yīng)用于生物發(fā)酵工程的超聲波主要是功率超聲波，在一定功率和超聲強度下，對微生物進行超聲不僅能改變酶分子的構(gòu)象、促進微生物產(chǎn)酶速率，還能促進乳糖水解、減少固形物含量。根據(jù)超聲波對不同階段微生物產(chǎn)酶及活菌率的影響，確定了最佳超聲階段為菌種生長期，最佳超聲條件為超聲頻率40 kHz、功率50 W、超聲溫度30 ℃。如圖1所示，對不同生長期的微生物進行超聲，其活菌數(shù)變化趨勢較明顯，在對數(shù)生長期施加超聲條件對活菌數(shù)影響最大，此時活菌數(shù)增長了近1 個數(shù)量級。由圖1可得，對遲滯期的菌種施加超聲與未施加超聲變化不明顯；在對數(shù)生長期，超聲刺激酵母菌產(chǎn)生高級醇及益生菌副產(chǎn)物，同時減少代謝過程產(chǎn)生的CO2，從而促進細胞增殖，考慮到該生長階段對原料的轉(zhuǎn)化和利用率很高，因此在該階段施加超聲效果最佳。此外，超聲輔助發(fā)酵對菌體的平穩(wěn)期、衰亡期均有一定作用，在菌體繁殖達到平衡狀態(tài)時，低強度超聲波能穩(wěn)定增加體系中酶類、氨基酸等小分子物質(zhì)，積累更多的營養(yǎng)成分；在衰亡期施加超聲為發(fā)酵體系增添獨特的香氣成分[28]。

2.2 超聲輔助發(fā)酵葡萄果渣酵素的單因素試驗結(jié)果

圖 2 各因素對SOD活力及活菌質(zhì)量濃度的影響Fig. 2 Influence of various factors on SOD activity and viable bacterial number

利用超聲法輔助發(fā)酵葡萄果渣酵素，不僅對生物成長起到促進作用，提高產(chǎn)酶，還能增加生物量，加速在發(fā)酵過程中代謝與合成的物質(zhì)交換[29]。在糖添加量8%、活菌接種量8%、超聲60 min的條件下，發(fā)酵6 d后測定SOD活力及活菌質(zhì)量濃度，由圖2A可見，葡萄果渣酵素發(fā)酵初始pH 5.5時達到最佳點，由于酵母菌、乳酸菌和醋酸菌共酵在pH 5.5時生長狀態(tài)最佳，此條件下SOD活力高達266 U/mL，且發(fā)酵過程中活菌質(zhì)量濃度達到最大，選擇最佳初始pH 5.5時感官評分最高。

由圖2B可見，在糖添加量8%、初始pH 5.5、超聲60 min的條件下，調(diào)整溫度于37 ℃條件下共同發(fā)酵3 d。發(fā)酵6 d后測定SOD活力及活菌數(shù)，活菌接種量8%時，SOD活力高達318 U/mL，活菌質(zhì)量濃度高達7.89 g/100 mL?？紤]到菌種共酵產(chǎn)生的氣味芳香及最大菌種活率，選擇最佳接種量8%時感官評分最高[30]。

由圖2C可見，在初始pH 5.5、超聲60 min、接種量8%（酵母菌、醋酸菌分別按4%、2%的接種量接入發(fā)酵罐，30 ℃條件下發(fā)酵3 d后接入2%乳酸菌，調(diào)整溫度于37 ℃條件下共同發(fā)酵3 d）的條件下，發(fā)酵6 d后測定SOD活力及活菌數(shù)，糖添加量為6%時，提供的碳源較為豐富，菌體通過耗糖完成生長代謝的過程，但過高的糖分會抑制菌體生長，SOD活力高達348 U/mL，活菌數(shù)高達8.4 g/100 mL。糖蜜是制糖工業(yè)的副產(chǎn)品，將糖蜜代替葡萄糖不僅能融合糖蜜香氣，還能降低工業(yè)成本。發(fā)酵初期，酵母菌好氧發(fā)酵需要糖蜜源源不斷供應(yīng)，此時糖蜜添加過多容易產(chǎn)生Crabtree效應(yīng)，糖蜜過少又會導(dǎo)致菌種營養(yǎng)不夠，發(fā)酵活力低下，從而影響整個發(fā)酵周期以及發(fā)酵產(chǎn)品的活性[31-32]。考慮到菌種共酵產(chǎn)生的氣味芳香及最大菌種活率，選擇最佳糖添加量8%時感官評分最高。

由圖2D可見，在糖添加量8%、初始pH 5.5、接種量8%（酵母菌、醋酸菌分別按4%、2%的接種量接入發(fā)酵罐，30 ℃條件下發(fā)酵3 d后接入2%乳酸菌，調(diào)整溫度于37 ℃條件下共同發(fā)酵3 d）的條件下，改變超聲時間，測定發(fā)酵6 d后的SOD活力及活菌數(shù)，超聲時間為60 min下，SOD活力高達280 U/mL，活菌質(zhì)量濃度高達8.5 g/100 mL。適當超聲能改變酵母菌、醋酸菌、乳酸菌菌體內(nèi)產(chǎn)生的酶分子構(gòu)象，提高酶活力，超聲時間過長過短都會影響到酶活力以及發(fā)酵液中的活性物質(zhì)?？紤]到菌種共酵產(chǎn)生的氣味芳香及最大菌種活率，最佳超聲時間60 min時感官評分最高。

2.3 葡萄果渣酵素發(fā)酵工藝的響應(yīng)面試驗結(jié)果

利用Design-Expert軟件對表3中27 組試驗數(shù)據(jù)進行二次項回歸擬合，分別得到Y(jié)值與初始pH值、糖添加量、活菌接種量、超聲時間4 個因素的二次多項回歸方程為：

Y=1 013.06+22.37B-29.53C-41.82AB+41.56AD-5.28BC+25.26CD-125.33A2-142.41B2-160.88C2-66.32D2

由表4可以看出，二次回歸模型Y值顯著，可以用來擬合4 個因素對葡萄果渣酵素發(fā)酵過程產(chǎn)酶和活菌數(shù)的影響。Y值失擬項不顯著，回歸方程擬合性良好?；貧w方程分析表明：一次項A、C、D，交互系數(shù)AB、AC、BC、BD、CD，二次項系數(shù)B2、C2、D2影響顯著或極顯著。F值反映了各因子對于響應(yīng)值的重要性，A＞D＞C＞B，對葡萄果渣酵素發(fā)酵工藝的影響順序為：初始pH值＞超聲時間＞活菌接種量＞糖添加量。

表 3 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果Table 3 Box-Behnken design with experimental results

表 4 回歸方程的方差分析Table 4 Analysis of variance for regression model

為直觀地反映出各因素及其交互作用對響應(yīng)值的影響結(jié)果，以SOD活力為指標，對上述回歸方程繪制三維響應(yīng)面及其等高線圖，見圖3。

圖 3 各因素交互作用對SOD活力影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig. 3 Response surface and contour plots showing the interactive effects of various factors on SOD Activity

葡萄果渣酵素在益生菌作用下產(chǎn)酶，酶活力是衡量發(fā)酵體系是否達到成熟的一個指標，是酵素行業(yè)廣泛測定的營養(yǎng)指標之一，由于活菌數(shù)越多，酶活力越強[33]。為直觀反映各因素及其交互作用對酶活的影響結(jié)果，對回歸方程繪制三維響應(yīng)面圖及其等高線。由圖3a可知，初始pH值和糖添加量的交互影響明顯，隨著糖添加量的增加，酶活逐漸增大，糖添加量超過8%后，酶活為逐漸降低，初始pH值也同單因素試驗的結(jié)果相符。由圖3b可知，活菌接種量和初始pH值交互作用顯著，SOD活力在活菌接種量8%～16%、初始pH在4.5～5.5范圍內(nèi)有最大值。由圖3c可知，等高線圖接近圓形，因此確定初始pH值和超聲時間作用不顯著。由圖3d可知，兩者交互作用顯著，隨著活菌接種量、糖添加量的增加，酶活力呈現(xiàn)極大值點。通過分析計算得到超聲促進葡萄果渣酵素發(fā)酵產(chǎn)酶的最優(yōu)條件為：初始pH 5.00、糖添加量8.11%、活菌接種量11.75%、超聲時間57.61 min。此條件下，感官評分高達87 分，模型預(yù)測發(fā)酵液的SOD活力為1 004.22 U/mL，比優(yōu)化前有明顯提高。

2.4 補料方式的對比實驗結(jié)果

一次性補料方式是傳統(tǒng)的發(fā)酵方法，發(fā)酵過程中各參數(shù)可以宏觀反映出發(fā)酵機理的變化，但是由于體系中碳源的轉(zhuǎn)化使微生物的后期生長比較困難，容易使菌體走向自溶。在工業(yè)生產(chǎn)中既要保證發(fā)酵質(zhì)量，又要正確判斷發(fā)酵終點，把握發(fā)酵周期是重中之重。本實驗對傳統(tǒng)酵素工藝中一次性投料進行改進，探索分批補料方式對葡萄果渣酵素發(fā)酵過程理化指標變化及發(fā)酵終點的影響。因此將響應(yīng)面優(yōu)化過后的最佳工藝條件在5 L罐上進行工藝放大，采用分批補料方式探索其對殘?zhí)橇?、乙醇體積分數(shù)、酸度等理化指標的影響。從圖4可見，不同補料方式對葡萄果渣酵素發(fā)酵過程中糖的利用程度有明顯差別，一次性補料來看，在接入酵母菌和醋酸菌共酵18 h以內(nèi)，發(fā)酵過程中殘?zhí)橇恐饾u降低，直至48 h后殘?zhí)橇孔兓群苄?，該方式得到的活菌質(zhì)量濃度為4.88 g/100 mL；而通過分批補料方式來看，微生物對糖的利用率很大，由于發(fā)酵18～24 h酵母菌、醋酸菌對糖的大量需求，使糖不斷轉(zhuǎn)化為代謝產(chǎn)物，此時殘?zhí)橇亢艿?，對體系進行補料后，24～54 h內(nèi)接入的乳酸菌與前兩者共酵耗糖產(chǎn)生酶類、氨基酸等小分子，研究發(fā)現(xiàn)益生菌菌種之間有一定的互利共生作用，酵母菌和乳酸菌之間存在代謝產(chǎn)物互補機制，酵母菌產(chǎn)生易于吸收的中鏈脂肪酸甘露糖，從而促進乳酸菌的生長，乳酸菌代謝產(chǎn)物乳糖又為酵母菌提供生長條件，二者緊密聯(lián)系，互相取長補短。54～90 h對體系進行再次補料，60 h后殘?zhí)橇咳杂休^大變化，可推測有機酸的生成及分解芳香物質(zhì)，使果渣發(fā)酵液形成獨特香郁的風(fēng)味及口感，形成穩(wěn)定的平衡體系[34]。

圖 4 分批補料方式中殘?zhí)请S時間的變化Fig. 4 Change in residual sugar over time in fed-batch mode

采用分批補料方式對優(yōu)化后的發(fā)酵工藝進行5 L罐實驗，對發(fā)酵過程中酸度、乙醇體積分數(shù)、活菌數(shù)等參數(shù)進行分析測定，結(jié)果如圖5所示，可滴定酸度總體呈現(xiàn)兩個峰值，第1個是發(fā)酵30～48 h時從原來的0.9%達到2.3%，第2個峰值是60～72 h達到2.7%。乙醇體積分數(shù)的變化幅度較大，由于酵母菌在厭氧條件下發(fā)酵產(chǎn)生乙醇，因此前36 h乙醇體積分數(shù)不斷上升，從0.1%漲到1.35%，發(fā)酵達到36 h后，醋酸菌利用乙醇并進行代謝合成新物質(zhì)，不斷繁殖，乙醇體積分數(shù)開始慢慢減少，由于二次補料操作，本身是優(yōu)勢菌種的酵母菌由于對糖利用率加大，產(chǎn)乙醇速度加快，乙醇量堆積再次為醋酸菌提供營養(yǎng)原料，發(fā)酵結(jié)束時，乙醇體積分數(shù)穩(wěn)定在0.8%。發(fā)酵過程中，活菌數(shù)不斷上升，在24～60 h之間微生物大量繁殖與堆積，達到峰值，最大活菌質(zhì)量濃度為8.0 g/100 mL，該法得到的菌體生長量遠超過一次性投料方式。

2.5 葡萄果渣酵素的理化指標及功能成分分析

2.5.1 葡萄果渣酵素的理化指標測定結(jié)果

對pH值、可滴定酸度、還原糖、總酚的檢測結(jié)果見表5。葡萄果渣酵素的pH值隨著發(fā)酵時間延長，從初始pH 5.0逐漸降低，直至發(fā)酵結(jié)束時降低到pH 3.5，過程中由于微生物發(fā)酵產(chǎn)生乙酸、有機酸等代謝產(chǎn)物，使反應(yīng)體系走向成熟，超聲過后的酵素發(fā)酵周期縮短了近3 h，不僅加快了反應(yīng)進程，而且使本身富含酚類物質(zhì)的葡萄皮果渣經(jīng)過轉(zhuǎn)化與利用，總酚質(zhì)量濃度在5 d達到5.5 mg/mL，比未超聲組總酚含量有顯著提升。此外，在發(fā)酵前期，由于果蔬中本身富含葡萄糖、果糖，加之人工添加的葡萄糖，總糖含量較高，直至酵母菌發(fā)酵進入對數(shù)生長期，耗糖量大大增加；在發(fā)酵后期，乳酸菌及醋酸菌為優(yōu)勢菌群，耗糖量增加，同時乙酸含量增加，乙醇減少。

表 5 發(fā)酵前后理化指標對比Table 5 Comparison of physical and chemical indexes before and after fermentation

酵素產(chǎn)品抽檢嚴格按照三級采樣方案設(shè)定的指標，在n 個樣品中，允許全部樣品中相應(yīng)微生物指標小于或等于m值，允許有不大于c 個樣品的微生物指標在m和M之間，不允許有樣品中微生物指標檢驗值大于M值。微生物指標檢測結(jié)果見表6，采用平板計數(shù)法，大腸桿菌、霉菌菌落數(shù)均小于10 CFU/mL，沙門氏菌、金黃色葡萄球菌均未檢出。

表 6 葡萄果渣酵素的微生物指標檢測結(jié)果Table 6 Microbiological indicators of fermented grape pomace

2.5.2 葡萄果渣酵素功能成分的測定結(jié)果

酵母菌在厭氧條件下產(chǎn)生乙醇，乙醇又可促進醋酸菌生長；酵母菌和乳酸菌互相利用產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物及有機酸，從而提高酶活與活菌數(shù)，如表7所示，發(fā)酵結(jié)束時對數(shù)生長期酶活力最大，達到988 U/mL，比發(fā)酵前的SOD活力提高了1.19 倍。葡萄本身含有黃酮類化合物，是天然的抗氧化活性物質(zhì)，葡萄果皮中單聚體酚類物質(zhì)經(jīng)益生菌的轉(zhuǎn)化與利用，原花青素質(zhì)量濃度達到了3.78 mg/mL，比發(fā)酵前葡萄果渣中的原花青素含量提高了40%。乳酸菌能為酵母菌提供發(fā)酵碳源，如牛乳生產(chǎn)過程中添加的酵母菌和乳酸菌，酵母菌不能直接利用乳糖，而乳酸菌可將乳糖轉(zhuǎn)化為半乳糖和葡萄糖，因此乳酸菌也為酵母菌提供了碳源；乳酸菌還可通過丙酮酸鹽裂解酶將丙酮酸鹽轉(zhuǎn)化為甲酸鹽，或者將檸檬酸鹽分解為甲酸鹽、乙酸鹽、乳酸鹽、雙乙酰、乙酰甲基原醇、2,3-丁二醇等芳香物質(zhì)，為發(fā)酵體系增加風(fēng)味成分。有研究推測酵母菌與乳酸菌共生體系中存在一種適應(yīng)反應(yīng)機制，這種機制一旦被激活，酵母菌會產(chǎn)生“交叉保護”的現(xiàn)象，促使酵母菌對外界抵抗能力增強，如高滲透壓、高溫、較低pH值等環(huán)境。隨著發(fā)酵時間的推進，發(fā)酵體系中pH值逐漸降低，而酵母菌活力并沒有因此走向自溶或衰亡，而是與乳酸菌互相利用、達到穩(wěn)定共生的平衡體系[35]。

表 7 發(fā)酵前后功能成分指標對比Table 7 Comparison of functional components before and after fermentation

有機酸是發(fā)酵過程中改變風(fēng)味的重要考察因素，研究表明，有機酸種類會隨著多菌種共酵代謝底物的變化而發(fā)生改變，果蔬發(fā)酵過程中會有少量丙酮酸、富馬酸、莽草酸等有機酸生成，其中莽草酸就是多種有機酸代謝過程中的重要產(chǎn)物。蘋果酸與乳酸菌進行的二次發(fā)酵過程中，L-蘋果酸在乳酸菌的蘋果酸-乳酸酶及Mn2+的催化下轉(zhuǎn)變成L-乳酸和CO2的過程。乳酸菌經(jīng)三羧酸循環(huán)代謝出的檸檬酸在發(fā)酵過程產(chǎn)生獨特香氣的雙乙酰；乳酸菌進而將檸檬酸分解成為乙酸和丙酮酸等，乙酸是短鏈脂肪酸，可以有效改善人體腸道環(huán)境、起到調(diào)節(jié)腸道菌群的作用。綜上所述，有機酸種類越是豐富，得到的酵素風(fēng)味越是獨特，營養(yǎng)越豐富。如圖6所示，10 min內(nèi)4 種有機酸全部被洗脫下來，經(jīng)測定得到葡萄果渣酵素中有機酸種類主要為酒石酸、蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸，對比有機酸標準品圖譜可見，4 種有機酸含量分別為：檸檬酸＞琥珀酸＞酒石酸＞蘋果酸，保留時間分別為5.234、4.201、3.470、2.445 min，線性關(guān)系良好，R2均大于0.999 0。酵母菌、乳酸菌、醋酸菌混合發(fā)酵過程產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物及有機酸，葡萄果渣中大量的多酚類物質(zhì)，如兒茶素類沒食子酸酯、原花青素類等活性成分，發(fā)酵過程中散發(fā)葡萄特有的醇、酚、萜類香氣，不僅提高酶活與活菌量，而且融合隨發(fā)酵時間的延長，葡萄果渣酵素香氣獨特且綿密。得到的葡萄果渣酵素上清液色澤透明亮麗，香氣綿柔，口感、滋味評價均較高。

圖 6 有機酸標準品（a）和酵素樣品（b）中有機酸的高效液相色譜分離圖譜Fig. 6 HPLC for a mixture of standard organic acids and organic acids from fermented grape pomace

2.5.3 清除ABTS陽離子自由基的能力

圖 7 酵素樣品（a）和Trolox標準品（b）清除ABTS陽離子自由基的能力Fig. 7 ABTS radical scavenging capacity of Trolox standard and fermented grape pomace

在0～50 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍，Trolox對自由基清除率有良好的線性關(guān)系，得到的標準曲線方程為：Y=2.010 0X-3.480 0，R2=0.993 6。

半抑制濃度即IC50，通常IC50值越小，代表酵素的抗氧化能力越強。ABTS經(jīng)氧化后生成相對穩(wěn)定的藍綠色的ABTS水溶性自由基，酵素中的抗氧化劑與ABTS陽離子自由基反應(yīng)后使其溶液褪色，特征吸光度降低，溶液褪色越明顯則表明所檢測物質(zhì)的總抗氧化能力越強。自由基產(chǎn)生過多或清除過慢，會對生物體產(chǎn)生一系列損害，加速機體的衰老過程并誘發(fā)各種疾病。如圖7所示，復(fù)合酵素對ABTS陽離子自由基有較強的清除能力，計算得到葡萄果渣酵素的ABTS陽離子自由基清除能力為（44.5±2.5）μg/g。該酵素對水溶性ABTS陽離子自由基的抑制率明顯高于Trolox所對應(yīng)的抑制率。

3 結(jié) 論

本研究以廢棄葡萄果渣為原料，經(jīng)酵母菌、雙歧桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌、醋酸菌等多菌種共酵得到富含原花青素、SOD的葡萄果渣酵素。在確定最佳超聲條件的基礎(chǔ)上，考察初始pH值、糖添加量、接種量、超聲時間對發(fā)酵過程中SOD活力及活菌質(zhì)量濃度的影響，進一步對發(fā)酵工藝條件進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗，得到最佳發(fā)酵工藝條件為：初始pH 5.0、糖添加量8%、活菌接種量12%、超聲時間60 min。將該最佳發(fā)酵條件應(yīng)用于5 L發(fā)酵罐的工藝探索，得到周期為72 h的分批補料方式下，葡萄果渣酵素的理化指標、微生物及功能成分指標，總酚質(zhì)量濃度達到5.5 mg/mL，發(fā)酵結(jié)束時pH值為3.5，SOD活力達到988 U/mL，比發(fā)酵前的SOD活力提高了1.19 倍；葡萄本身含有黃酮類化合物，是天然的抗氧化活性物質(zhì)，葡萄果皮中單聚體酚類物質(zhì)經(jīng)益生菌的轉(zhuǎn)化與利用，原花青素含量達到了3.78 mg/mL，比發(fā)酵前葡萄果渣中的原花青素含量提高了40%；微生物指標如霉菌、大腸桿菌等致病菌都未檢出，活菌數(shù)達到8.5 g/100 mL；采用總抗氧化能力試劑盒測定得到該酵素對ABTS陽離子自由基清除能力為（44.5±2.5）μg/g。此外，經(jīng)測定得到葡萄果渣酵素中有機酸種類主要為酒石酸、蘋果酸、琥珀酸、檸檬酸，發(fā)酵過程中散發(fā)葡萄特有的醇、酚、萜類香氣，葡萄果渣酵素香氣獨特且綿密，上清液色澤透明亮麗，香氣綿柔，口感、滋味評價較高。