孫如玉 何志成 江靜 蔣燕 胡秀娟 王振振 吳青杰 李群超 胡賢偉 姜楠 劉超

（1安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 安徽 合肥 230032）

（2安徽醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 安徽 合肥 230601）

人胰腺癌細(xì)胞系中，源自胰腺癌導(dǎo)管細(xì)胞的PANC-1細(xì)胞被廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究中。本課題組以前PANC-1細(xì)胞培養(yǎng)采用的是傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)方法[1]，培養(yǎng)細(xì)胞所用的培養(yǎng)液為90%DMEM/HIGH Glucose (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) 加上10% 胎牛血清（BI-FBS）和1%雙抗（青霉素和鏈霉素混合液）[2]；根據(jù)實(shí)驗(yàn)中具體操作步驟，對PANC-1細(xì)胞的培養(yǎng)方法進(jìn)行改良。改良后的方法，簡化了步驟，減少污染機(jī)率。

1.資料與方法

1.1 細(xì)胞株

人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1細(xì)胞；購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫（上海）。

1.2 主要試劑

DMEM/HIGH Glucose(1X）培養(yǎng)基（Hyclone，美國）。

1.3 主要儀器

5%CO2培養(yǎng)箱（Thermo美國），醫(yī)用凈化工作臺（蘇州）。

2.改良的PANC-1細(xì)胞培養(yǎng)方法

2.1 PANC-1細(xì)胞的復(fù)蘇

1）準(zhǔn)備器械和試劑，常規(guī)消毒和復(fù)蘇細(xì)胞；在標(biāo)記好的培養(yǎng)皿加入適量的培養(yǎng)液；

2）將細(xì)胞懸液吸出直接加入培養(yǎng)皿，充分震蕩混勻；

3）鏡下觀察細(xì)胞密度及分布后，置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，24小時后換液。

2.2 PANC-1細(xì)胞的傳代

1）準(zhǔn)備器械和試劑，常規(guī)消毒；

2）鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)和匯合度，一般于匯合度80%左右進(jìn)行傳代；

3）常規(guī)洗滌、胰酶消化細(xì)胞；

4）利用消化的間隙，在新培養(yǎng)皿中加入培養(yǎng)液，作好標(biāo)記；

5）鏡下觀察細(xì)胞脫落和離散；

6）將原培養(yǎng)皿內(nèi)細(xì)胞懸液，平均分配于新培養(yǎng)皿中；震蕩混勻后放37℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育。

3.結(jié)果

從2016年8月-2017年9月，本課題組共復(fù)蘇PANC-1細(xì)胞11次，傳代19次，見圖。

圖 傳統(tǒng)方法和改良方法對比圖

細(xì)胞傳統(tǒng)復(fù)蘇到傳代和改良復(fù)蘇到傳代平均用時差異顯著（P＜0.05）；傳統(tǒng)細(xì)胞傳代周期和改良細(xì)胞傳代周期間差異不顯著。

4.討論

本課題組人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1細(xì)胞的培養(yǎng)傳統(tǒng)方法主要參考賈連群，雷萍主編的現(xiàn)代基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)理論與技術(shù)進(jìn)展中細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)[1]和賽默飛世爾科技（ThermoFisher Scientific）貼壁細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)[3]。

細(xì)胞凍存液由90%胎牛血清（BI-FBS）和10%二甲亞砜(dimethyl sulPhoxide，DMSO)配制[4]。DMSO作為常用的低溫冷凍保護(hù)劑，部分學(xué)者認(rèn)為對大多數(shù)細(xì)胞無毒性[5]。改良細(xì)胞復(fù)蘇方法中，是把處于凍存液中的細(xì)胞懸浮液直接加入到培養(yǎng)皿中，沒有離心去除DMSO。

改良方法優(yōu)點(diǎn)：（1）細(xì)胞傳代過程中不使用離心機(jī)，減少細(xì)胞損失和細(xì)胞污染的機(jī)會；（2）簡化細(xì)胞傳代步驟，特別適用于新進(jìn)人員；（3）可以比較快速增殖細(xì)胞。

改良方法缺點(diǎn)：細(xì)胞傳代過程中，細(xì)胞懸液的分配過程中液量可能會有偏差。解決方法，正常加胰酶消化，加等量的培養(yǎng)液中和并吹打均勻，細(xì)胞懸液分配前，要注意一下具體的液量，盡量分配。

綜上所述，基于傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)上的改良方法，可以用于人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1細(xì)胞的培養(yǎng)，也為其它細(xì)胞培養(yǎng)方法的改良提供參考。