魏芬芬,王文娟,賀青華,張 波

(北京聯(lián)合大學(xué)健康與環(huán)境學(xué)院,中國北京100191)

過量飲酒仍然是當(dāng)今世界一個(gè)嚴(yán)重威脅人類健康的問題,酒精及其代謝產(chǎn)物能夠引起脂質(zhì)代謝紊亂、氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡等,對(duì)多種器官造成損傷,如胃、肝臟和腎臟等[1～2]。Yuan 等[3]的研究證實(shí),腎臟中同樣存在代謝乙醇的乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶,同樣可實(shí)現(xiàn)對(duì)乙醇的代謝,其代謝途徑和方式可能與肝臟相似,并最終將代謝產(chǎn)物排出體內(nèi)。因此,可以推斷,腎臟在代謝和排泄酒精時(shí),可能也會(huì)受到一定的氧化損傷和發(fā)生炎癥反應(yīng),從而對(duì)腎臟細(xì)胞造成一定損傷[4～6]。目前國內(nèi)外對(duì)酒精性肝損傷已存在大量實(shí)驗(yàn)研究,而酒精對(duì)腎臟的損傷研究則相對(duì)較少。

雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)是一種單細(xì)胞綠藻,因其在孢子形成過程中會(huì)積累大量的類胡蘿卜素,主要為蝦青素,因此被稱為天然蝦青素的“濃縮品”,而蝦青素也是雨生紅球藻主要的活性物質(zhì)[7～9]。雨生紅球藻被認(rèn)為是蝦青素最好的來源之一,在2009年被列為新資源食品,因此關(guān)于雨生紅球藻的活性功能研究也受到廣泛關(guān)注。黃浦俊等[10]比較了破壁與未破壁雨生紅球藻粉的抗氧化能力,發(fā)現(xiàn)無論是破壁還是未破壁的雨生紅球藻粉都具有較強(qiáng)的抗氧化能力,但破壁雨生紅球藻粉的抗氧化能力更強(qiáng)。劉穎芬等[11]發(fā)現(xiàn)雨生紅球藻來源的蝦青素具有增強(qiáng)小鼠免疫力的功能。李勇超等[12]研究發(fā)現(xiàn)雨生紅球藻破壁孢子粉能夠緩解小鼠高血糖模型的氧化損傷和炎癥反應(yīng),提高小鼠肝、腎的抗氧化能力。本研究擬通過建立酒精性損傷小鼠模型,研究酒精對(duì)小鼠腎臟的損傷作用以及雨生紅球藻破壁孢子粉對(duì)酒精性損傷腎臟的保護(hù)作用,旨在為雨生紅球藻的開發(fā)利用提供一定的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

60只SPF級(jí)雄性昆明小鼠(維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)的體質(zhì)量為(25±2)g,動(dòng)物許可證編號(hào):SCXK(京)2012-0001。實(shí)驗(yàn)小鼠在北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院功能食品檢測中心的SPF級(jí)屏障系統(tǒng)中飼養(yǎng),動(dòng)物方許可證號(hào):SYXK(京)2012-0031。飼養(yǎng)條件如下:溫度控制在(20±2)℃,空氣相對(duì)濕度50%～70%,光照周期為14 h光照(6:00～20:00)/10 h黑暗,自由取食、飲水。

1.1.2 主要儀器與試劑

雨生紅球藻破壁孢子粉(杭州鑫偉低碳技術(shù)研發(fā)有限公司);超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)(南京建成生物工程研究所);小鼠腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)酶聯(lián)反應(yīng)測定試劑盒(上海滬尚生物科技有限公司)。UV-2450紫外可見分光光度計(jì)(日本津島儀器有限公司);5804R型低溫高速離心機(jī)(德國Eppendorf股份公司);7180型全自動(dòng)生化分析儀(日本日立高新技術(shù)公司);電動(dòng)勻漿器(常州朗越儀器制造有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠酒精性損傷模型的建立

60只昆明小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后,將其隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、雨生紅球藻破壁孢子粉低(100 mg/kg)、中(200 mg/kg)、高(400 mg/kg)劑量組,共5組,每組12只。雨生紅球藻破壁孢子粉各劑量按照新資源食品對(duì)雨生紅球藻的人體推薦量(0.8 g/d)進(jìn)行設(shè)置,受試物采用雙蒸水進(jìn)行配制。對(duì)照組與模型組小鼠初始體質(zhì)量無明顯差異,對(duì)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果無影響。各劑量組每天經(jīng)口灌胃受試物(20 mL/kg),正常對(duì)照組和模型組則給予等體積雙蒸水。從實(shí)驗(yàn)第8天開始,各劑量組先給予受試物,4 h后各劑量組和模型組再分別給予50%酒精,正常對(duì)照組則給與等體積雙蒸水,連續(xù)7 d。本次實(shí)驗(yàn)所使用的造模方法已經(jīng)過多次預(yù)實(shí)驗(yàn),預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:連續(xù)灌胃小鼠50%酒精一周,造模效果較好,既能保證造模的成功,也能保證小鼠死亡概率最小,因此我們?cè)谡綄?shí)驗(yàn)中采用了此種造模方式。

1.2.2 血清及臟器的采集與制備

末次灌胃后,各組小鼠斷食不斷水16 h。隨后稱重并摘眼球取血。血液靜置30 min后,于4 000 r/min室溫離心15 min,分離血清置于1.5 mL離心管中,4℃保存。同時(shí),對(duì)頸椎脫臼處死后的小鼠進(jìn)行解剖,取腎臟,并迅速用預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)為0.9%的生理鹽水沖凈臟器表面浮血,濾紙拭干,稱重,迅速放于液氮中,最后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱待下一步實(shí)驗(yàn)使用。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腎臟指數(shù)的計(jì)算

解剖取得小鼠兩顆腎臟后,迅速用預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)為0.9%的生理鹽水沖凈表面浮血,濾紙拭干,稱重。按照如下公式計(jì)算實(shí)驗(yàn)小鼠的腎臟指數(shù):腎臟指數(shù)(%)=小鼠腎臟質(zhì)量(g)/小鼠體質(zhì)量(g)×100%。

（3）表面活性劑的吸附濃度隨著表面活性劑濃度的增加而逐漸增大。吸附濃度的增加使得采出程度和含水率降幅都有十分明顯的增加，表面活性劑吸附作用對(duì)驅(qū)油效果影響較大，在無堿二元驅(qū)過程中應(yīng)該重點(diǎn)考慮表面活性劑的吸附作用。

1.2.4 血清生化指標(biāo)的檢測

采用全自動(dòng)生化分析儀測定血清尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)以及肌酐(creatinine,CREA)的濃度。

1.2.5 腎臟組織氧化指標(biāo)檢測

將腎臟從-80℃冰箱取出,與0.9%生理鹽水按照1∶9的比例混合,進(jìn)行組織勻漿,勻漿后成為10%的腎臟勻漿液,待用。取勻漿好的10%腎臟組織勻漿液,分別測定腎臟組織中SOD的活性以及GSH和MDA的含量,檢測過程嚴(yán)格按照南京建成生物工程研究所相關(guān)試劑盒說明書進(jìn)行操作。SOD檢測為每mg蛋白質(zhì)中SOD的活力,單位為U/(mg prot),GSH檢測為每mg蛋白質(zhì)中GSH含量,單位為mg GSH/(mg prot),MDA檢測為每mg蛋白質(zhì)中MDA的含量,單位為nmol/(mg prot)。

1.2.6 炎性因子檢測

取上述勻漿好的10%的腎臟組織勻漿液,用ELISA試劑盒測定腎臟組織中TNF-α和IL-1β的濃度。檢測操作嚴(yán)格按照上海滬尚生物科技有限公司相關(guān)試劑盒說明書進(jìn)行。

采用SPSS 22軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析。圖片處理采用OriginPro 2017軟件。

2 結(jié)果

2.1 雨生紅球藻破壁孢子粉對(duì)酒精性損傷小鼠體質(zhì)量及腎臟指數(shù)的影響

為了檢驗(yàn)酒精對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腎臟的損傷程度,我們先計(jì)算了動(dòng)物的腎臟指數(shù)。由表1可知,與正常對(duì)照組相比,模型組體質(zhì)量顯著下降(P＜0.01),腎臟質(zhì)量顯著增加(P＜0.05),腎臟指數(shù)顯著上升(P＜0.01),表明小鼠在經(jīng)大量酒精連續(xù)刺激后,食欲受到影響,基礎(chǔ)代謝率可能降低,從而導(dǎo)致體質(zhì)量下降,也正是因?yàn)槟I臟受到酒精的刺激,可能發(fā)生了腫脹或者炎癥,導(dǎo)致腎臟質(zhì)量增加,腎臟指數(shù)增加。與模型組相比,各劑量組小鼠的體質(zhì)量增加,腎臟指數(shù)下降,但在本實(shí)驗(yàn)期間還未表現(xiàn)出顯著性差異,表明雨生紅球藻對(duì)酒精性的腎臟損傷有一定保護(hù),但這種保護(hù)作用可能還需要更長的周期才能表現(xiàn)出顯著性差異。

2.2 雨生紅球藻破壁孢子粉對(duì)酒精性損傷小鼠血清BUN以及CREA的影響

為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)腎臟功能,我們檢測了血清中BUN以及CREA的濃度。結(jié)果如表2所示,與正常對(duì)照組相比,模型組小鼠血清BUN和CREA的濃度均顯著升高(P＜0.01),表明模型組小鼠在酒精刺激下,腎臟功能受到一定損傷,從而導(dǎo)致血清中BUN和CREA濃度的異常。與模型組相比,各劑量組BUN和CREA的濃度均有所下降,中劑量組和高劑量組的BUN濃度顯著降低(P＜0.05),CREA濃度則在低劑量組和高劑量組中均顯著降低(P＜0.05),表明在雨生紅球藻的干預(yù)下,腎臟損傷程度得到一定的緩解。

2.3 雨生紅球藻破壁孢子粉對(duì)酒精性損傷小鼠腎臟SOD、GSH、MDA的影響

為了探究酒精對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠腎臟的氧化損傷情況,我們檢測了腎臟勻漿液中SOD活性以及GSH、MDA含量的變化。由表3可知,與正常對(duì)照組相比,模型組小鼠的SOD活性、GSH含量均顯著降低(P＜0.01),同時(shí)MDA含量顯著升高(P＜0.01),表明模型組小鼠經(jīng)酒精刺激后,腎臟發(fā)生了氧化損傷,導(dǎo)致抗氧化酶活性及含量明顯降低,同時(shí)脂質(zhì)過氧化物增多。與模型組相比,各劑量組的SOD活性和GSH含量顯著升高(P＜0.05),而MDA含量則顯著下降(P＜0.05),表明雨生紅球藻可以提高酒精性損傷小鼠腎臟的抗氧化能力,減少脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生。

表1 雨生紅球藻破壁孢子粉對(duì)小鼠體質(zhì)量及腎臟指數(shù)的影響Table 1 Effects of H.pluvialis on weight and kidney index of mice

表2 雨生紅球藻破壁孢子粉對(duì)小鼠血清BUN以及CREA的影響Table 2 Effects of H.pluvialis on BUN and CREA in sera of mice

2.4 雨生紅球藻破壁孢子粉對(duì)酒精性損傷小鼠腎臟IL-1β和TNF-α的影響

進(jìn)一步對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠的炎癥反應(yīng)進(jìn)行研究,檢測結(jié)果見表4。與正常對(duì)照組相比,模型組小鼠的IL-1β、TNF-α 含量均顯著升高(P＜0.01),表明模型組小鼠經(jīng)酒精刺激后,腎臟發(fā)生了炎癥反應(yīng),并導(dǎo)致炎性因子質(zhì)量濃度增加。與模型組相比,各劑量組小鼠的IL-1β、TNF-α含量均呈下降趨勢(shì),其中,中劑量組的IL-1β顯著下降(P＜0.05),中劑量組和高劑量組的TNF-α均極顯著降低(P＜0.01),表明劑量組小鼠在雨生紅球藻的干預(yù)下,炎癥損傷減輕。

3 討論

雨生紅球藻具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)以及抗氧化等活性功能[12～13]。本課題組之前研究表明,雨生紅球藻破壁孢子粉對(duì)酒精性肝損傷小鼠具有保護(hù)作用[14]。酒精對(duì)臟器的損害主要是由于其代謝產(chǎn)物乙醛引起機(jī)體的代謝紊亂及炎癥反應(yīng)[15～16],肝臟則是酒精危害最大的一個(gè)器官。有研究表明,腎臟也同時(shí)負(fù)責(zé)10%的酒精代謝與排泄[3]。魯政等[6]的研究提示酒精能夠顯著引起腎臟的氧化損傷。本課題組通過連續(xù)酒精灌胃小鼠7 d,建立酒精性損傷模型,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,模型組小鼠肝臟出現(xiàn)病理改變,血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)水平升高,提示建模成功[14]。

表4 雨生紅球藻破壁孢子粉對(duì)小鼠腎臟IL-1β和TNF-α的影響Table 4 Effects of H.pluvialis on IL-1β and TNF-α in kidneys of mice

表3 雨生紅球藻破壁孢子粉對(duì)小鼠腎臟SOD、GSH、MDA的影響Table 3 Effects of H.pluvialis on SOD,GSH and MDA in kidneys of mice

臟器指數(shù)是評(píng)估臟器受損的一個(gè)重要指標(biāo),當(dāng)臟器指數(shù)升高時(shí),說明臟器受損,可能發(fā)生腫脹或者炎癥反應(yīng)[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)小鼠在連續(xù)灌胃50%酒精7 d后,與正常對(duì)照組相比,腎臟指數(shù)升高了33.33%,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01,表1),表明模型組小鼠腎臟受到酒精刺激,發(fā)生了損傷。而各劑量組與模型組相比,腎臟指數(shù)均呈下降趨勢(shì),但在本次實(shí)驗(yàn)中未表現(xiàn)出顯著性差異(表1),提示雨生紅球藻雖對(duì)腎臟有一定保護(hù)作用,但是這一作用的發(fā)生需要一定的時(shí)間才能具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。血清尿素氮(BUN)和肌酐(CREA)是臨床上評(píng)價(jià)腎功能的重要指標(biāo),當(dāng)血清中BUN和CREA濃度升高時(shí),則表明腎功能可能出現(xiàn)異常[18]。當(dāng)機(jī)體攝入過量酒精時(shí),10%左右的酒精在腎臟中進(jìn)行代謝和排泄,從而產(chǎn)生自由基,發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和炎癥反應(yīng)[6]。本實(shí)驗(yàn)中,模型組小鼠的BUN和CREA濃度顯著高于正常對(duì)照組(表2),提示酒精可能造成了小鼠的腎功能損傷,如腎小管的重吸收能力下降,腎小球?yàn)V過功能降低[19]。這與王楠等[20]的研究結(jié)果一致,即酒精可以對(duì)腎功能造成損傷。而各劑量組與模型組相比,血清中BUN和CREA濃度均下降(表2)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,雨生紅球藻破壁孢子粉能夠在一定程度上減輕酒精對(duì)小鼠腎功能的損害作用。SOD是機(jī)體內(nèi)清除自由基的重要物質(zhì),其在體內(nèi)的水平可以作為細(xì)胞衰老和死亡的直觀指示[21]。GSH能直接催化脂質(zhì)還原和過氧化氫,減輕自由基帶來的損傷,是細(xì)胞抵抗氧化損害的主要物質(zhì)[22]。MDA作為脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物,是衡量機(jī)體脂質(zhì)過氧化程度的重要指標(biāo)[23]。在本實(shí)驗(yàn)中,與對(duì)照組相比,模型組小鼠SOD和GSH顯著降低,且MDA含量顯著升高(表3),表明酒精的長期攝入刺激腎臟產(chǎn)生的自由基增多,造成了氧化損傷,使機(jī)體抗氧化能力降低。與模型組相比,各劑量組的SOD與GSH均顯著上升,MDA則顯著下降,表明雨生紅球藻破壁孢子粉能夠增強(qiáng)小鼠的抗氧化能力,減少脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生,降低自由基對(duì)機(jī)體的攻擊。王潮崗等[24]的實(shí)驗(yàn)表明雨生紅球藻具有良好的抗氧化能力,對(duì)清除自由基有很好的效果,這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。酒精以及代謝產(chǎn)物刺激也能導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng),使得一些致炎因子如IL-1β和TNF-α的濃度升高,對(duì)機(jī)體造成炎癥損傷[25]。在本實(shí)驗(yàn)中,與正常對(duì)照組相比,模型組小鼠的IL-1β和TNF-α均顯著升高(表4),表明由于酒精的刺激,小鼠體內(nèi)發(fā)生了炎癥損傷,產(chǎn)生了致炎因子。而各劑量組與模型組相比,IL-1β和TNF-α均呈下降趨勢(shì)(表4),表明雨生紅球藻破壁孢子粉在一定程度上能減輕小鼠的炎癥反應(yīng)。

4 結(jié)論

在本實(shí)驗(yàn)條件下,雨生紅球藻破壁孢子粉對(duì)酒精性損傷小鼠的腎臟損傷具有良好的保護(hù)作用,其可能是通過增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力、減少自由基的產(chǎn)生、減少炎癥反應(yīng)等方面發(fā)揮作用,但具體作用機(jī)制還有待下一步研究。