周佳麗,吳艷陽,羅玉霜,袁玉菊,劉明俊,劉東波,4,5*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院,中國(guó)湖南長(zhǎng)沙410128;2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,中國(guó)湖南長(zhǎng)沙410128;3.國(guó)家中醫(yī)藥管理局亞健康干預(yù)技術(shù)實(shí)驗(yàn)室,中國(guó)湖南長(zhǎng)沙410128;4.湖南省作物種質(zhì)創(chuàng)新與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國(guó)湖南長(zhǎng)沙410128;5.湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心,中國(guó)湖南長(zhǎng)沙410128;6.湖南省馬王堆醫(yī)院,中國(guó)湖南長(zhǎng)沙410128)

糖尿病是一種全球性的、以持續(xù)高血糖癥為特征的代謝紊亂疾病。血糖異常升高的原因可能是胰島素自身分泌缺陷(1型糖尿病,T1D),或肝臟等效應(yīng)器官產(chǎn)生胰島素抵抗,或胰島素分泌不足(2型糖尿病,T2D)[1]。在T1D和T2D的情況下,持續(xù)高濃度的葡萄糖會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力的失衡,導(dǎo)致亞硝基介導(dǎo)的氧化應(yīng)激和損傷。氧化和糖化蛋白的積累是糖尿病相關(guān)的常見蛋白質(zhì)修飾,其部分原因可能是自噬缺陷[2]。因此,越來越多的研究認(rèn)為相關(guān)細(xì)胞自噬可能有利于糖尿病的治療。β細(xì)胞是人體內(nèi)唯一能夠分泌胰島素的功能細(xì)胞,研究β細(xì)胞的自噬對(duì)于糖尿病的治療與控制具有重大意義。相關(guān)研究報(bào)道,β細(xì)胞自噬可通過調(diào)控胰島素顆粒的降解來影響細(xì)胞胰島素的釋放[3～4]。

自噬是真核細(xì)胞內(nèi)一種高度保守的再循環(huán)過程,它通過降解細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)和大分子物質(zhì),對(duì)分解產(chǎn)物進(jìn)行再利用。自噬在細(xì)胞存活和功能維持中起著重要作用[5]。細(xì)胞自噬由多個(gè)步驟組成,其中包括:1)吞噬泡的形成;2)自噬體的形成;3)自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體;4)自噬溶酶體的降解[6]。自噬流是這些步驟在細(xì)胞內(nèi)連續(xù)出現(xiàn)的動(dòng)態(tài)過程,自噬流的活化或受阻往往會(huì)形成不同的生物學(xué)效應(yīng)[7]。人們?cè)谘芯窟^程中逐漸發(fā)現(xiàn),自噬流受阻可能誘發(fā)多種疾病[7]。微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein light chain 3,LC3)是自噬體膜標(biāo)志物,一般散在分布于細(xì)胞質(zhì)[8]。在自噬過程中,胞質(zhì)形式的LC3(LC3-Ⅰ)與磷脂酰乙醇胺結(jié)合形成LC3-磷脂酰乙醇胺結(jié)合物(LC3-Ⅱ)[9]。紅色熒光點(diǎn)-綠色熒光點(diǎn)-LC3(red fluorescence point-green fluorescence point-LC3,RFP-GFP-LC3)融合蛋白是一種方便的自噬熒光蛋白標(biāo)記物。在自噬發(fā)生初期,胞漿型LC3轉(zhuǎn)變?yōu)槟ば蚅C3,在熒光顯微鏡下可觀察到紅色/綠色共定位的點(diǎn)狀聚集。自噬后期,溶酶體與自噬體融合形成自噬溶酶體,細(xì)胞環(huán)境pH發(fā)生變化。當(dāng)環(huán)境pH＜5時(shí),GFP熒光敏感發(fā)生淬滅,只能檢測(cè)到紅色熒光點(diǎn)狀聚集[10]。因此可以通過GFP熒光點(diǎn)與RFP熒光點(diǎn)比例來評(píng)價(jià)自噬流進(jìn)程。

目前可通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法檢測(cè)自噬流,通過在細(xì)胞中瞬時(shí)高表達(dá)RFP-GFP-LC3質(zhì)粒來進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)[11],但是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法具有穩(wěn)定性差、轉(zhuǎn)染效率低等缺點(diǎn)。為解決這一問題,我們通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方法構(gòu)建了能夠穩(wěn)定表達(dá)RFPGFP-LC3質(zhì)粒的大鼠胰島β細(xì)胞株,這將有利于研究自噬在胰島β細(xì)胞中的作用,同時(shí)也可將其用于治療糖尿病藥物的初步篩選。

1 材料與方法

1.1 材料

慢病毒包裝系統(tǒng)(該病毒系統(tǒng)包括VSVG質(zhì)粒、Δ8.9 質(zhì)粒);293FT 細(xì)胞、RIN-m5f細(xì)胞株(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)亞健康實(shí)驗(yàn)室凍存);DH5α感受態(tài)細(xì)胞(北京全式金生物技術(shù)有限公司)。DMEM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(Biological Industries公司,以色列);Trypsin-EDTA細(xì)胞消化液(北京全式金生物技術(shù)有限公司);LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑(Thermo公司,美國(guó));G418試劑(Sigma公司,美國(guó));防熒光淬滅封片劑(SouthernBiotech公司,美國(guó));SQSTM1/P62(sequestosome 1)抗體、S6K(ribosomal protein S6 kinase)抗體、phospho-S6K抗體(CST公司,美國(guó));GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)抗體[亞太恒信生物科技(北京)有限公司];6×loading buffer(北京全式金生物技術(shù)有限公司)。激光共聚焦顯微鏡(Zeiss LSM710);倒置熒光顯微鏡(Leica DMI8)。

1.2 慢病毒載體構(gòu)建

慢病毒載體構(gòu)建由上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司完成,構(gòu)建過程主要參照文獻(xiàn)[12]的方法,簡(jiǎn)要概述如下:用PCR從PCMV-RFP-GFP-LC3質(zhì)粒中擴(kuò)增RFP-GFP-LC3片段;擴(kuò)增產(chǎn)物10 g/L瓊脂轉(zhuǎn)化,篩選出重組質(zhì)粒,得到RFP-GFP-LC3-GV374質(zhì)粒。經(jīng)過測(cè)序比對(duì)確認(rèn)慢病毒載體構(gòu)建成功(圖1),提取重組質(zhì)粒,純化溶解,-20℃保存。

1.3 慢病毒的包裝制備

用含有10%FBS的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)293FT細(xì)胞,細(xì)胞狀態(tài)良好。待細(xì)胞匯合至90%左右,將其用含0.25%EDTA的胰酶消化,種入6孔板中,培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞匯合度達(dá)50%左右時(shí),進(jìn)行換液處理并按照轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM3000的說明書進(jìn)行操作。即將VSVG質(zhì)粒、Δ8.9質(zhì)粒、RFP-GFP-LC3質(zhì)粒進(jìn)行質(zhì)量濃度1∶1∶1的共轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染完成后將細(xì)胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。到達(dá)時(shí)間后,于倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率,并收集細(xì)胞上清液,3 000 r/min離心10 min,去除殘余的293FT細(xì)胞雜質(zhì),即得到已包裝好RFP-GFP-LC3質(zhì)粒的慢病毒顆粒。

圖1 LC3自噬流檢測(cè)慢病毒載體圖譜Fig.1 The vector of lentivirus for detecting LC3

1.4 穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選

轉(zhuǎn)染前一天,將RIN-m5f用0.25%EDTA胰酶進(jìn)行消化,種入6孔板中。用含10%FBS的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后,將收集的慢病毒顆粒加入細(xì)胞培養(yǎng)液中,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行換液處理。24 h后,在倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況,并更換新的培養(yǎng)基。感染約48 h后,加入嘌呤霉素進(jìn)行篩選培養(yǎng)。預(yù)實(shí)驗(yàn)提示RIN-m5f細(xì)胞的嘌呤霉素最佳篩選質(zhì)量濃度為6 μg/mL。篩選培養(yǎng)約7 d后,未經(jīng)感染的對(duì)照組細(xì)胞全部死亡,感染組有陽性克隆細(xì)胞生長(zhǎng),熒光顯微鏡下可見RFP熒光與GFP熒光。用0.25%EDTA胰蛋白酶消化陽性克隆細(xì)胞,轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)2 d,隨后收集感染病毒的穩(wěn)定細(xì)胞株,用細(xì)胞免疫熒光的方法檢測(cè)RFP-GFP-LC3的表達(dá)。

1.5 自噬的誘導(dǎo)及自噬流的檢測(cè)

構(gòu)建成功的細(xì)胞以1×105的數(shù)目種入24孔板中,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞匯合至70%左右,對(duì)照組使用含10%FBS的1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),饑餓組加入無血清1640培養(yǎng)基饑餓2 h,在饑餓+氯喹(chloroquine,CQ)組,使用10 μmol/L的氯喹與饑餓共處理2 h。到達(dá)預(yù)定處理時(shí)間后,用PBS清洗兩遍,將玻片夾出反向固定于載玻片上,于激光共聚焦下拍攝RFPGFP-LC3熒光點(diǎn)。

1.6 Western-blot分析

構(gòu)建成功的細(xì)胞以1×105的數(shù)目種入24孔板中,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞匯合至95%左右,加入無血清1640培養(yǎng)基饑餓處理2 h,在饑餓+CQ組,使用10 μmol/L的氯喹與饑餓共處理2 h。到達(dá)預(yù)定時(shí)間后,用PBS洗滌細(xì)胞,每孔加入200 μL 2%SDS細(xì)胞裂解液,迅速將細(xì)胞刮下收集。每管加入40 μL的6×loading buffer,煮至蛋白質(zhì)變性,蛋白質(zhì)可置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?2%SDS-PAGE電泳后,電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,封閉液室溫封閉1 h,按照1∶1 000的稀釋比例,分別孵育 P62、S6K、P-S6K、GAPDH一抗,4℃過夜,加入對(duì)應(yīng)二抗稀釋液(1∶5 000),室溫孵育1 h,ECL發(fā)光顯影。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 穩(wěn)定細(xì)胞系的篩選

慢病毒轉(zhuǎn)染48 h后,用嘌呤霉素對(duì)已轉(zhuǎn)染細(xì)胞株進(jìn)行篩選。大約7 d后,經(jīng)過篩選的細(xì)胞如圖2所示,在熒光顯微鏡下觀察到100%表達(dá)紅色/綠色熒光,表明穩(wěn)定表達(dá)RFP-GFP-LC3的大鼠胰島細(xì)胞已經(jīng)建立成功。

2.2 自噬的誘導(dǎo)以及自噬流的檢測(cè)

如圖3A所示,在本實(shí)驗(yàn)中可明顯觀察到對(duì)照組中自噬體較少且紅色熒光與綠色熒光的表達(dá)量一致。經(jīng)過饑餓自噬誘導(dǎo)以后,自噬點(diǎn)顯著增加,細(xì)胞中綠色熒光點(diǎn)的表達(dá)量顯著低于紅色熒光的表達(dá)量。該現(xiàn)象是由于饑餓誘導(dǎo)形成了自噬流,自噬體與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體,在自噬溶酶體的酸性環(huán)境下,綠色熒光點(diǎn)發(fā)生淬滅。在對(duì)細(xì)胞進(jìn)行饑餓處理的同時(shí)加入10 μmol/L的CQ,發(fā)現(xiàn)綠色熒光的表達(dá)量較饑餓組略有回升。這是因?yàn)樽允勺钄鄤〤Q部分阻斷了自噬體與溶酶體的結(jié)合,從而導(dǎo)致綠色熒光表達(dá)量的上升。單個(gè)細(xì)胞中紅綠熒光點(diǎn)的比值在各組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖 3B)。

2.3 自噬誘導(dǎo)后相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)分析

細(xì)胞經(jīng)過無血清饑餓處理2 h后用2%SDS溶液裂解,收集總蛋白質(zhì),采用Western-blot的方法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白質(zhì)P62及S6K的表達(dá)水平。結(jié)果如圖4所示,自噬底物P62蛋白的水平下降,與此同時(shí)m-TOR活性評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)S6K的磷酸化水平下降,由此證明自噬流被成功誘導(dǎo),與圖3結(jié)果所示一致。

圖2 RIN-m5f細(xì)胞的熒光顯微鏡觀察圖(100×)(A)透射光下的RIN-m5f細(xì)胞株;(B)綠色熒光下的RIN-m5f細(xì)胞株;(C)紅色熒光下的RIN-m5f細(xì)胞株。Fig.2 The RIN-m5f cells observed by fluorescence microscopy(100×)(A)Transmitted light image;(B)Green fluorescence image;(C)Red fluorescence image.

圖3 激光共聚焦下觀察RFP-GFP-LC3穩(wěn)定細(xì)胞株中自噬體的形成(A)2 h血清饑餓后,RFP-GFP-LC3穩(wěn)定細(xì)胞株中自噬體的形成圖(標(biāo)尺50 μm);(B)圖A中綠色熒光點(diǎn)/紅色熒光點(diǎn)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。**:P＜0.01,與對(duì)照組相比;#:P＜0.05,與饑餓組相比。Fig.3 Observation of autophagy formation in RFP-GFP-LC3 stable cell line under laser scanning microscopy(A)The formation of autophagosomes in RFP-GFP-LC3 stable cell line after serum starvation for 2 h (scale bar 50 μm);(B)The cells were treated as described in(A)and the statistical results of green/red fluorescence points were analysed by SPSS 10.0 software.**:P＜0.01 vs.control group;#:P＜0.05 vs.starvation group.

圖4 無血清饑餓2 h后,Western-blot檢測(cè)RFP-GFPLC3穩(wěn)定細(xì)胞株中相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化Fig.4 The protein levels of P62,GAPDH,S6K and PS6K were tested by Western-blot after 2 h of serumfree starvation in RFP-GFP-LC3 stable cell line

3 討論

近年來,越來越多的證據(jù)表明,自噬是一種治療糖尿病的新靶點(diǎn),具有多種有益作用。同時(shí)許多藥物和天然產(chǎn)物通過多種信號(hào)途徑參與自噬調(diào)節(jié),包括誘導(dǎo)或抑制自噬[13]。有實(shí)驗(yàn)研究表明傳統(tǒng)中藥消渴平可通過誘導(dǎo)自噬抑制小鼠胰島細(xì)胞在高糖培養(yǎng)下的細(xì)胞凋亡[14],這對(duì)于糖尿病的研究具有重大意義,同時(shí)也提示自噬的精準(zhǔn)檢測(cè)愈發(fā)重要。目前,通過細(xì)胞免疫熒光技術(shù)以及Western-blot對(duì)LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的檢測(cè),并不能完整地反映自噬的整體過程。本實(shí)驗(yàn)通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方法,將已融合的紅色熒光蛋白、綠色熒光蛋白與LC3蛋白轉(zhuǎn)入RIN-m5f細(xì)胞,這樣能夠在較為簡(jiǎn)單的共聚焦活細(xì)胞拍攝下,清楚觀察到細(xì)胞自噬的整個(gè)過程,實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)便易行。

雙熒光RFP-GFP-LC3體系是比GFP-LC3更全面可靠的自噬定量分析方法。該體系最大的優(yōu)點(diǎn)是不需要外加其他藥物干預(yù),可以同時(shí)直觀地判斷細(xì)胞自噬活性和自噬流(自噬通量)的變化[15～16]。在本研究中,我們運(yùn)用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法,成功構(gòu)建了表達(dá)RFP-GFP-LC3的大鼠胰島β細(xì)胞株,并通過G418進(jìn)行篩選,運(yùn)用激光共聚焦拍攝手段進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)細(xì)胞最終能100%表達(dá)RFPGFP-LC3質(zhì)粒。在此基礎(chǔ)上,根據(jù)RFP與GFP對(duì)pH的不同適應(yīng)度[17～18],通過無血清饑餓誘導(dǎo)細(xì)胞自噬,結(jié)果顯示:在饑餓條件下,綠色熒光點(diǎn)因溶酶體環(huán)境pH較低發(fā)生淬滅,而紅色熒光點(diǎn)穩(wěn)定存在,因此GFP/RFP熒光點(diǎn)的比值下降;當(dāng)加入10 μmol/L氯喹部分阻斷自噬流后,LC3無法與溶酶體融合,綠色熒光點(diǎn)數(shù)回升。這一實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象符合饑餓誘導(dǎo)的自噬情況[19]。自噬是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程,該雙色熒光體系能夠準(zhǔn)確地同時(shí)顯示和區(qū)分自噬體和自噬溶酶體,是檢測(cè)自噬流的最佳方法[20]。目前,雙熒光RFP-GFP-LC3已經(jīng)逐漸得到許多學(xué)者的認(rèn)可,在自噬相關(guān)研究中發(fā)揮了重要作用[21～23]。本實(shí)驗(yàn)中,穩(wěn)定表達(dá)RFP-GFP-LC3質(zhì)粒的大鼠胰島細(xì)胞株的成功構(gòu)建不僅解決了傳統(tǒng)自噬檢測(cè)手段——細(xì)胞免疫熒光技術(shù)需要相應(yīng)一抗/二抗的孵育、實(shí)驗(yàn)成本較大、步驟繁瑣耗時(shí)的缺點(diǎn)[24],而且為自噬在糖尿病的相關(guān)研究提供了細(xì)胞平臺(tái),有利于自噬相關(guān)機(jī)理藥物在胰島β細(xì)胞上的高通量篩選,為糖尿病藥物的開發(fā)提供了便利。