曹湛慧，黃 和，2，劉子聰，程嘉怡

（1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江 524088；2.廣東海洋大學(xué)分析測試中心，廣東湛江 524088）

番石榴（Psidium guajava L.）屬于桃金娘科番石榴屬，廣泛種植在廣東、廣西、海南、江西等地區(qū)，全年可采摘[1]。黃酮是一類分布廣泛、備受關(guān)注的天然多酚類物質(zhì)[2]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物具有降血糖、清除自由基、防治心腦血管疾病、保肝、抗菌等功效[3]，現(xiàn)廣泛被應(yīng)用于醫(yī)療、保鮮、食用等領(lǐng)域。

根據(jù)國內(nèi)外研究資料顯示，絕大部分都在研究番石榴葉黃酮類提取物的活性、應(yīng)用等，對(duì)于番石榴果實(shí)中黃酮類物質(zhì)的提取及應(yīng)用研究較少，張?jiān)浦竦热薣4]對(duì)番石榴中總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化研究。彭財(cái)英等人[5]采用正反相硅膠、凝膠、微孔樹脂柱色譜、薄層色譜等手段分離，波譜法對(duì)番石榴果實(shí)中黃酮類成分進(jìn)行研究。Luximon R A等人[6]研究發(fā)現(xiàn)，不同品種番石榴的黃酮類物質(zhì)都具有有效的抗氧化能力。目前，將番石榴黃酮進(jìn)行水產(chǎn)品保鮮研究尚未見報(bào)道。

試驗(yàn)通過超聲波提取番石榴果實(shí)中黃酮類物質(zhì)，采用聚酰胺柱層析柱對(duì)黃酮類粗提物進(jìn)行純化，將粗提物及純化物應(yīng)用于蝦肉糜、魚肉糜的保鮮研究中，以期為番石榴黃酮在水產(chǎn)品的保鮮應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

番石榴、新鮮的對(duì)蝦、羅非魚，購于湛江沃爾瑪超市，產(chǎn)地湛江。

蘆丁，標(biāo)準(zhǔn)品，中國食品藥品檢定研究所提供；聚酰胺粉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、95%乙醇等，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1901型紫外可見分光光度計(jì)，廣州市深華生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；PHS-3C型pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司產(chǎn)品；LSB50L型立式壓力蒸汽滅菌鍋，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱，上海高致精密儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 番石榴黃酮類物質(zhì)提取工藝流程

番石榴→清洗、削皮、打漿→超聲波輔助提?。弦罕?∶25，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，超聲功率350 W，提取時(shí)間30 min）→過濾、離心（8 000 r/min，10 min）、濃縮→黃酮粗提物→裝柱、純化→黃酮純化物。

1.3.2 黃酮類物質(zhì)含量的測定

采用NaNO2-Al（NO3）3比色法，番石榴黃酮的提取參照文獻(xiàn)[7-8]。

1.3.3 層析柱制備

層析柱材料的預(yù)處理：用95%的乙醇溶液浸泡聚酰胺粉和棉花24 h，使用前不斷攪拌，直至沒有氣泡冒出。將少許棉花制成層析柱內(nèi)徑大小、厚度適中的薄層圈，用浸泡液使其平鋪在層析柱底部，再沿著玻璃棒將預(yù)處理的聚酰胺粉加入到層析柱里至容積的2/3，輕敲柱子使聚酰胺粉間無氣泡，用3倍柱體積的95%乙醇溶液洗滌，直至洗出液澄清并在蒸干后無任何殘留為止，再用3倍柱體積的5%氫氧化鈉、1倍柱體積的蒸餾水和3倍柱體積的10%醋酸洗滌，然后用蒸餾水洗滌，直至洗出液呈中性，備用[9]。

1.3.4 樣品的分離純化

（1）分離純化流程。移適量的番石榴黃酮粗提物置于層析柱中，待樣液完全加入到層析柱后，加少量蒸餾水至洗出液澄清，最后用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇洗滌[10]。用活塞控制洗脫速度為每滴間隔5 s，每20 mL收集 1次。將洗脫起點(diǎn)與終點(diǎn)間所收集的洗脫液合并，并置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進(jìn)行濃縮，至與進(jìn)樣體積相同，于4℃下保存，備用。

（2）洗脫起點(diǎn)與終點(diǎn)的判斷方法。洗脫起點(diǎn)與終點(diǎn)的判斷：從不同的收集杯中吸取1 mL收集液于小試管中，用膠頭滴管移入3～4滴1%的三氯化鐵，充分搖勻[11]。若反應(yīng)液呈綠色，則表明洗出液中含有目標(biāo)化合物；若溶液呈黃棕色，則不含目標(biāo)化合物。

1.3.5 番石榴黃酮類提取物的保鮮應(yīng)用

（1）樣品的制備。對(duì)蝦去殼、沖洗干凈后絞碎，制成蝦糜，備用。

羅非魚去鱗、去頭、去尾、去內(nèi)臟后，反復(fù)沖洗干凈后絞碎，制成魚糜，備用。

空白對(duì)照組（CK）：稱取每份250 g的蝦肉糜和魚肉糜分別置于燒杯中，移入10 mL蒸餾水并充分均質(zhì)，立即用保鮮膜密封，于4℃下冷藏保存，備用。

試驗(yàn)組：準(zhǔn)確稱取3份250 g的蝦肉糜和3份250 g的魚肉糜分別置于不同的燒杯中，每份蝦肉糜和魚肉糜分別加入10 mL預(yù)先配制的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的番石榴黃酮粗提物、0.5%的番石榴黃酮純化物、0.15%的山梨酸鉀溶液，并充分均質(zhì)，迅速用保鮮膜密封，于4℃下冷藏保存，備用。

（2）感官評(píng)價(jià)。蝦肉糜的感官評(píng)價(jià)方法借鑒水產(chǎn)品行業(yè)中《凍蝦仁》的標(biāo)準(zhǔn)，而魚肉糜借鑒陳曉眠等人[12]《殼聚糖和茶多酚對(duì)羅非魚冷藏保鮮效果比較》的方法。隨機(jī)挑選5人組成固定的評(píng)分小組，每2 d分別對(duì)每組蝦肉糜、魚肉糜的感官進(jìn)行評(píng)分。評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)分5個(gè)等級(jí)。每個(gè)人在單獨(dú)情況下根據(jù)外觀、肉質(zhì)和氣味對(duì)應(yīng)的分值獨(dú)立給出各項(xiàng)評(píng)價(jià)分值[13]。

蝦肉糜感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表1，魚肉糜感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表1 蝦肉糜感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

表2 魚肉糜感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

（3）pH值的測定。采用酸度計(jì)法，從空白對(duì)照組和試驗(yàn)組中稱取蝦肉糜、魚肉糜各10 g，分別移入100 mL蒸餾水，使其均質(zhì)1 min，放置30 min后進(jìn)行測定[14]。每個(gè)樣品平行測定2次，每隔2 d測定1次。

（4）揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）值的測定。參照水產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)SC/T 3032—2007《水產(chǎn)品揮發(fā)性鹽基氮的測定》[15]的方法。

（5）菌落總數(shù)的測定。參照GB 4789.2—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定》[16]執(zhí)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酮類粗提物定性檢測

硝酸鋁反應(yīng)：將樣品提取液中加入2%硝酸鋁溶液，樣品液顯示為黃色；鹽酸鎂粉反應(yīng)：將樣品提取液中加入少量鎂粉，再加2滴鹽酸，樣品液顯示為橙紅色；三氯化鐵反應(yīng)：將樣品提取液中加入數(shù)滴1%三氯化鐵溶液，樣品液顯示為灰綠色。這都是黃酮類化合物的特征顏色反應(yīng)現(xiàn)象，最終確定樣品溶液中含黃酮類化合物。

2.2 黃酮類粗提物和純化物的濃度計(jì)算

稱取200 g番石榴果皮漿，經(jīng)過提取、濃縮，分離純化得到各500 mL的粗提物和純化物。利用蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中總黃酮含量。測得黃酮類粗提物和純化物的質(zhì)量濃度分別為0.442，0.540 mg/mL。

2.3 番石榴中黃酮類物質(zhì)的保鮮應(yīng)用

2.3.1 感官評(píng)分的變化

食品感官評(píng)分是通過對(duì)食品的色澤、質(zhì)地、氣味等進(jìn)行評(píng)價(jià)打分。感官指標(biāo)分值是評(píng)價(jià)食品最方便直觀、簡單準(zhǔn)確的指標(biāo)[17]。

蝦肉糜在4℃條件下的感官評(píng)分變化見圖1，魚肉糜在4℃條件下的感官評(píng)分變化見圖2。

圖1 蝦肉糜在4℃條件下的感官評(píng)分變化

從圖1和圖2可以看出，蝦肉糜、魚肉糜的品質(zhì)隨著貯藏時(shí)間的延長，感官評(píng)分都呈下降的趨勢。對(duì)于蝦肉糜，前2 d空白對(duì)照組和試驗(yàn)組的感官評(píng)價(jià)值沒有明顯的區(qū)別；從4 d起，空白對(duì)照組的蝦肉糜顏色漸漸變黃，有黑點(diǎn)，表面出現(xiàn)黏液且有腐敗氣味，而試驗(yàn)組的蝦肉糜感官品質(zhì)的下降相對(duì)緩慢。對(duì)于魚肉糜，前4 d每個(gè)組的感官評(píng)分差異較??；而從6 d起，相比空白對(duì)照組，純化物、粗提物處理過的魚肉糜，與山梨酸鉀一樣能有效地使感官品質(zhì)下降趨勢減緩。這表明，黃酮粗提物、純化物抑菌作用好。

2.3.2 pH值的變化

鮮蝦、活魚死后由于肉質(zhì)中糖原發(fā)生反應(yīng)而生成大量的酸性物質(zhì)，致使蝦肉糜、魚肉糜的pH值下降，而隨著貯藏時(shí)間的延長，蝦肉糜、魚肉糜中的含氮物質(zhì)容易被腐敗菌吸收利用，產(chǎn)生堿性物質(zhì)，使蝦、魚肉糜中pH值上升[18]。

蝦肉糜在4℃條件下pH值的變化見圖3，魚肉糜在4℃條件下pH值的變化見圖4。

圖2 魚肉糜在4℃條件下的感官評(píng)分變化

圖3 蝦肉糜在4℃條件下pH值的變化

圖4 魚肉糜在4℃條件下pH值的變化

從圖3和圖4可以看出，在保鮮過程中，每個(gè)空白對(duì)照組和試驗(yàn)組的pH值變化趨勢呈相同的變化規(guī)律，其中空白對(duì)照組的pH值變化趨勢比試驗(yàn)組尤為明顯，這表明黃酮類粗提物、純化物與山梨酸鉀同樣具有一定的保鮮能力。在每個(gè)試驗(yàn)組中，用純化物浸泡過的蝦肉糜、魚肉糜pH值變化趨勢較接近山梨酸鉀，并比粗提物的變化程度慢，表明黃酮純化物更能有效地抑制微生物的生長。

2.3.3 揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）值的變化

TVB-N是水產(chǎn)品在貯藏過程中，肉質(zhì)中蛋白質(zhì)由于酶和細(xì)菌的作用而被轉(zhuǎn)化成胺類等堿性含氮物[19]，TVB-N值已廣泛成為評(píng)價(jià)水產(chǎn)品鮮度的重要方法之一。

蝦肉糜在4℃條件下TVB-N值的變化見圖5，魚肉糜在4℃條件下TVB-N值的變化見圖6。

圖5 蝦肉糜在4℃條件下TVB-N值的變化

圖6 魚肉糜在4℃條件下TVB-N值的變化

從圖5和圖6可以看出，整個(gè)試驗(yàn)過程中，TVB-N值的變化呈現(xiàn)出上升的趨勢。對(duì)于蝦肉糜，前4 d空白對(duì)照組和試驗(yàn)組的TVB-N值變化差異較小，接著空白對(duì)照組TVB-N值的遞增趨勢明顯，而對(duì)于魚肉糜；從6 d起，與各個(gè)試驗(yàn)組相比，空白對(duì)照組TVB-N值的變化趨勢非常明顯，說明相同保鮮條件下，魚肉糜比蝦肉糜有更長的保鮮期。在各個(gè)試驗(yàn)組中，粗提物、純化物和山梨酸鉀的TVB-N值上升趨勢較為緩慢，且在貯藏期的6 d，用粗提物、純化物和山梨酸鉀處理過的蝦肉糜與魚肉糜TVB-N值分別是27.49，23.21，20.24，23.50，20.39，19.93 mg/100 g，證明粗提物和純化物具有一定的抑菌作用，純化物抑菌效果比粗提物要好。

2.3.4 菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值的變化

水產(chǎn)品的腐敗變質(zhì)大部分由于微生物的生長繁殖引起，其腐敗程度主要取決于微生物的繁殖速度，因而菌落總數(shù)能夠成為衡量水產(chǎn)品鮮度的一項(xiàng)重要指標(biāo)[20]。

蝦肉糜在4℃條件下菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值的變化見圖7，魚肉糜在4℃條件下菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值的變化見圖8。

圖7 蝦肉糜在4℃條件下菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值的變化

圖8 魚肉糜在4℃條件下菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值的變化

從圖7和圖8可以看出，無論是蝦肉糜還是魚肉糜，空白對(duì)照組的菌落總數(shù)比每個(gè)試驗(yàn)組多，且上升幅度比相同保鮮期的試驗(yàn)組顯著。對(duì)于蝦肉糜，空白對(duì)照組3 d就達(dá)到1×106，用粗提物、純化物和山梨酸鉀處理過的蝦糜分別是5，7，8 d達(dá)到1×106，對(duì)于魚肉糜，空白對(duì)照組4 d達(dá)到1×106，用粗提物、純化物和山梨酸鉀處理過的蝦糜分別是6，7，9 d達(dá)到1×106。這表明粗提物、純化物具有一定的抑制微生物生長繁殖的能力，且黃酮純化物抑菌效果優(yōu)于粗提物。

3 結(jié)論

采用超聲波輔助法提取番石榴果皮中黃酮類物質(zhì)，經(jīng)過提取、濃縮、分離純化，得到粗提物和純化物。通過計(jì)算黃酮類粗提物和純化物的質(zhì)量濃度分別為0.442，0.540 mg/mL。

以0.15%的山梨酸鉀為陽性對(duì)照，以感官評(píng)價(jià)、pH值、揮發(fā)性鹽基氮值和菌落總數(shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，將番石榴黃酮類粗提物和純化物在4℃保鮮條件下保鮮蝦肉糜、魚肉糜。結(jié)果表明，0.5%番石榴黃酮類粗提物和純化物能有效減緩蝦肉糜、魚肉糜的品質(zhì)下降進(jìn)程，降低揮發(fā)性鹽基氮值，抑制腐敗菌的增長，延長蝦肉糜、魚肉糜的保質(zhì)期。番石榴黃酮類純化物保鮮效果優(yōu)于粗提物，可作為一種天然防腐劑使用。