譚 為 張?zhí)m蘭 龐市賓 孫玉華

新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，新疆 烏魯木齊 830004

新疆哈薩克民族藥黑果小檗(BerberisheteropodaSchrenk)為小檗科(Berberidaceae) 小檗屬 (BerberisL .)多年生灌木[1-2]。主要分布在新疆山區(qū)，資源十分豐富，其莖皮及根含小檗堿，果實(shí)含葡萄糖、果糖、多種人體所需的維生素、有機(jī)酸、微量元素和色素類等物質(zhì)，在新疆民族藥中用于治療痢疾、腸炎、咽炎、濕疹、高血壓、高血脂等疾病。在民間，黑果小檗果實(shí)長(zhǎng)期以來被哈薩克族和維吾爾族人民晾干泡茶飲用，是一種具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的藥食兩用的野生植物[3]。由于天然色素類具有一定的營(yíng)養(yǎng)和生理活性而廣泛應(yīng)用于食品、化妝品和醫(yī)藥領(lǐng)域。因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過對(duì)黑果小檗果實(shí)中的色素進(jìn)行提取與純化工藝研究，為黑果小檗果實(shí)中的色素進(jìn)一步開發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料 黑果小檗果實(shí)BerberisheteropodaSch-renk(采集自新疆烏魯木齊南山的山坡河谷，由新疆藥物研究所何江副研究員鑒定為小檗科小檗屬落葉灌木黑果小檗)。

1.2 儀器與試劑 島津UV-2501PC紫外可見分光光度計(jì)(日本島津有限公司)；BS124S型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市醫(yī)療儀器廠)；AS10200AD超聲波清洗器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；202-IES電熱恒溫干燥箱(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)。大孔吸附樹脂AB-8(青島海洋化工廠)；其余試劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 黑果小檗果實(shí)色素提取工藝研究

2.1.1 色素測(cè)定方法

2.1.1.1 色素提取 精密稱取黑果小檗果實(shí)2.00 g，加規(guī)定量的水在規(guī)定溫度的水浴中回流提取不同時(shí)間，共提取3次，提取液合并，過濾至100 mL量瓶中，用提取溶劑定容至刻度，搖勻備用。

2.1.1.2 色價(jià)法[4]測(cè)定黑果小檗果實(shí)色素 精密量取1.0 mL提取溶液，加pH3.0的HCl緩沖溶液定容到25 mL，混勻，以1.0 mL溶劑同法定容至25 mL容量瓶做空白，室溫下用紫外分光光度計(jì)于200～600 nm范圍內(nèi)掃描，測(cè)定其特征吸收光譜，以確定最大吸收波長(zhǎng)。按下式計(jì)算：E=A×f/m。式中，E：色價(jià)，U/g；A：稀釋后峰值下的吸光度；m：取樣量，g；f：樣品溶液的稀釋倍數(shù)。

2.1.2 提取溶劑的考察 取黑果小檗果實(shí)，粗粉，分別加0.5%HCl-水、0.5%HCl-30%乙醇、0.5%HCl-50%乙醇、0.5%HCl-70%乙醇、0.5%HCl-95%乙醇10倍量，回流提取2次，每次2 h，合并提取液，過濾至100 mL量瓶中，用提取溶劑定容至刻度，測(cè)定吸光度，根據(jù)計(jì)算色價(jià)優(yōu)選出最佳提取溶劑。

2.1.3 提取方法的考察 取黑果小檗果實(shí)，粗粉，加入優(yōu)選出的最佳提取溶劑，分別采用回流提取、超聲提取、浸泡提取2次，每次2 h，合并提取液，過濾至100 mL量瓶中，用提取溶劑定容至刻度，測(cè)定吸光度，根據(jù)計(jì)算色價(jià)優(yōu)選出最佳提取方法，

2.1.4 正交試驗(yàn) 擬通過考察不同提取時(shí)間、提取次數(shù)以及提取溶劑的量對(duì)黑果小檗果實(shí)色素含量的影響。見表1。

表1 因素水平表

試驗(yàn)方法為稱取黑果小檗果實(shí)，粉碎，按照優(yōu)選出的最佳提取溶劑和提取方法以及表1規(guī)定的各參數(shù)提取，過濾，取濾液測(cè)定吸光度，采用方差分析處理數(shù)據(jù)，優(yōu)選出最佳提取工藝。

2.1.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 按最佳提取工藝操作3次。

2.2 黑果小檗果實(shí)色素純化工藝研究

2.2.1 大孔樹脂的預(yù)處理 取AB-8大孔樹脂分別裝柱，用水洗去細(xì)小樹脂及破碎樹脂，然后分別用95%乙醇浸泡24 h，充分溶脹，用乙醇洗至溶液加適量蒸餾水無白色渾濁現(xiàn)象時(shí)為止，最后用蒸餾水洗至無醇味備用。

2.2.2 黑果小檗果實(shí)色素提取液的制備 取黑果小檗果實(shí)，粉碎，按最佳提取工藝提取，過濾，備用。

2.2.3 大孔吸附樹脂的靜態(tài)與動(dòng)態(tài)吸附的篩選

動(dòng)態(tài)吸附：大孔吸附樹脂動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)。精密稱取已處理好的樹脂10 g，裝入直徑2.0 cm的洗脫柱中，各加入100 mL樣品液，以1.0 mL/min的流速上樣，上樣流出液反復(fù)上樣5次，收集上樣流出液。再以70%乙醇100 mL，以1.0 mL/min的流速洗脫，收集洗脫液濃縮至干。

靜態(tài)吸附：稱取大孔樹脂10 g，分別置250 mL三角瓶中，加樣品溶液100 mL，每隔5 min振搖10 s，持續(xù)2 h，然后靜置24 h，充分吸附后，濾過，測(cè)定吸附前溶液中黑果小檗果實(shí)色素的吸光度值后，將吸附后的樹脂裝入層析柱中，先以水洗脫除雜，再以100 mL 70%乙醇溶液解吸，測(cè)定解吸液中黑果小檗果實(shí)色素的吸光度值。

2.2.4 純化工藝參數(shù)的篩選 通過上述實(shí)驗(yàn)，繼續(xù)對(duì)乙醇濃度、吸附流速、最大上樣量、洗脫劑用量、上柱液pH值、洗滌除雜用水量進(jìn)行考察，選擇黑果小檗果實(shí)色素的最佳純化工藝參數(shù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 黑果小檗果實(shí)色素提取工藝研究

3.1.1 黑果小檗果實(shí)色素可見光吸收特性 據(jù)圖1可知，黑果小檗果實(shí)在可見區(qū)535 nm處有最大吸收，故選擇535 nm作為黑果小檗果實(shí)色素的測(cè)定波長(zhǎng)。

3.1.2 提取溶劑的考察 結(jié)果表明，采用水提取時(shí)色素含量最高，當(dāng)乙醇濃度大于70%時(shí)，色價(jià)變小，因此選定0.5%HCl-70%乙醇提取作為黑果小檗果實(shí)色素的最佳提取溶劑。見表2。

3.1.3 提取方法的考察 結(jié)果表明，采用超聲法提取時(shí)色素吸光度值最高，因此選定超聲提取法作為黑果小檗果實(shí)色素的最佳提取方法。見表3。

序號(hào)12345提取溶劑0.5%HCl-H2O0.5%HCl-30% EtOH0.5%HCl-50% EtOH0.5%HCl-70% EtOH0.5%HCl-95% EtOH色價(jià)/U/g206.96±2.95268.15±2.58279.29±6.23345.83±3.15329.27±3.23

表3 不同提取方法對(duì)色素吸光度值的影響

3.1.4 正交試驗(yàn) 由表4和表5可知，RA>RC>RD>RB，提取時(shí)間之間存在顯著差異，最佳提取工藝為A1 B3 C1 D2/A1 C1 D2 B3，所以應(yīng)采用6倍量的0.5%HCl-70%乙醇，超聲提取3次，每次提取時(shí)間為0.5 h。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果

表5 方差分析結(jié)果

3.1.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 按最佳提取工藝操作3次。測(cè)定色素色價(jià)分別為(438.94±1.89)、(435.87±5.10)、(428.52±4.71)U/g，RSD=1.11%。結(jié)果表明該提取工藝為：0.5%HCl-70%乙醇6倍量，超聲提取3次每次0.5 h效果最佳，工藝穩(wěn)定可行。

3.2 黑果小檗果實(shí)色素純化工藝研究

3.2.1 大孔吸附樹脂的靜態(tài)與動(dòng)態(tài)吸附的篩選 測(cè)定動(dòng)態(tài)吸附后的上樣流出液測(cè)得色素色價(jià)為(543.33±7.37)U/g，而靜態(tài)吸附后解吸液中黑果小檗果實(shí)色素的色價(jià)為(486.33±3.21)U/g。通過比較色價(jià)可知，動(dòng)態(tài)吸附與靜態(tài)吸附相比，效果更佳。

3.2.2 乙醇濃度的確定 精密稱取4份優(yōu)選出的樹脂，每份10 g，濕法裝柱，分別精密吸取一定濃度的提取液分別上柱，以蒸餾水洗至無色，再分別用30%、50%、70%、95%乙醇(V∶V) 150 mL洗脫，分別收集洗脫液，由表6可知，70%乙醇洗脫效果更佳。

3.2.3 吸附流速的確定 將一定濃度的黑果小檗果實(shí)提取液100 mL通過已處理好的裝有優(yōu)選樹脂的吸附柱里，分別以1、2、3、4、5 mL/min的流速進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，以黑果小檗果實(shí)色素含量為指標(biāo)，結(jié)果見表7，流速為1 mL/min吸光度值最佳。

序號(hào)12345不同濃度上樣前30% EtOH50% EtOH70% EtOH95% EtOH色價(jià)/U/g420.76±1.88522.00±3.00554.00±2.65611.33±2.08504.67±3.06

序號(hào)12345不同流速mL/min12345色價(jià)/U/g632.00±8.89616.67±3.21597.33±4.73492.33±3.06487.67±3.79

3.2.4 最大上樣量的考察 將一定濃度的黑果小檗果實(shí)色素提取液150 mL緩慢加入裝有優(yōu)選樹脂的玻璃柱中，樹脂量為10 mL/g，流速為1.0 mL/min，每樹脂床體積(Bed voLume，BV)即10 mL收集1個(gè)流分，測(cè)定色素含量，結(jié)果見圖2。由圖2可知，從第4流分開始，色素出現(xiàn)少量泄漏，隨著流分?jǐn)?shù)的增加至第8BV時(shí)色價(jià)明顯增高，說明AB-8樹脂對(duì)色素的吸附量達(dá)到飽和?？紤]到生產(chǎn)工藝中要避免造成色素的泄漏，擬定最大上樣量為1.612 g生藥/g樹脂(濕重)。

3.2.5 洗滌樹脂用水量的考察 稱取AB-8型干樹脂10 g，置直徑為2 cm的洗脫柱中，加入100 mL樣品液，水以1 mL/min的速度洗脫，每10 mL單獨(dú)收集；至洗脫液無色，水洗脫液分別濃縮干燥至恒重后稱重，見圖3。由圖3可知，用水量為6BV時(shí)，大部分雜質(zhì)已被洗脫，因此采用6倍量柱體積的去離子水除雜。

3.2.6 洗脫劑用量的考察 將已吸附好的黑果小檗果實(shí)提取液的優(yōu)選樹脂10 g，用蒸餾水洗脫8BV后，再用70%乙醇洗脫每樹脂床體積(10 mL)為一個(gè)考察單位，至洗脫液近無色，共收集5份，分別測(cè)定各BV洗脫液中色素的含量，見圖4。由圖4可知，前4BV70%乙醇洗脫液可將絕大部分色素洗脫下來，第7BV洗脫液中色素含量已極低。故確定洗脫劑用量為6BV。

3.2.7 上柱液pH值對(duì)動(dòng)態(tài)吸附性能的影響 色素化合物為多羥基酚類化合物，具有一定的極性和酸性，所以上柱液pH值對(duì)黑果小檗果實(shí)色素化合物的吸附效果會(huì)有一定影響。室溫25 ℃，采用一定量的黑果小檗樣品液上柱，加0.05%鹽酸調(diào)節(jié)上柱液的pH為2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，在相同條件下以1 mL/min的流速進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，見圖5。由圖5表明，上柱液的pH值對(duì)黑果小檗果實(shí)色素化合物吸附有較大的影響，pH為2.0時(shí)吸附量較低，因?yàn)樯现核嵝蕴珡?qiáng)，色素化合物容易轉(zhuǎn)變?yōu)檠瘥}，不易被吸附，從而影響到吸附量；pH-4左右時(shí)吸附量最大，因?yàn)榇藭r(shí)的酸度正好能使色素化合物在溶液中保持分子形式，容易被吸附。因此動(dòng)態(tài)吸附時(shí)應(yīng)調(diào)節(jié)上柱液pH為4進(jìn)行吸附。

3.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按上述純化工藝操作3次，測(cè)得黑果小檗果實(shí)色素的色價(jià)分別為：(717.33±1.53)、(723.33±3.21)、(736.67±3.21)，RSD=1.36%。結(jié)果表明，方法為：上樣濃度為1.612 g生藥/g樹脂(濕重)，除雜采用6個(gè)柱體積，洗脫劑pH為4的70%乙醇洗脫6個(gè)柱體積，流速為1 mL/min，方法穩(wěn)定，工藝可行。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)首先通過單因素法優(yōu)選提取溶劑和提取方法，然后通過正交實(shí)驗(yàn)法考察不同提取時(shí)間、提取次數(shù)以及提取溶劑的量對(duì)黑果小檗果實(shí)色素含量的影響，最終選擇了提取工藝為：6倍量0.5%HCl-70%乙醇，超聲提取3次，每次0.5 h，測(cè)定黑果小檗樣品中色素的色價(jià)可達(dá)(434.78±4.80)，RSD=1.11%，提取工藝穩(wěn)定可行。

本實(shí)驗(yàn)通過采用靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)和動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)等考察了大孔樹脂AB-8對(duì)黑果小檗果實(shí)色素純化效果及影響因素，優(yōu)選黑果小檗果實(shí)色素的提取工藝為0.5%HCl-70%乙醇6倍量，超聲提取3次每次0.5 h，優(yōu)選純化工藝為動(dòng)態(tài)吸附，最大上樣濃度為1.612 g生藥/g樹脂(濕重)，去離子水除雜洗脫6BV后，洗脫劑pH為4的70%乙醇洗脫6BV，流速為1 mL/min，進(jìn)行吸附和洗脫，測(cè)定黑果小檗樣品中色素的色價(jià)可達(dá)(725.78±9.90)，洗脫率可達(dá)到95%以上，該方法高效、穩(wěn)定、可行，為黑果小檗果實(shí)中色素分離純化工業(yè)化生產(chǎn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。