柯善恢， 伍時華， 趙東玲， 張 健， 黃翠姬

（廣西科技大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 柳州545006）

關(guān)鍵字:二次發(fā)酵酵母活力；乙醇分批補料發(fā)酵；補料時間

甘蔗富含蔗糖、葡萄糖和果糖，價格低廉，不占用耕地，是燃料乙醇理想的糖質(zhì)原料，而燃料乙醇被視為最清潔的能源之一[1，3]。甘蔗汁（糖質(zhì)量濃度140 g/L左右）直接發(fā)酵酒度偏低，不利于工業(yè)化生產(chǎn)，希望通過補加糖蜜提高初始糖質(zhì)量濃度（220 g/L左右），然后在酵母活力高的時間點繼續(xù)補加糖蜜提高最終酒度，但是甘蔗糖蜜對發(fā)酵抑制作用大，補料需在酵母活力高的時候進(jìn)行。與分批發(fā)酵相比，補料發(fā)酵有多方面的優(yōu)勢，可以解除高濃度基質(zhì)對生產(chǎn)菌株的抑制作用[4]，也可延長細(xì)胞穩(wěn)定期而獲得更多的目的產(chǎn)物，對生產(chǎn)高濃度乙醇具有重要的意義。但由于發(fā)酵過程的復(fù)雜性，補料時機(jī)和補料策略都難以確定[5]。目前研究較多的補料策略主要是通過建立模型的方法來優(yōu)化補料控制，如模糊模式識別法[6]、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)辨識法[7]、動力學(xué)模型與遺傳算法聯(lián)用[8]、動力學(xué)模型與擴(kuò)大功能的拉格朗日算法聯(lián)用[9]和補料反饋控制模型法[10]等，這些方法都建立在對發(fā)酵過程的數(shù)學(xué)模擬上，并未以酵母本身屬性為出發(fā)點。酵母活力是高濃度乙醇發(fā)酵成敗的關(guān)鍵因素之一[11]，酵母活力可能會影響補料時間，是補料流加時間的一個重要指標(biāo)。

用YPDF模擬甘蔗汁和甘蔗糖蜜培養(yǎng)基，將乙醇分批發(fā)酵不同時間點酵母等量轉(zhuǎn)接入新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基中，在相同條件下接種相同數(shù)目酵母進(jìn)行二次發(fā)酵，比較各時間點二次發(fā)酵酵母活力強弱，然后以二次發(fā)酵酵母活力為基礎(chǔ)，進(jìn)行乙醇分批補料發(fā)酵試驗，以驗證二次發(fā)酵酵母活力與補料時間關(guān)系，試圖為乙醇補料分批發(fā)酵建立一種新的流加時間確定策略。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株 乙醇酵母 （Saccharomyces cerevisiae）GJ2008由廣西科技大學(xué)發(fā)酵工程研究所保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基與種子培養(yǎng)基：參見左松方法[15]。發(fā)酵培養(yǎng)基：配置初始總糖質(zhì)量濃度為140、180、220、260 g/L 的發(fā)酵培養(yǎng)基（添加糖為葡萄糖與果糖，各占50%），酵母浸膏、蛋白胨及pH條件與種子培養(yǎng)基相同，上速培養(yǎng)基的裝液量都為200 mL/瓶。將20 g糖 （添加糖為葡萄糖與果糖，各占50%）裝入三角瓶滅菌。主發(fā)酵培養(yǎng)基的初始總糖質(zhì)量濃度為220 g/L，裝液量為300 mL。以上培養(yǎng)基都采用蒸汽滅菌法（115℃滅菌20 min）。

1.1.3 種子培養(yǎng)方法 斜面種子經(jīng)恒溫活化，接入一級種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)方法參見左松方法[16]，將二級種子液離心后，用無菌水將酵母泥振蕩均勻制成10倍濃縮菌懸液，備用。

1.1.4 乙醇發(fā)酵方法 乙醇分批發(fā)酵方法：將二級種子10倍濃縮菌懸液按1%的接種體積分?jǐn)?shù)接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，用透氣膜和牛皮紙包扎封瓶口，搖床120 r/min，32℃條件下發(fā)酵，進(jìn)行不同初總糖質(zhì)量濃度發(fā)酵試驗和220 g/L總糖主發(fā)酵試驗。

二次發(fā)酵方法：于主發(fā)酵培養(yǎng)基中每隔6小時取樣一次，離心制成濃縮菌懸液（2 mL），接入二次發(fā)酵培養(yǎng)基。取出的主發(fā)酵液體積0 h時為200 mL，并進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，細(xì)胞濃度為N0，主發(fā)酵其它時間點細(xì)胞濃度記為 N6、N12、N18、N24、N30、N36，則主發(fā)酵各時間點取出主發(fā)酵液體積為200/（Ni/N0）mL，以此保證二次發(fā)酵接種酵母數(shù)相同。用透氣膜和牛皮紙包扎封瓶口，搖床轉(zhuǎn)速與溫度同乙醇分批發(fā)酵。發(fā)酵過程中每6小時取一次樣，每組試驗兩個平行，所得結(jié)果為平均值。

乙醇補料分批發(fā)酵方法：將二級種子10倍濃縮菌懸液按 1%的接種體積分?jǐn)?shù)接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，用透氣膜和牛皮紙包扎封瓶口，搖床轉(zhuǎn)速與培養(yǎng)溫度均與乙醇分批發(fā)酵相同。在12、18、24、30、36 h時將發(fā)酵液倒入裝有葡萄糖和果糖的500 mL三角瓶中振蕩溶解，所有操作均在無菌環(huán)境下進(jìn)行。整個發(fā)酵過程每6小時取樣，每組試驗三個平行，所得結(jié)果為平均值。

1.2 檢測方法

總糖的測定：使用SGD-IV還原糖測定儀測定；細(xì)胞存活率測定：亞甲基藍(lán)法[12]；乙醇質(zhì)量濃度測定：用氣相色譜儀測定發(fā)酵過程中乙醇質(zhì)量濃度。采用裝FID檢測器的氣相色譜儀和T2100P色譜工作站，用面積外標(biāo)法分析乙醇質(zhì)量濃度。色譜條件見文獻(xiàn)[13]；發(fā)酵最終乙醇質(zhì)量濃度用蒸餾法測定。

1.3 糖代謝曲線分析

曲線下面積采用GraphPad Prism 5計算。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

運用Origin9.0軟件對發(fā)酵數(shù)據(jù)處理并作圖，數(shù)據(jù)處理按蔣凱所述方法計算[13]。

2 結(jié)果與討論

2.1 乙醇補料分批發(fā)酵最佳初糖質(zhì)量濃度的選擇

由表1可知，初總糖質(zhì)量濃度為140 g/L時，乙醇產(chǎn)率和總糖發(fā)酵效率高，殘?zhí)巧?，但初總糖質(zhì)量濃度太低，發(fā)酵后期需要補加高質(zhì)量濃度的糖發(fā)酵液才能達(dá)到產(chǎn)高質(zhì)量濃度乙醇的要求；初總糖質(zhì)量濃度為260 g/L時，乙醇產(chǎn)率小，總糖發(fā)酵效率低，殘?zhí)琴|(zhì)量濃度較高，不適合作為補料發(fā)酵初始糖質(zhì)量濃度；在220 g/L左右時乙醇產(chǎn)率、總糖發(fā)酵效率綜合較高，后期補料壓力相對小。乙醇補料分批發(fā)酵初總糖偏高會抑制酵母活力[4]，殘?zhí)嵌?；偏低會?dǎo)致設(shè)備利用率低，后期補糖質(zhì)量濃度高等問題，因此選擇一個酵母不受抑制且盡可能高的初始糖質(zhì)量濃度對分批補料發(fā)酵有重要意義。所以本實驗初總糖質(zhì)量濃度設(shè)定在220 g/L左右。

由圖1可知，主發(fā)酵過程0～12 h糖消耗速率最大，為（9.53±0.02） g/（L·h），酵母數(shù)量增長最快，乙醇產(chǎn)率也最大，為（3.79±0.01） g/（L·h），酵母發(fā)酵初期的指數(shù)級生長表明酵母受糖抑制作用小；30～36 h糖消耗速率僅為 0.17 g/（L·h），發(fā)酵基本結(jié)束。以 0～12 h乙醇產(chǎn)率/糖消耗速率 （即乙醇對耗糖產(chǎn)率）值為標(biāo)準(zhǔn)，此后每6小時占標(biāo)準(zhǔn)比分別為104.49%、154.22%、116.01%和0%，可知隨著糖消耗速率和乙醇產(chǎn)率的下降，每克糖所產(chǎn)的乙醇卻在增加，說明發(fā)酵后期酵母仍具有較高的發(fā)酵活力，只因糖被消耗完而乙醇質(zhì)量濃度不再增加，并非酵母沒有發(fā)酵能力，發(fā)酵后期仍可進(jìn)行補料。要弄清何時適合補料，需要知道發(fā)酵過程的酵母活力。

表1 不同總糖質(zhì)量濃度乙醇分批發(fā)酵主要參數(shù)Table 1 Main parameters of the ethanol batch fermentation by S.cerevisiae strain GJ2008 at different total sugar concentration

圖1 初總糖質(zhì)量濃度為220 g/L時的乙醇分批發(fā)酵過程曲線Fig.1 Profiles of residual sugars，biomass concentration and ethanol during the ethanol fermentation with 220 g/L initial sugar

2.2 根據(jù)二次發(fā)酵酵母活力選擇最佳補料時間

酵母活力包括酵母的細(xì)胞活性和發(fā)酵能力，二次發(fā)酵酵母活力反映的是主發(fā)酵不同時間點的酵母活力。作者從乙醇分批發(fā)酵的二次發(fā)酵酵母細(xì)胞活性、糖代謝和乙醇生成能力綜合分析酵母活力強弱。

2.2.1 二次發(fā)酵酵母細(xì)胞活性分析 酵母細(xì)胞活性從細(xì)胞總數(shù)和活細(xì)胞數(shù)兩方面考察。如圖2所示，主發(fā)酵不同時間點（0、6、12、18、24、30、36 h）取樣酵母的二次發(fā)酵細(xì)胞生長趨勢基本一致。酵母細(xì)胞數(shù)AUC可以整體的評價細(xì)胞生長狀況[14-16]，AUC越大細(xì)胞生長越快，由表2可知，0～30 h主發(fā)酵取樣酵母的二次發(fā)酵細(xì)胞數(shù)AUC相差不大，36 h取樣酵母細(xì)胞數(shù)AUC偏小，說明36 h取樣酵母生長情況比其他取樣點差，主要原因可能是主發(fā)酵36 h酵母已經(jīng)進(jìn)入衰亡期，重新接種到新培養(yǎng)基的酵母生長遲緩。各個時間點取樣酵母最終細(xì)胞數(shù)保持在相近水平，差別不大。如圖3和表2所示，主發(fā)酵各時間點取樣酵母的二次發(fā)酵酵母存活率很高，死亡細(xì)胞比較少，其中24 h取樣酵母整個發(fā)酵過程幾乎沒有死亡細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)AUC與活細(xì)胞AUC之差最小，說明24 h取樣酵母的細(xì)胞活性最高。細(xì)胞活性表示的是酵母生長狀況，要知道酵母活力還需分析酵母的發(fā)酵能力。

圖2 主發(fā)酵不同時間取樣酵母的二次發(fā)酵細(xì)胞生長曲線Fig.2 Profiles of biomass growth during the secondary fermentation by yeast sampling from the primary fermentation at different time

圖3 主發(fā)酵不同時間取樣酵母的二次發(fā)酵活細(xì)胞數(shù)Fig.3 Profilesofliving cellduring the secondary fermentation by yeast sampling from the primary fermentation at different time

2.2.2 二次發(fā)酵耗糖能力分析 如圖4-5所示，二次發(fā)酵在36 h內(nèi)基本結(jié)束，在0～6 h時段，總糖消耗速率由 0、6、12、18、24 h 取樣酵母逐漸增大，24 h取樣酵母總糖消耗速率最大，為（10.98±0.29） g/（L·h），36 h 最小，為（7.2±0.09） g/（L·h）；6～12 h 主發(fā)酵各時間點取樣，酵母的總糖消耗速率都達(dá)到最大值且開始趨于相同；12～18 h時段總糖消耗速率都減小。主要原因是主發(fā)酵各時間點取樣的酵母活力不同，使剛接種（0～6 h）的二次發(fā)酵酵母總糖消耗速率不同，經(jīng)過適應(yīng)期后酵母活力得到恢復(fù)，總糖消耗速率開始一樣（6～12 h），說明二次發(fā)酵初期酵母活力差異明顯。比總糖消耗速率表示單位活細(xì)胞量的總糖消耗速率，比總糖消耗速率越大表明單位活細(xì)胞的耗糖能力越強[13]。如圖6所示，二次發(fā)酵0～6 h時段各時間點取樣酵母的比總糖消耗速率由0 h取樣酵母到6 h取樣酵母略微減小，然后開始逐漸增大，24 h 取樣酵母達(dá)到最大值（9.49±0.15） g/（1011個活細(xì)胞·h），說明24 h取樣酵母單位活細(xì)胞量的耗糖能力最強。

表2 主發(fā)酵不同時間取樣酵母的二次發(fā)酵細(xì)胞生長曲線下面積Table 2 Area under growth curves during the secondary fermentation at different time of the primary

圖4 主發(fā)酵不同時間取樣酵母的二次發(fā)酵殘總糖代謝擬合曲線Fig.4 Fitted profiles of sugar metabolism during the secondary fermentation by yeast sampling from the primary fermentation at different time

圖5 主發(fā)酵不同時間取樣酵母的二次發(fā)酵總糖消耗速率Fig.5 Profiles of total sugar uptake rate during the secondary fermentation by yeast sampling from the primary fermentation at different time

圖6 主發(fā)酵不同時間取樣酵母的二次發(fā)酵比總糖消耗速率Fig.6 Profiles of specific glucose uptake rate during the secondary fermentation by yeast sampling from the primary fermentation at different time

二次發(fā)酵殘總糖曲線下面積可以定量地表示酵母發(fā)酵活力的強弱[17]，二次發(fā)酵殘總糖曲線下面積越小，酵母發(fā)酵活力越強；反之，二次發(fā)酵殘總糖曲線下面積越大，酵母發(fā)酵活力越弱。由圖7可知，24 h取樣酵母二次發(fā)酵殘總糖曲線下面積最小，為2 390.0±59.4，發(fā)酵活力最強，36 h取樣點曲線下面積最大，為2 972.0±3.5，發(fā)酵活力最弱。以24 h取樣酵母AUC為對照組AUC24h，各取樣點比值依次為1.10、1.15、1.09、1.07、1.00、1.17、1.24，30 h 取樣酵母AUC開始增大，30 h和36 h分別高出24 h取樣點17%和24%，酵母發(fā)酵活力變?nèi)酰?4 h取樣酵母的發(fā)酵活力最強。

2.2.3 二次發(fā)酵乙醇生成能力分析 如圖8所示，主發(fā)酵各時間取樣酵母的二次發(fā)酵乙醇生成趨勢相同，乙醇生成曲線下面積可以整體的評價乙醇生成快慢[14]，24 h取樣酵母的乙醇生成曲線下面積最大為2 703，說明24 h取樣酵母乙醇生成最快。由圖9可知，0～6 h時段各時間點乙醇生成速率趨勢與比總糖消耗速率一致，24 h取樣酵母乙醇生成速率最大， 為 （4.56±0.4） g/（L·h），36 h 取樣酵母最小，為（2.80±0.23） g/（L·h），說明 24 h 取樣酵母生成乙醇能力最強。比乙醇生成速率表示單位活細(xì)胞量的乙醇生成速率[13]。由圖10可知，0～6 h各時間點取樣酵母之間的趨勢與比總糖消耗速率和乙醇生成速率一致，24 h取樣點酵母細(xì)胞比乙醇生成速率最大，為（3.95±0.14）×10-11g/h，說明 24 h 取樣酵母單位活細(xì)胞量生成乙醇的能力最強。綜合0～6 h時段主發(fā)酵不同時間點各速率的趨勢，24 h取樣點酵母最高。

圖7 主發(fā)酵不同時間取樣酵母二次發(fā)酵殘總糖曲線下面積Fig.7 Area under the curve of residual sugar secondary fermentation by yeast sampling from the primary fermentation at different time

圖8 主發(fā)酵不同時間取樣的酵母二次發(fā)酵乙醇生成曲線Fig.8 Profiles of ethanol during the secondary ethanol fermentation by yeast sampling from the primary fermentation at different time

主發(fā)酵各時間點取樣酵母的二次發(fā)酵主要參數(shù)見表3。24 h取樣酵母二次發(fā)酵糖代謝曲線下面積、乙醇曲線下面積，乙醇質(zhì)量濃度、乙醇產(chǎn)率、總糖發(fā)酵效率都是所有取樣酵母中最好的，18 h取樣酵母次之。綜合細(xì)胞活性，二次發(fā)酵初期酵母活力和二次發(fā)酵酵母發(fā)酵活力的趨勢，主發(fā)酵各時間點取樣酵母的二次發(fā)酵酵母活力強弱順序大致24、18、12、0、6、30、36 h，最適合的補料時間點為24 h。

圖9 主發(fā)酵不同時間取樣酵母的二次發(fā)酵乙醇生成速率Fig.9 Profiles of ethanol production rate during the secondary fermentation by yeast sampling from the primary fermentation at different time

圖10 主發(fā)酵不同時間取樣酵母的二次發(fā)酵比乙醇生成速率Fig.10 Profiles of specific ethanol production rate during the secondary fermentation by yeast sampling from the primary fermentation at different time

2.3 乙醇補料分批發(fā)酵驗證試驗

在初總糖為220 g/L乙醇分批發(fā)酵基礎(chǔ)上以相同條件下于不同時間點一次補加100 g/L糖進(jìn)行乙醇補料分批發(fā)酵，乙醇分批補料發(fā)酵主要發(fā)酵參數(shù)見表4。24 h補料發(fā)酵乙醇產(chǎn)率最高、總糖發(fā)酵效率最高、最終乙醇產(chǎn)率最高、殘?zhí)亲钌俸桶l(fā)酵周期最短，與之對應(yīng)二次發(fā)酵酵母活力最強。發(fā)酵結(jié)果與二次發(fā)酵酵母活力強弱趨勢完全一致，二次發(fā)酵酵母活力最強的24 h補料效果最好，說明在初始總糖質(zhì)量濃度為220 g/L時，選擇在24 h進(jìn)行補料效果是最佳的。相反，二次發(fā)酵酵母活力最弱的36 h補料乙醇產(chǎn)率、總糖發(fā)酵效率和最終乙醇產(chǎn)率最低，發(fā)酵效率只有66.10%，所剩殘總糖質(zhì)量質(zhì)量濃度最高為84.8 g/L，發(fā)酵周期長，很多殘?zhí)菦]被利用，不適合補料。

表3 主發(fā)酵不同時間取樣酵母的二次發(fā)酵主要參數(shù)Table 3 Main parameters of the secondary fermentation by S.cerevisiae strain at different time from the primary fermentation

表4 補料發(fā)酵實驗主要參數(shù)Table 4 Main parameters of the feeding fermentation by S.cerevisiae GJ2008 at different time

3 結(jié) 語

以主發(fā)酵不同時間取樣酵母的二次發(fā)酵酵母活力作為確定乙醇分批補料發(fā)酵流加時間的指標(biāo)。結(jié)果表明：二次發(fā)酵酵母活力強弱反映了所對應(yīng)的主發(fā)酵取樣時間點酵母活力，在二次發(fā)酵酵母發(fā)酵活力最強所對應(yīng)的主發(fā)酵時間點（24 h）補料，主發(fā)酵效果最好。作者以二次發(fā)酵酵母活力作為流加指標(biāo)為乙醇分批補料發(fā)酵建立了一種新的流加時間確定策略。該流加時間確定策略缺點是費時，必須進(jìn)行二次發(fā)酵，分析得到二次發(fā)酵酵母活力，以此反映主發(fā)酵不同時間點的酵母活力，但是如果乙醇分批發(fā)酵（主發(fā)酵）參數(shù)固定，該方法不失為一種簡單有效的流加時間確定策略。此方法也可推廣到其他類似細(xì)胞的補料時間確定上，具有廣泛實用性。