朱水玲， 耿 燕*， 程 鵬， 李 望， 陸震鳴，龔勁松， 許泓瑜， 史勁松， 許正宏，2

(1.江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江蘇 無錫 214122）

天麻蜜環(huán) （Armillaria mellea）是一種傳統(tǒng)的藥食用菌，民間主要用于頭暈頭痛、神經(jīng)衰弱、手足發(fā)麻、小兒驚風(fēng)等疾病的治療[1]。然而受其子實(shí)體資源限制，天麻蜜環(huán)難以被廣泛應(yīng)用[2]。隨著發(fā)酵工藝與技術(shù)的發(fā)展，天麻蜜環(huán)可以通過液態(tài)發(fā)酵法批量生產(chǎn)，其液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物具有與子實(shí)體相似的生物活性[2-4]。現(xiàn)代藥理及毒理實(shí)驗(yàn)已證明，天麻蜜環(huán)在抗腫瘤、抗氧化、抗細(xì)胞凋亡方面具有獨(dú)特功效[2-4]，然而對于天麻蜜環(huán)的抗炎活性研究甚少[5]。

炎癥是機(jī)體對抗外來致炎因子刺激，發(fā)生過度防御反應(yīng)而產(chǎn)生的一種病理過程[6]。當(dāng)炎癥反應(yīng)過激或紊亂時機(jī)體便會分泌大量促炎因子，包括炎癥介質(zhì)如一氧化氮（NO），炎癥因子如腫瘤壞死因子（TNF-α），白介素 6（IL-6），白介素 1β（IL-1β） 等[7]。這些促炎因子的過量分泌會造成機(jī)體炎性損傷，導(dǎo)致膿毒癥[8]、糖尿病[9]、關(guān)節(jié)炎[10]、動脈粥樣硬化[11]和腫瘤[6]等炎癥性疾病的發(fā)生。所以，抑制機(jī)體促炎因子的過量分泌對改善炎癥反應(yīng)、治療炎癥性疾病具有重要意義。

作者所在課題組前期研究對比了蟲草、猴頭、靈芝、天麻蜜環(huán)等菌粉提取物對脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的炎癥介質(zhì)NO過量分泌的抑制效果，發(fā)現(xiàn)天麻蜜環(huán)菌粉提取物能有效抑制NO的過量分泌[12]。在前期研究的基礎(chǔ)上，作者改良了提取工藝，進(jìn)一步研究天麻蜜環(huán)提取物對LPS誘導(dǎo)細(xì)胞過量分泌NO，TNF-α，IL-6及IL-1β的抑制效果，更全面地探索天麻蜜環(huán)的抗炎活性，以期開發(fā)天麻蜜環(huán)這一傳統(tǒng)中藥的新的藥用價值，并為從中發(fā)現(xiàn)新的天然抗炎藥物提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 材料 天麻蜜環(huán)菌粉：由江蘇神華藥業(yè)有限公司提供 （生產(chǎn)批號：20140812）；小鼠單核巨噬RAW264.7：由江南大學(xué)藥學(xué)院金堅(jiān)教授實(shí)驗(yàn)饋贈；10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿、96孔板、6孔板：購自Thermo公司。

1.1.2 試劑 無水乙醇、正己烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇：購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）：購自美國Gibco公司；胰酶-EDTA消化液、青霉素-鏈霉素（100×）：購自碧云天生物技術(shù)有限公司；脂多糖 （LPS）、噻唑藍(lán)（MTT）、磷酸鹽緩沖液（PBS）、格里斯（Griess） 試劑、二甲亞砜（DMSO）：購自美國Sigma-Aldrich公司；TNF-α、IL-6、IL-1β 檢測 ELISA 試劑盒： 購自 e-Bioscience公司。

1.1.3 儀器 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國Heidolph；CentriVap型冷凍離心濃縮儀：購自美國Labconco公司；Multiskan MK3型酶標(biāo)儀：德國Eppendorf公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，Thermo公司；倒置顯微鏡：Nikon公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 天麻蜜環(huán)提取物的制備 稱取10 kg天麻蜜環(huán)菌粉并加入100 L 75%乙醇，室溫下攪拌12 h，過濾，回收天麻蜜環(huán)菌粉濾渣至提取罐中，再加入100 L 75%乙醇，繼續(xù)提取12 h，如此重復(fù)提取3次，收集并合并3次的乙醇提取液。將乙醇提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，獲得天麻蜜環(huán)乙醇提取物，稱重并計(jì)算得率。將乙醇提取物復(fù)溶于ddH2O并轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，依次分別加入等體積正己烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，合并萃取液旋蒸濃縮至干，分別獲得天麻蜜環(huán)正己烷提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物，稱重并計(jì)算得率，提取流程見圖1。取少量4種有機(jī)溶劑提取物溶于二甲亞砜（DMSO）中，配制成30、100、300 mg/mL的儲液，過無菌濾膜后保存于-20℃用于后續(xù)的活性檢測。

圖1 天麻蜜環(huán)菌粉提取流程Fig.1 Extraction scheme for Armillaria mellea

1.2.2 試劑配制 DMEM完全培養(yǎng)基：由DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素鏈霉素雙抗溶液（青霉素 100 U/mL，鏈霉素 100 μg/mL）組成，將完全培養(yǎng)基封上封口膜置于4℃冰箱待用。

天麻蜜環(huán)提取物母液：分別稱取天麻蜜環(huán)不同極性提取物約300 mg，反復(fù)吹氮?dú)庵?次稱重質(zhì)量無變化，以確保提取溶劑完全除盡。將提取物完全溶于細(xì)胞培養(yǎng)級二甲基亞砜（DMSO），配成300 mg/mL母液，將此母液過0.45 μm有機(jī)濾膜過濾除菌，再將母液用DMSO梯度稀釋成30、100、300 mg/mL，最后將各萃取物不同質(zhì)量濃度的母液封上封口膜后避光保存于4℃冰箱備用。

脂多糖（LPS）母液：將脂多糖粉末（美國sigma公司）用預(yù)裝的PBS緩沖溶液配制成1 mg/mL母液，分裝于不同的EP管中，留一管于4℃冰箱待用，其余保存于-20℃冰箱，避免反復(fù)凍融。

天麻蜜環(huán)提取物工作液（1 mL）：取 30、100、300 mg/mL天麻蜜環(huán)提取物母液各1 μL，分別加入到999 μL DMEM完全培養(yǎng)基中， 配制成 30、100、300 μg/mL工作液（溶劑DMSO被稀釋1 000倍），工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。

脂多糖（LPS）工作液（1 mL）：取 LPS 母液和DMSO溶液各1 μL至998 μL DMEM 完全培養(yǎng)基中，配制成 1 μg/mL LPS工作液（DMSO被稀釋1 000倍，與天麻蜜環(huán)提取物工作液中DMSO的質(zhì)量濃度一致，排除天麻蜜環(huán)提取物工作液中溶劑干擾），工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.3 RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng) 將適量細(xì)胞懸液吸入直徑為10 cm的培養(yǎng)皿中，加入10 mL含有10%胎牛血清 （FBS）及1%抗生素 （100 U/mL青霉素；100 μg/mL鏈霉素）的DMEM完全培養(yǎng)基，將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，培養(yǎng)箱條件為37℃、5%CO2。

1.2.4 MTT法檢測細(xì)胞活力 將RAW264.7細(xì)胞以2×104個/孔的密度鋪于96孔板孵育過夜，待細(xì)胞長至80%時換入150 μL含不同濃度天麻蜜環(huán)提取物（30、100、300 μg/mL） 的培養(yǎng)基培養(yǎng) 24 h（每組6個復(fù)孔），24 h后棄培養(yǎng)液，每孔加入含0.5 mg/mL MTT的培養(yǎng)基100 μL，孵育4 h，4 h后棄含MTT的培養(yǎng)基，每孔加150 μL DMSO，孵育15 min后用酶標(biāo)儀檢測在570 nm處測的OD值。

式中：A為藥物組OD值-空白組OD值；B為對照組OD值-空白組OD值。

1.2.5 NO濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 根據(jù)試劑盒說明， 用 DMEM 培養(yǎng)基配 0～80 μmol/L的 NaNO2溶液，取上述不同濃度溶液100 μL于96孔酶標(biāo)板中，再加入等體積Griess試劑，反應(yīng)10～15 min后在酶標(biāo)儀540 nm處讀取吸光度值。以吸光度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的NaNO2的濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 Griess法檢測LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO水平 將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔板（2×104個/孔），37 ℃、5%CO2環(huán)境的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。設(shè)空白對照組、模型組和藥物作用組?？瞻讓φ战M為正常狀態(tài)下的細(xì)胞，模型組每孔加入150 μL、1 μg/mL LPS， 藥物作用組每孔加入 150 μL 不同質(zhì)量濃度天麻蜜環(huán)提取物 （30、100、300 μg/mL）預(yù)作用2 h，2 h后再以1 μg/mL LPS與對應(yīng)質(zhì)量濃度藥物共作用細(xì)胞。24 h后取100 μL細(xì)胞上清液，并加入等體積Griess試劑，室溫下反應(yīng)10～15 min，酶標(biāo)儀測其在540 nm處的OD值。

1.2.7 TNF-α，IL-6和IL-1β質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 根據(jù)ELISA試劑盒產(chǎn)品說明書將TNF-α、IL-6和IL-1β的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至以下各質(zhì)量濃度（7.8、15.6、31.3、62.5、125、250、500、1 000 pg/mL），再根據(jù)產(chǎn)品說明書步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。以炎癥因子（TNF-α，IL-6 和 IL-1β） 的質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，所讀取的OD值為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.8 ELISA法檢測LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α，IL-6和IL-1β水平 將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于 6孔板（2×105個/mL），37 ℃、5%CO2環(huán)境的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。設(shè)空白組、模型組和藥物作用組?？瞻捉M為正常狀態(tài)下的細(xì)胞，模型組每孔加入2 mL 1 μg/mL LPS，藥物作用組每孔加入2 mL不同質(zhì)量濃度 （30，100，300 μg/mL） 天麻蜜環(huán)提取物預(yù)作用2 h，2 h后再以1 μg/mL LPS與對應(yīng)質(zhì)量濃度藥物共作用細(xì)胞。24 h后收集細(xì)胞上清液，根據(jù)ELISA試劑盒說明書檢測在450 nm處的OD值。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理 采用One-Way ANOVA統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，顯著性差異表示為：與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001； 與 LPS 誘導(dǎo)組相比 ，#P ＜0.05，##P ＜0.01，###P ＜0.001。 數(shù) 據(jù) 采 用GraphPad Prism軟件進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 天麻蜜環(huán)不同極性提取物的得率

按照1.2.1中的方法對天麻蜜環(huán)菌粉進(jìn)行提取，各提取物的質(zhì)量及得率見表1。得率分別為：正己烷1.90%，氯仿1.10%，乙酸乙酯1.28%，正丁醇8.11%。

表1 天麻蜜環(huán)不同極性溶劑萃取物得率Table 1 Extraction rate of organic extracts of Armillaria mellea

2.2 天麻蜜環(huán)提取物對細(xì)胞活力的影響

不同質(zhì)量濃度 （30、100、300 μg/mL） 的天麻蜜環(huán)提取物與LPS共作用于RAW264.7細(xì)胞24 h后，MTT法檢測各組細(xì)胞活力，結(jié)果見圖2。單獨(dú)加入1 μg/mL LPS對RAW264.7細(xì)胞的活力沒有影響。加入不同劑量的天麻蜜環(huán)提取物與LPS共作用RAW264.7細(xì)胞24 h后，僅300 μg/mL的正己烷提取物對細(xì)胞活力有10.7%的抑制率，300 μg/mL氯仿提取物對RAW264.7的細(xì)胞活力有17%的抑制率。其余各濃度提取物對細(xì)胞活力均無明顯影響，可進(jìn)行進(jìn)一步的抗炎活性檢測。

圖2 不同極性提取物對RAW264.7細(xì)胞活力的影響Fig.2 Cell viability of RAW264.7 cells exposed with or without LPS and extractions

2.3 天麻蜜環(huán)提取物降低LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO的分泌

根據(jù)1.2.4的方法繪制了NO標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照1.2.5的方法檢測了天麻蜜環(huán)不同極性提取物抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO的水平，結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，天麻蜜環(huán)正己烷、氯仿、乙酸乙酯提取物均能良好的抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO的功效，并具有顯著的劑量依賴性。天麻蜜環(huán)正丁醇提取物能微弱地抑制LPS誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生NO，但其沒有劑量依賴性。正己烷、氯仿、乙酸乙酯提取物對LPS誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生NO的半抑制濃度IC50 見表 2， 分別為：（90.2±15.8）、（91.6±10.2）、（187.6±6.8） μg/mL。 由此可見，正己烷、氯仿、乙酸乙酯提取物在安全質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均能有效抑制LPS誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生NO。

2.4 天麻蜜環(huán)提取物降低LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞TNF-α，IL-6和IL-1β的分泌

根據(jù)1.2.6和1.2.7的方法檢測了天麻蜜環(huán)不同極性提取物對LPS誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥因子的抑制作用，結(jié)果見圖4（a）-（c）?？芍炻槊郗h(huán)氯仿、乙酸乙酯提取物中高劑量（100、300 μg/mL）均能顯著抑制LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的TNF-α、IL-6和 IL-1β分泌，并呈明顯的劑量依賴性。高劑量的天麻蜜環(huán)正己烷提取物能有效抑制炎癥因子分泌，中低劑量效果相對不明顯。而天麻蜜環(huán)正丁醇提取物沒有明顯效果。其中天麻蜜環(huán)乙酸乙酯提取物既具有良好的安全性又有顯著的抗炎活性。

圖3 天麻蜜環(huán)提取物對LPS誘導(dǎo)的NO的抑制效果Fig.3 Effect of extracts of Armillaria mellea on LPS induced NO production in RAW264.7 cells

表2 天麻蜜環(huán)提取物對細(xì)胞活力及促炎因子的半抑制質(zhì)量濃度Table 2 IC50 of Extracts on the viability and proinflammatory factor

3 結(jié) 語

圖4 天麻蜜環(huán)提取物對LPS誘導(dǎo)的TNF-α、IL-6和IL-1β的抑制效果Fig.4 Effect of extracts of Armillaria mellea on LPS induced TNF-α，IL-6 and IL-1β production in RAW264.7 cells

炎癥是糖尿病、腫瘤、動脈粥樣硬化等眾多疾病的病理過程，安全有效地抑制炎癥反應(yīng)對于治療各種重大疾病具有積極意義。研究發(fā)現(xiàn)，天麻蜜環(huán)液態(tài)發(fā)酵菌粉提取物能夠抑制炎癥過程中促炎因子NO、TNF-α、IL-6和IL-1β的過量分泌，其正己烷、氯仿、乙酸乙酯提取物均具有潛在的抗炎效果，其中天麻蜜環(huán)乙酸乙酯提取物既能保證良好的安全性，又具有顯著的抗炎活性，而對于天麻蜜環(huán)菌的抗炎作用機(jī)制以及抗炎活性成分尚未涉及。張紅霞等人發(fā)現(xiàn)抑制炎癥過程中NF-κB和MAPK信號通路的激活有助于減少炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的分泌[13]。目前已從天麻蜜環(huán)中分離出40多種化合物[14]，其中天麻蜜環(huán)水提取具有抗氧化和DNA保護(hù)作用[15]，蜜環(huán)菌菌索多糖AMP-1對大鼠糖尿病型白內(nèi)障具有預(yù)防和治療作用[16]，蜜環(huán)菌庚素能夠通過線粒體衰亡機(jī)制誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞凋亡，具有潛在的治療作用[17]。這提示我們進(jìn)一步加強(qiáng)天麻蜜環(huán)提取物抗炎作用機(jī)制及其藥效組成的研究對開發(fā)天麻蜜環(huán)這一傳統(tǒng)藥食用菌的抗炎應(yīng)用具有更加深遠(yuǎn)而廣泛的意義。