孫姍姍 ， 李 昕 ， 宋翠翠 ， 楊艷坤 ， 白仲虎 *

（1．糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無(wú)錫 214122；2．江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；3．江南大學(xué) 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122）

鐵蛋白（Ferritin，F(xiàn)ER）廣泛存在于動(dòng)、植物及微生物體內(nèi)，在肝臟、脾臟、骨髓中含量較高。1972年，Addison等人證實(shí)了可以在人的血清中利用放射免疫分析法檢測(cè)到鐵蛋白的存在[1]。血清鐵蛋白可結(jié)合一定量的鐵，在臨床上作為檢測(cè)體內(nèi)鐵儲(chǔ)存狀況及多種疾病判斷的常用指標(biāo)。鐵蛋白的含量可以作為判斷鐵缺乏[2]、成人Still病的指征[3]，可以作為反映慢性肝病的嚴(yán)重程度的臨床指標(biāo)[4]，血清鐵蛋白升高有助于乳腺癌[5]、肺癌[6]等惡性腫瘤[7]的臨床診斷，可作為預(yù)測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素[8]，能夠反映2型糖尿病患者的患病情況[9]，并用于預(yù)測(cè)體內(nèi)白血病殘留病灶[10]的輔助檢查，血清鐵蛋白的升高還可以作為女性骨密度降低的指標(biāo)[11]。

化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)（chemilumineseent immunoassay，CLIA）具有標(biāo)本用量少、穩(wěn)定性高、標(biāo)記物制備容易、不污染環(huán)境、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用在免疫診斷檢測(cè)中[12]。

作者使用鏈霉親和素包被微孔板，將一對(duì)抗體分別用生物素和辣根過(guò)氧化物酶 （Horse Reddish Peroxidase，HRP）標(biāo)記，利用生物素和親和素之間的高親和力，采用雙抗體夾心法，建立了快速簡(jiǎn)便的化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)方法[13]。

1 材料與方法

1.1 原料

兩株抗FER單克隆抗體 （包被抗體、標(biāo)記抗體）：購(gòu)自羅氏；96微孔板：購(gòu)自costar；生物素標(biāo)記試劑盒、生物素化 HRP：購(gòu)自 Thermo；BSA、鏈霉親和素、HRP標(biāo)記試劑盒：購(gòu)自Sigma；FER抗原為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品（WHO IS 94/572）；質(zhì)控血清為中國(guó)藥品生物制品檢定所產(chǎn)品；阻斷劑套裝：購(gòu)自Meridian；HABA試劑：購(gòu)自Thermo；底物：鹽城拜明生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；進(jìn)口試劑盒：羅氏（Roche）對(duì)照；NaIO4、醋酸鈉、NaBH4、乙二醇等：上海滬試產(chǎn)品；臨床檢測(cè)用血清樣本300份：來(lái)自北京解放軍301總醫(yī)院、山東省立醫(yī)院；健康人血清樣本400份：來(lái)自上海市仁濟(jì)醫(yī)院體檢人群。

1.2 儀器

化學(xué)發(fā)光免疫分析儀TZD-CL-200S：廈門(mén)天中達(dá)；電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海三發(fā)；Mix-1500微孔板振蕩器：上海漢林；超微量紫外分光光度計(jì)Q5000：美國(guó) Quawell；ST16R 離心機(jī)：Thermo Sorvall。

1.3 方法

1.3.1 鏈霉親和素包被（SAC，streptavidin coated）板的制備 取10 mg BSA，加入到1 mL的磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.0）中，加入 1.69 mg 生物素（相對(duì)分子質(zhì)量為556.59，間隔臂為22.4 ?），充分混勻，室溫偶聯(lián)1 h。將標(biāo)記好的生物素化牛血清白蛋白加入到Thermo脫鹽柱中純化脫鹽，用磷酸緩沖液作為洗脫液，去除游離的生物素。用pH 7.0的磷酸鹽緩沖液將上述Biotin-BSA稀釋成3 μg/mL的包被液，每孔200 μL，4℃過(guò)夜。將包被液傾去，洗液（含 5 g/L的 Tween-20）洗板。 加入 10 μg/mL的鏈霉親和素，每孔200 μL。加入封閉液（含2%BSA的磷酸緩沖液），200 μL每孔，4℃過(guò)夜。將封閉液傾去，板子晾干。

1.3.2 生物素化抗體的制備與純化 取1 mg的羅氏包被抗體，用超濾管超濾更換緩沖液為磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.0），最后收集到 1 mL 的體積。 加入約0.07 mg的生物素，充分混勻狀態(tài)下室溫偶聯(lián)1 h。

將上述標(biāo)記好生物素的抗體加入到Thermo的脫鹽柱中純化脫鹽，洗脫緩沖液為磷酸緩沖液。收集純化后的生物素抗體，通過(guò)Quawell的Q5000超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)量生物素抗體的在280 nm處的吸光度。蛋白質(zhì)回收率為95%，以HABA試劑檢驗(yàn)偶聯(lián)率為14.89。

1.3.3 HRP標(biāo)記抗體的制備 稱(chēng)取4 mg HRP溶于1 mL 去離子水中，加入 200 μL NaIO4（0.1 mol/L）溶液，室溫避光攪拌20 min，將反應(yīng)物置于醋酸鈉溶液（1 mmol/L，pH 4.4）中，4 ℃透析過(guò)夜，加入 4 μL乙二醇，室溫避光反應(yīng)30 min。加入8 mg羅氏標(biāo)記抗體，于碳酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH 9.5）中 4℃避光透析過(guò)夜，結(jié)合物加入0.1 mL NaBH4，混勻，4℃避光反應(yīng)2 h，攪拌狀態(tài)下加入等體積的飽和硫酸銨，4℃放置1 h，5 000 r/min離心15 min，棄上清液。沉淀用PBS溶解，加入等體積甘油于-20℃保存[14]。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)品的制備 用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 （含2‰HSA（Human serum albumin），2%的 2-氯乙酰胺，pH 7.6的磷酸緩沖液）將鐵蛋白（FER）國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成質(zhì)量濃度分別為 800、400、150、50、10、0 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分裝，-20℃凍存。

1.3.5 化學(xué)發(fā)光免疫分析實(shí)驗(yàn)原理與步驟 采用CLIA雙抗體夾心法體外定量檢測(cè)血清中的鐵蛋白的質(zhì)量濃度。在預(yù)包被了鏈霉親和素的微孔板中，加入標(biāo)準(zhǔn)品、血清樣品后，再加入生物素化鐵蛋白抗體，混合后孵育，使生物素化的鐵蛋白抗體與鐵蛋白形成免疫復(fù)合物并與包被板上的鏈霉親和素結(jié)合，洗滌去除未結(jié)合的物質(zhì)；再加入HRP酶標(biāo)抗體結(jié)合物，使之與前面形成的免疫復(fù)合物結(jié)合，再洗滌去除未結(jié)合的物質(zhì)，加入化學(xué)發(fā)光底物后，使用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀讀取相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度（Relative Light Unit，RLU）。

取SAC板，在孔中加入25 μL的標(biāo)準(zhǔn)品、樣品或質(zhì)控品，再加入100 μL的生物素標(biāo)記的FER抗體，混勻20 s，室溫孵育30 min。傾去液體，用洗液將板子洗5次，拍干。每孔加入100 μL的酶標(biāo)抗體，室溫孵育30 min后洗掉。加入含魯米諾的底物，每孔100 μL，化學(xué)發(fā)光免疫分析儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用3次曲線模型對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，根據(jù)已知不同質(zhì)量濃度的鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的RLU值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)曲線計(jì)算樣品中的鐵蛋白質(zhì)量濃度。

1.3.7 本法準(zhǔn)確度指標(biāo) 使用質(zhì)量濃度為50 ng/mL和200 ng/mL的鐵蛋白質(zhì)控品作為樣本，按照上述實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行檢測(cè)，各重復(fù)測(cè)定3次，利用3次曲線模型擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)量各質(zhì)量濃度結(jié)果的平均值記為（Mi），根據(jù)公式（1）分別計(jì)算相對(duì)偏差（Bi）

Bi=（Mi-T）/T×100%

式中：Bi為相對(duì)偏差；Mi為測(cè)量質(zhì)量濃度的平均值；T為標(biāo)定質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗體質(zhì)量濃度的確定

首先收集純化后的生物素化牛血清白蛋白，利用HABA試劑檢驗(yàn)生物素偶聯(lián)率為18.31。按照SAC板的制備方法制備SAC板。通過(guò)SAC板的生物素結(jié)合量測(cè)試來(lái)確定生物素化抗體的結(jié)合量。在SAC 板上分別加入不同質(zhì)量濃度（0.5～10 μg/mL）生物素化抗體后，室溫孵育30 min，再加入生物素化HRP，室溫孵育30 min，洗板，加入底物并檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。表明在2 μg/mL時(shí)生物素抗體在SAC板上的結(jié)合量已經(jīng)達(dá)到飽和。后續(xù)實(shí)驗(yàn)即選用2 μg/mL作為生物素化抗體的質(zhì)量濃度。確定生物素化抗體質(zhì)量濃度后，通過(guò)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線上不同質(zhì)量濃度點(diǎn)的RLU，考察酶標(biāo)抗體在1∶500～1∶40 000倍稀釋度間合適的稀釋度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在1∶2 000的稀釋倍數(shù)時(shí)，800 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品的光子數(shù)在十萬(wàn)到百萬(wàn)之間，零值和低值能較好的拉開(kāi)梯度。故本實(shí)驗(yàn)抗體對(duì)最佳反應(yīng)質(zhì)量濃度為：生物素抗體質(zhì)量濃度為 2 μg/mL，酶標(biāo)抗體稀釋倍數(shù)為 1∶2 000。

圖1 生物素化抗體在SAC板上的結(jié)合量測(cè)試Fig.1 Binding capacity of biotinylated antibody on SAC microplate

2.2 阻斷嗜異性抗體

嗜異性抗體（heterophile antibody，HA）是由已知或未知抗原物質(zhì)刺激人體產(chǎn)生的一類(lèi)能與多個(gè)物種免疫球蛋白發(fā)生相對(duì)弱結(jié)合的多重特異性免疫球蛋白[15]。目前免疫試劑所使用的抗體大多來(lái)自于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，HA由于能與許多動(dòng)物來(lái)源的抗體相結(jié)合而干擾測(cè)定結(jié)果，影響臨床判斷，容易產(chǎn)生假陽(yáng)性假陰性或其他干擾，導(dǎo)致誤診。研究證實(shí)，在健康人群中，約3%～15%的人體內(nèi)含有HA[16]。目前消除嗜異性抗體干擾的方法主要有使用阻斷劑、熱處理及其他吸附等。熱處理由于可能同時(shí)破壞分析物質(zhì)而不被廣泛使用，吸附處理有一定的效果。而使用阻斷封閉劑能降低大部分的嗜異性抗體干擾。阻斷封閉劑是一類(lèi)旨在消除干擾抗體對(duì)于免疫檢測(cè)結(jié)果不利影響的專(zhuān)門(mén)試劑，分為非特異性和特異性?xún)深?lèi)。非特異性阻斷劑主要為正常動(dòng)物的免疫球蛋白，特異性阻斷劑主要為針對(duì)人嗜異性抗體設(shè)計(jì)的結(jié)合劑。目前兩種阻斷劑都有商品化的試劑如Meridian公司的主動(dòng)型阻斷劑TRU Block和被動(dòng)型阻斷劑。

通過(guò)臨床樣本檢測(cè)來(lái)篩選阻斷劑及其加入量。取經(jīng)臨床監(jiān)測(cè)鑒定含有HA的的臨床樣本，分別加入不同劑量的TRU Block或血清，見(jiàn)圖2。

圖 2 不同量的 TRU Block（μg/mL）和小鼠血清（%）對(duì)干擾的排除情況Fig.2 Elimination ofHA with various Blockersconcentration

結(jié)果顯示，小鼠血清在量足夠多（4%）的時(shí)候能夠排除部分干擾物如人抗鼠抗體（HAMA，human anti-mouse antibody），但排除干擾物能力有限，原因可能是因?yàn)椴荒芘懦渌麆?dòng)物源性的嗜異性抗體。TRU Block中含有能夠阻斷人抗鼠抗體及其他嗜異性抗體的成分，在本實(shí)驗(yàn)中在250 μg/mL時(shí)已能較好的排除干擾。后續(xù)臨床實(shí)驗(yàn)中，將TRU Block統(tǒng)一直接加入到生物素化抗體中使用，以排除部分樣本中的HA干擾。

2.3 本法主要技術(shù)參數(shù)

2.3.1 準(zhǔn)確度 根據(jù)準(zhǔn)確度的指標(biāo)，將標(biāo)準(zhǔn)品與質(zhì)控品同時(shí)測(cè)定，計(jì)算實(shí)測(cè)質(zhì)控品的質(zhì)量濃度與標(biāo)示質(zhì)量濃度的差值，結(jié)果見(jiàn)表1。

說(shuō)明本法采用鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)，重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度高。

表1 本法準(zhǔn)確度檢測(cè)Table 1 Test of accuracy of the prepared FER detection method

2.3.2 線性范圍 在10～800 ng/mL范圍內(nèi)測(cè)定不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，檢測(cè)的結(jié)果用三次曲線模型進(jìn)行擬合，計(jì)算相關(guān)系數(shù)（r）值為0.999 4。

2.3.3 靈敏度 平行測(cè)定10孔0 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品（標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液）的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度（RLU），計(jì)算RLU的平均值（M）與RLU標(biāo)準(zhǔn)差（SD）。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出（M+2SD）對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度值即為靈敏度0.2 ng/mL。

2.3.4 精密度 對(duì)中國(guó)食品藥品檢定研究院提供的高、中、低（200、100、50 ng/mL）三個(gè)水平的質(zhì)控品進(jìn)行測(cè)定，各重復(fù)檢測(cè)10次，計(jì)算各質(zhì)控品的檢測(cè)值，并計(jì)算各質(zhì)控的平均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)（CV%）。批內(nèi)變異系數(shù)、三批試劑盒間的批間變異系數(shù)見(jiàn)表2。試劑盒批內(nèi)精密度皆小于10%，批間精密度皆小于15%，滿(mǎn)足2010版藥典中生物制品檢定要求。

表2 批內(nèi)及批間精密度Table 2 Test of precision of the prepared FER detection method

2.3.5 特異性 向血清樣本中加入不同質(zhì)量濃度的干擾物質(zhì)：癌胚抗原（CEA）、人白蛋白、肝鐵蛋白、脾鐵蛋白、人類(lèi)心臟鐵蛋白、以及血紅蛋白。交叉反應(yīng)結(jié)果用達(dá)到相同的光強(qiáng)度時(shí)干擾物質(zhì)量和鐵蛋白量的比值來(lái)表示，交叉反應(yīng)結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明，試劑盒特異性良好，非鐵蛋白類(lèi)的蛋白質(zhì)基本不可檢出，肝臟、脾臟鐵蛋白可完全檢出，與鐵蛋白的水平能夠輔助診斷乙型肝炎、脂肪肝等肝臟疾病一致。

表3 交叉反應(yīng)考察結(jié)果Table 3 Results of cross-reaction

2.3.6 穩(wěn)定性 對(duì)試劑盒各組分進(jìn)行37℃、9 d熱穩(wěn)定性考察，結(jié)果見(jiàn)表4。熱穩(wěn)定性結(jié)果與4℃保存的試劑盒相比，標(biāo)準(zhǔn)品的RLU下降幅度低于10%，靈敏度為0.2 ng/mL，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)r為0.998 0，批內(nèi)及批間精密度分別為3.21%～4.68%，4.27%～7.39%。

加速穩(wěn)定性試驗(yàn)中，于37℃存放的試劑盒各組分在9 d后下降幅度低于10%，說(shuō)明本法熱穩(wěn)定性各項(xiàng)指標(biāo)符合要求，此有效期可以滿(mǎn)足正常實(shí)驗(yàn)室及臨床需求。

表4 穩(wěn)定性考察結(jié)果Table 4 Results of heat stability test

2.3.7 參考范圍的測(cè)定 對(duì)400例正常人臨床血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，其中男性245人（16～82歲），女性155人（19～76歲），根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)C28-A2[17]要求，建立自制試劑盒的正常參考范圍為：男性 30～400 ng/mL，女性 15～300 ng/mL。該參考范圍是基于一定數(shù)量的正常人血清樣本確定的，由于地理、人種、性別及年齡等差異，建議各實(shí)驗(yàn)室建立自己的正常參考范圍。

2.4 與其他試劑盒及檢測(cè)方法的比較

同時(shí)用本法與羅氏試劑盒檢測(cè)臨床已確診的300份血清樣本，分析計(jì)算相關(guān)系數(shù)，對(duì)比結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 本法與羅氏進(jìn)口試劑盒相關(guān)性Fig.3 Linear correlation between the prepared methodand Roche kit

3 結(jié)語(yǔ)

作者采用了鏈霉親和素-生物素化學(xué)發(fā)光反應(yīng)系統(tǒng)，先將鏈霉親和素包被在96孔發(fā)光板孔中，使其主動(dòng)吸附生物素化捕獲抗體。這種通過(guò)鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)的間接包被法，吸附的抗體比較牢固和均一，不僅使包被的抗體量增加，單位面積的抗體增多，而且可以使其與抗原的結(jié)合位點(diǎn)充分暴露，可明顯減少非特異性吸附，大大提高了靈敏度及測(cè)定結(jié)果的可靠性、重復(fù)性。

本法測(cè)定鐵蛋白含量采用雙抗夾心二步法，所需樣本量少（25 μL），反應(yīng)時(shí)間短，操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，結(jié)果穩(wěn)定，測(cè)量范圍滿(mǎn)足臨床要求，適用于大批量檢測(cè)，可替代國(guó)外同類(lèi)試劑盒。