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      蘭州百合糖蛋白LGP-2的提取純化及結(jié)構(gòu)表征研究*

      2019-05-25 03:31:44王鋮博慕星星石繼鵬陳佩佩
      生物學(xué)通報(bào) 2019年4期
      關(guān)鍵詞:主鏈糖蛋白分子量

      王鋮博 慕星星 石繼鵬 陳佩佩 張 繼

      (西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 甘肅蘭州 730070)

      蘭州百合(Lilium davidii var. unicolor Salisb.)是百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)川百合的一個(gè)變種,為多年生鱗莖類草本,植物具有很高的食用、藥用和觀賞價(jià)值,是我國衛(wèi)生部首批審批通過的藥食兩用植物之一[1]。研究表明,蘭州百合中富含糖、蛋白質(zhì)、維生素、生物堿、黃酮等生物活性物 質(zhì)[2]。

      糖蛋白(glycoprotein)是糖類與多肽或蛋白質(zhì)通過共價(jià)鍵連接而形成的結(jié)合蛋白, 是生物體內(nèi)重要的一類大分子[3]。糖蛋白種類繁多,廣泛存在于生物體內(nèi),研究表明,80%以上的蛋白質(zhì)都是糖蛋白,包括許多激素、免疫球蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、載體蛋白、受體等。 糖蛋白具有多種生物學(xué)活性,例如抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤等[4-5]。

      目前,國內(nèi)外學(xué)者對(duì)蘭州百合中糖和蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)已進(jìn)行很多研究,但對(duì)生物活性大分子糖蛋白,卻鮮有文獻(xiàn)進(jìn)行報(bào)道。 本文提取純化蘭州百合糖蛋白(glycoprotein of Lilium davidii var.unicolor Salisb.,LGP),并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征,可為LGP 的后續(xù)研究提供參考, 也為蘭州百合的進(jìn)一步開發(fā)利用提供更加廣闊的前景。

      1 材料和儀器

      1.1 材料 蘭州百合采自甘肅省蘭州市七里河區(qū)西果園百合種植基地。

      1.2 主要儀器 Nicoletis10 傅里葉變換紅外光譜儀(美國Thermo 公司),JD500-3 電子天平(沈陽龍騰電子有限公司),UV 9100b 紫外-可見分光光度計(jì)(北京萊伯泰科儀器有限公司),LGJ-18S 真空冷凍干燥機(jī)(北京松源華興科技發(fā)展有限公司),L-535R 離心機(jī)(湘儀離心機(jī)廠),JRA-6 數(shù)顯磁力攪拌水浴鍋(金壇市杰瑞爾電器有限公司),BSZ-100 自動(dòng)部分收集器(上海青浦滬西儀器廠),HL-2恒流泵(上海滬西分析儀器廠有限公司)。

      1.3 試劑 石油醚(沸程30 ~60℃,煙臺(tái)市雙雙化工有限公司),無水乙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),硫酸銨(萊陽市雙雙化工有限公司),苯酚(中國醫(yī)藥集團(tuán)上?;瘜W(xué)試劑公司),濃硫酸(廣州德樹化工有限公司),溴化鉀(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所),Sephadex G-200 凝膠(北京索萊寶科技有限公司),DEAE-Cellulose 52 陰離子交換柱(北京索萊寶科技有限公司),MD77 透析袋 (截留分子量8 000~14 000,北京索萊寶科技有限公司)。

      2 實(shí)驗(yàn)方法

      2.1 蘭州百合糖蛋白的提取純化

      2.1.1 LGP 的提?。?]將新鮮蘭州百合鱗片洗凈后,于60℃烘箱中烘干后粉碎,過100 目篩;使用pH=7.4 的0.01 mol/L PBS 緩沖溶液在50℃水浴條件下提取百合糖蛋白,提取時(shí)間為2 h;提取液經(jīng)4 000 r/min 離心,取上清液40℃濃縮;濃縮液加入硫酸銨鹽析,離心,收集沉淀;沉淀復(fù)溶后以蒸餾水透析除去其中的鹽分, 滴加10% BaCl2溶液檢測透析終點(diǎn); 除鹽后的樣品使用真空冷凍干燥,得到LGP 的粗提物。

      2.1.2 LGP 粗品的純化[7]將糖蛋白粗品溶于pH =7.4 的PBS 緩 沖溶液 中,上樣 至Sephadex G-200 層析柱,使用超純水進(jìn)行洗脫,上樣量為20 mL,流速為0.5 mL/min,考馬斯亮藍(lán)法595 nm處檢測蛋白質(zhì)流出,苯酚-硫酸法490 nm 處檢測多糖,收集多糖和蛋白質(zhì)均檢出部分。

      上樣至DEAE-Cellulose 52 陰離子交換柱,NaCl溶液梯度洗脫(0 mol/L、0.1 mol/L、0.2 mol/L、0.4 mol/L、0.6 mol/L、0.8 mol/L 及1.0 mol/L),考馬斯亮藍(lán)法和苯酚-硫酸法測定蛋白質(zhì)和多糖含量,按照洗脫梯度收集兩者均檢出管。 去離子水透析4 d,濃縮后真空冷凍干燥,即獲得純化LGP。

      2.2 蘭州百合糖蛋白的結(jié)構(gòu)表征

      2.2.1 高效液相色譜(HPLC)分析[8]高效液相色譜系統(tǒng),Silversit C18 色譜柱(250×416 mm,5 μm),紫外檢測波長280 nm,流動(dòng)相為雙蒸水,進(jìn)樣量20 μL,柱溫30℃,流速為0.7 mL/min,記錄樣品色譜曲線。

      2.2.2 紅外光譜(FT-IR)分析[9]LGP 的紅外光譜分析采用KBr 壓片法。 取充分干燥的LGP 與KBr 按質(zhì)量比1∶100 進(jìn)行壓片, 用Thermo Nicolet iS10 紅外光譜儀在400~4 000 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)掃描16 次,分辨率為4 cm-1。

      2.2.3 分子量測定 LGP 分子量采用體積排阻色譜-光散射聯(lián)用(SEC-LLS)進(jìn)行測定。 檢測器為多角度激光光散射儀(DAWN Eos,Wyatt Technology Co.,USA),λ=690 nm; 色 譜 柱 為UltrahydrogelTMcolumn(7.8×300 mm,Waters,USA);以及示差折光檢測器 (DAWN Eos,Wyatt Technology Co.,USA)。檢測樣品濃度為2.0 mg/mL, 樣品檢測前經(jīng)孔徑為0.2 μm 過濾器過濾。

      2.2.4 糖肽鍵類型[10]糖蛋白的糖肽鍵類型判斷方法,主要采用β- 消去反應(yīng)。 將LGP 置于0.2 mol/L NaOH 溶液中,于45℃保溫3 h,測定其紫外吸收光譜, 同時(shí)以未用堿處理的相同濃度LGP 為對(duì)照,測定其紫外吸收光譜。

      2.2.5 圓二色性光譜(CD)分析[11]LGP 樣品使用蒸餾水溶解,配制成一定濃度的溶液,用圓二色性光譜儀觀察其不對(duì)稱活性, 以判斷其蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)。

      3 結(jié)果與分析

      3.1 百合糖蛋白的純化 由圖1 可知,LGP 粗品經(jīng)Sephadex G-200 柱初步純化后,糖含量和蛋白質(zhì)含量相關(guān)聯(lián)的高峰只有一個(gè), 收集后做進(jìn)一步純化。

      圖1 蘭州百合糖蛋白(LGP)的Sephadex G-200 洗脫曲線

      圖2 為LGP 的DEAE-Cellulose 52 柱洗脫曲線。如圖所示,經(jīng)NaCl 溶液梯度洗脫后,收集到2 個(gè)純化糖蛋白組分,分別命名為LGP-1 和LGP-2。 其中LGP-1 由超純水洗脫獲得,LGP-2 由0.1 mol/L NaCl 溶液洗脫獲得。

      本文以LGP-2 為研究對(duì)象,對(duì)其做了一系列的結(jié)構(gòu)表征。

      圖2 蘭州百合糖蛋白(LGP)的DEAE-Cellulose 52 洗脫曲線

      3.2 結(jié)構(gòu)表征

      3.2.1 高效液相色譜分析 圖3 為LGP-2 的HPLC 色譜圖。 在紫外280 nm 檢測條件下,LGP-2在保留時(shí)間為2.50667 min 處出現(xiàn)一個(gè)單一對(duì)稱洗脫峰,說明得到的LGP-2 是單一組分的糖蛋白[12]。

      圖3 LGP-2 組分的HPLC 色譜圖

      3.2.2 紅外圖譜分析 由圖4 可知,LGP-2 在4 000~400 cm-1范圍內(nèi)的紅外吸收光譜表現(xiàn)處典型的多糖和蛋白質(zhì)吸收峰。其中,波數(shù)在3 700 cm-1到3 200 cm-1之間的強(qiáng)而寬的吸收峰是O-H 的伸縮振動(dòng)峰和N-H 基團(tuán)的伸縮振動(dòng);2 972.20 cm-1和2 923.11 cm-1處則為C-H 的伸縮振動(dòng)和彎曲振動(dòng)[13];1 635.56 cm-1為酰胺基團(tuán)中的C=O 的吸收峰[14];1 384.62 cm-1處的峰則證明了有羧基(-COO-)的存在[15];1 048.65 cm-1的吸收峰則表明糖鏈存在吡喃糖構(gòu)型;876.72 cm-1則表明LGP-2 中存在β-糖苷鍵[10]。

      圖4 LGP-2 的紅外吸收光譜圖

      3.2.3 糖肽鍵類型 O-糖肽鍵在稀堿環(huán)境中易發(fā)生β-消去反應(yīng),導(dǎo)致與糖鏈連接的絲氨酸和蘇氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)棣?氨基丙烯酸和α-氨基丁烯酸,在240 nm 處產(chǎn)生明顯的紫外吸收,因此,對(duì)比樣品在反應(yīng)前后在240 nm 處的紫外吸收有無變化即可確定糖蛋白中是否存在O- 糖肽鍵[16]。

      圖5 β-消去反應(yīng)前后LGP-2 的紫外掃描圖

      由圖5可知,LGP-2 經(jīng)稀堿處理后,紫外240 nm 波長處吸光值發(fā)生了明顯的變化, 發(fā)生了β-消去反應(yīng),從而說明LGP-2 含有O-連接糖肽鍵。

      3.2.4 分子量測定 通過SEC-LLS 自帶軟件分析可知,LGP-2 重均分子量(Mw)為9.311×104,數(shù)均分子量(Mn)為3.685×104,多分散系數(shù)(Mw/Mn)為2.527。

      3.2.5 圓二色性光譜 一般將蛋白質(zhì)的圓二色性光譜分為遠(yuǎn)紫外區(qū)(185~245 nm)和近紫外區(qū)(245~320 nm)。 遠(yuǎn)紫外區(qū)是肽鍵的吸收范圍,反映了主鏈構(gòu)象。在遠(yuǎn)紫外區(qū),天然蛋白質(zhì)的圓二光譜包括一個(gè)正峰(在190 nm 左右)和一個(gè)負(fù)槽(在205~235 nm 范圍)。 其中負(fù)槽的形狀與主鏈構(gòu)象密切相關(guān)。

      圖6 LGP-2 的圓二光譜圖

      從圖6 可以看出,LGP-2 在196 nm 左右有一個(gè)正峰, 在210~220 nm 之間有一個(gè)負(fù)槽, 說明LGP-2 的主鏈結(jié)構(gòu)以β-折疊為主[11]。

      4 結(jié)論

      本實(shí)驗(yàn)以蘭州百合為原料提取其中糖蛋白,經(jīng)過DEAE-52 和Sephadex G-200 色譜柱分離得到LGP-1 和LGP-2 2 種糖蛋白組分。經(jīng)過FT-IR推斷糖蛋白LGP-2 官能團(tuán)結(jié)構(gòu)、β-消去反應(yīng)確定糖肽鍵類型、CD 光譜分析主鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)、SECLLS 測定糖蛋白分子量。結(jié)果表明:LGP-2 具有多糖和蛋白質(zhì)的特征吸收峰,且糖鏈中含有吡喃環(huán),以β-糖苷鍵連接; 糖和蛋白質(zhì)之間存在O-連接的糖肽鍵; 蛋白質(zhì)主鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)以β-折疊為主;LGP-2 重均分子量為9.311×104。

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