鄧新武 黃金光 張永強 鄧 璨 歐陽名洋 周可人

（湖南省郴州市宜章縣第一中學 湖南郴州 424200）

藤茶， 學名為顯齒蛇葡萄（Ampelopisis grossedentata），是一種典型的類茶植物，俗稱莓茶、山甜茶、白茶、甘露茶、白毛猴等，主要分布于廣西、廣東、云南、貴州、湖南、湖北、江西、福建等省區(qū)［1－2］。 近年來，國內(nèi)外對藤茶的研究，主要集中在藤茶中黃酮類、 蛇葡萄素和二氫楊梅素等有效成分的分離和提取，以及藤茶在抗氧化、降血壓和調(diào)節(jié)免疫等方面的功效［3］。

有研究表明藤茶中的二氫楊梅素對大腸桿菌、金色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌均有抑制作用［4］。 藤茶對酵母菌、毛霉、青霉、曲霉等真菌是否也有抑制作用？目前并沒有相關(guān)文獻研究報道。本研究主要探究藤茶對酵母菌、毛霉、青霉和黑曲霉等真菌的抑制作用，具有一定的創(chuàng)新性和實用性。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料 饅頭、牛奶、藤茶、發(fā)霉的橘子皮、發(fā)霉的面包等。

1.2 試劑與儀器 實驗試劑包括馬鈴薯－肉湯培養(yǎng)基（PDA）、察氏培養(yǎng)基、瓊脂、納他霉素、酒精和蒸餾水；實驗儀器包括高壓蒸汽滅菌鍋、干熱滅菌箱、恒溫生化培養(yǎng)箱、搖床培養(yǎng)箱、超凈工作臺、電子天平、數(shù)碼光學顯微鏡、超聲波細胞破碎儀等。

1.3 實驗方法

1.3.1 微生物的培養(yǎng)、純化及初步鑒定 無菌條件下，分別從發(fā)霉的橘子皮、發(fā)霉的面包中挑取菌落接種至EP 管， 將EP 管置于振蕩器上振蕩，制成菌懸液。 將稀釋后的菌懸液涂布至PDA 培養(yǎng)基上，28℃恒溫箱培養(yǎng)2～3 d。 長出單菌落后，肉眼觀察菌落的形狀、大小、隆起程度和顏色等方面的特征。挑取單菌落于顯微鏡下觀察霉菌形態(tài)特征，包括菌絲結(jié)構(gòu)、孢子特點、孢子囊的形態(tài)，進行初步鑒定。

1.3.2 不同提取方法及不同濃度的藤茶浸出液抑菌作用研究 按照表1 的方法制備藤茶常溫無菌水提取物A、藤茶沸水提取物B、藤茶酒精提取物C、D 和E， 藤茶酒精提取物C、D 和E 的質(zhì)量濃度分別為0.05 g／mL、0.1 g／mL 和0.15 g／mL。以上幾種溶液使用前均進行過濾除菌處理。

表1 不同提取方法及其不同濃度的藤茶溶液

將分離純化的酵母菌、青霉、毛霉和黑曲霉菌種活化后， 用無菌水稀釋成含菌數(shù)約為108個/mL的菌懸液， 再用微量移液器吸取100 μL 菌懸液均勻涂布至PDA 固體平板。 用直徑為7 mm 的無菌打孔器在每個PDA 平板十字形對稱打4 個孔，按圖1 所示，每一菌種每孔滴加藤茶提取物100 μL，28℃恒溫箱培養(yǎng)3 d，測定抑菌圈的大小，每個菌種做5 個平行實驗。 抑菌圈大小=抑菌圈直徑－酒精的空白對照的抑菌圈直徑－打孔器直徑。

圖1 PDA 平板打孔示意圖（字母代表提取物類型）

1.3.3 食品防腐實驗

1）分別量取150 mL 盒裝純牛奶倒入2 個燒杯中，用量筒量取25 mL 藤茶溶液倒入其中一個燒杯中，攪拌均勻，另一個燒杯加25 mL 蒸餾水作為對照組，將2 個燒杯置于昏暗室內(nèi)。

2）取新鮮饅頭掰成大小大致相等的兩塊，將其中一塊完全浸入藤茶溶液中， 另一塊浸入等量的蒸餾水中，處理10～15 s 秒后取出，將2 塊饅頭分別放在經(jīng)高溫殺毒后的2 個餐盤中， 置于昏暗的房間角落。 每天18∶30 觀察牛奶及饅頭腐敗情況、有無異味，并記錄結(jié)果。

圖2 酵母菌顯微照片（放大倍數(shù)：10×16）

圖3 酵母菌PDA 平板菌落

圖4 青霉菌顯微照片（放大倍數(shù)：10×16）

圖5 青霉菌查氏平板菌落

圖6 黑曲霉顯微照片（放大倍數(shù)：10×16）

圖7 黑曲霉查氏平板菌落

圖8 毛霉菌顯微照片（放大倍數(shù)：10×16）

圖9 毛霉菌PDA 平板菌落

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物的初步鑒定 通過觀察菌落特征及顯微鏡下觀察（圖2～圖9），分離出酵母菌、青霉菌、黑曲霉和毛霉。

2.2 抑菌圈實驗結(jié)果

2.2.1 藤茶浸出液不同提取方法抑菌作用研究3 種不同提取方法的抑菌結(jié)果如表2 所示。 表中所列數(shù)據(jù)為5 個重復平板抑菌圈直徑的平均值（剔除了個別相差較大的數(shù)據(jù)）。

表2 不同提取方法的提取液對實驗菌種的抑制作用

由表2 數(shù)據(jù)分析可知，3 種提取方法中，滅菌的常溫蒸餾水（提取物A）不具有抑菌的作用，75%酒精（提取物C）效果最佳，沸水次之。沸水提取效果較差，可能與高溫破壞相應物質(zhì)結(jié)構(gòu)有關(guān)，需進一步探究。

2.2.2 不同濃度的藤茶提取物抑菌作用研究由表3 數(shù)據(jù)分析可知， 不同濃度的藤茶浸出液對4 種實驗菌種都有抑制作用， 其中對毛霉的抑制作用較弱，而對酵母菌的抑制作用較強。不同濃度的藤茶浸出液對同一菌種的抑制作用相差不大。典型的抑菌圈結(jié)果見圖10。

表3 不同濃度的藤茶提取液對試驗菌種的抑制作用

圖10 酵母菌抑菌結(jié)果

2.3 食品防腐實驗 食品防腐實驗結(jié)果見表4。進行該實驗的時間為2017年12月初，日平均溫度約14℃， 所以普通的饅頭和牛奶都不易變質(zhì)；而添加了藤茶溶液的饅頭、牛奶更不容易變質(zhì)，說明藤茶溶液確實具有一定的防腐抑菌作用。

表4 藤茶浸出液對食品防腐的結(jié)果

3 討論與展望

本實驗以白酵母、青霉、毛霉和黑曲霉作為實驗菌種， 探究了藤茶浸出液對這些菌種的抑制作用。 由于各平板中真菌生長速度不同，統(tǒng)計數(shù)據(jù)很不均一，有些平板數(shù)據(jù)差別較大，可能與滴加的藤茶溶液有關(guān)，也可能是滴加菌液后，涂布平板不均勻?qū)е碌?。多次重復的結(jié)果都表明藤茶浸出液對酵母菌有較強的抑制作用， 而對毛霉抑制作用較弱，對青霉和黑曲霉也有一定的抑制作用。

藤茶能抑制酵母菌、青霉菌、毛霉和黑曲霉等微生物的生長，可以作為防腐劑開發(fā)利用，具有一定的潛在價值。 本研究小組計劃下一階段采用乙酸乙酯或超聲波細胞破碎儀提取藤茶中的有效成分，進一步地分離提純，分析究竟是哪些物質(zhì)或物質(zhì)組合具有抑菌作用。 藤茶為天然植物（中藥），是生物源防腐劑， 既可達到抑菌的效果又不會對人體產(chǎn)生不利影響，可廣泛用于食品添加劑、衣物防腐劑等。