(齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

醇溶蛋白是存在于植物種子中的一種儲(chǔ)藏蛋白，目前對(duì)于小麥、玉米、高粱等植物醇溶蛋白的提取及應(yīng)用研究都有較多的報(bào)道[1-3]，但對(duì)豆類種子醇溶蛋白的相關(guān)研究較少。本實(shí)驗(yàn)采用2種不同的提取體系對(duì)大豆種子醇溶蛋白進(jìn)行提取，并進(jìn)行了SDS-PAGE體系的建立，旨在對(duì)豆類作物醇溶蛋白的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料為墾農(nóng)16大豆種子，市購(gòu)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

采用2個(gè)混合提取體系提取大豆種子醇溶蛋白，每一體系均采用正交試驗(yàn)，設(shè)計(jì)三水平四因素試驗(yàn)(見(jiàn)表1)，提取大豆醇溶蛋白。提取后采用考馬斯亮藍(lán)G 250法[4]測(cè)定體系中醇溶蛋白濃度。

提取體系Ⅰ：A.55 mL乙二醇+15 mL正丙醇；B.65 mL乙二醇+15 mL正丙醇；C. 75 mL乙二醇+15 mL正丙醇，各加蒸餾水至100 mL；

提取體系Ⅱ：A.55 mL乙二醇+25 mL正丙醇、B.55 mL乙二醇+35 mL丙醇、C.55 mL乙二醇+45 mL正丙醇，各加蒸餾水至100 mL。

電泳實(shí)驗(yàn)為SDS-PAGE體系[4]，濃縮膠濃度為4%，分離膠濃度為10%，上樣量為19μL。

表1 L9表

試管號(hào)固液比(g/mL)溫度(℃)時(shí)間(h)提取液濃度(%)11(1∶10)1(30)1(1)1(A)21(1∶10)2(40)2(2)2(B)31(1∶10)3(20)3(3)3(C)42(1∶15)1(30)2(2)3(C)52(1∶15)2(40)3(3)1(A)62(1∶15)3(20)1(1)2(B)73(1∶20)1(30)3(3)2(B)83(1∶20)2(40)1(1)3(C)93(1∶20)3(20)2(2)1(A)

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆醇溶蛋白提取分析

圖1是提取體系Ⅰ提取大豆種子醇溶蛋白實(shí)驗(yàn)結(jié)果，通過(guò)各因素對(duì)大豆種子醇溶蛋白提取的極差計(jì)算可知，4種因素對(duì)于提取的影響是不同的，其中對(duì)于提取有較大影響的因素是提取時(shí)間，影響較小的因素是提取溫度，固液比和提取液濃度對(duì)提取的影響相差無(wú)幾。圖2是提取體系Ⅱ各因素對(duì)大豆種子醇溶蛋白提取的極差計(jì)算，與提取體系Ⅰ相同，4個(gè)因素中同樣表現(xiàn)出提取時(shí)間對(duì)醇溶蛋白提取有較大影響，而溫度對(duì)于提取的影響較小。

圖1 提取體系Ⅰ提取大豆醇溶蛋白各因素極差

圖2 提取體系Ⅱ提取大豆醇溶蛋白各因素極差

2.2 SDS-PAGE分析

圖3、圖4分別是2個(gè)不同提取體系提取大豆醇溶蛋白SDS-PAGE圖譜，上樣量均為19μL。提取體系Ⅰ的電泳圖譜中每1個(gè)泳道條帶均較清晰，差別不大。而提取體系Ⅱ的電泳圖譜則表現(xiàn)出不同的泳道有所不同，并且清晰度較差。

圖3 提取體系Ⅰ電泳圖譜

圖4 提取體系Ⅱ電泳圖譜

3 討論與結(jié)論

醇溶蛋白被定義為可以溶于乙醇等醇類物質(zhì)的一類蛋白，通常是由分子量為30～90 kDa不同的亞基所構(gòu)成[5]。不同作物種子中所含的醇溶蛋白有不同的亞基構(gòu)成及結(jié)構(gòu)，因此在不同體系中溶解性是不同的。對(duì)于大豆種子醇溶蛋白的提取所設(shè)置的4個(gè)因素中，2個(gè)提取體系均表現(xiàn)為提取時(shí)間為較大影響因素，而提取溫度為較小影響因素，與之前的研究有所不同[6]。

在先前的研究中發(fā)現(xiàn)，大豆種子醇溶蛋白在不同的提取劑中有不同的溶解性，其中用乙二醇提取大豆種子醇溶蛋白后進(jìn)行SDS-PAGE效果較好[6]。本次研究采用了混合體系對(duì)大豆種子醇溶蛋白進(jìn)行提取，其中包括2種物質(zhì)：乙二醇和正丙醇。提取體系Ⅰ中正丙醇含量不變，均為15 mL，乙二醇含量分別為55，65 mL和75 mL；提取體系Ⅱ中乙二醇含量不變，均為55 mL，正丙醇分別為15，25 mL和35 mL，結(jié)果顯示，提取體系Ⅰ提取大豆醇溶蛋白SDS-PAGE效果較好，而提取體系Ⅱ提取大豆種子醇溶蛋白SDS-PAGE效果不佳。因此認(rèn)為，正丙醇的濃度對(duì)大豆種子醇溶蛋白的提取及SDS-PAGE有一定的影響，在一定的提取體系中正丙醇濃度相對(duì)較小的情況下有利于大豆種子醇溶蛋白的提取及SDS-PAGE，而正丙醇濃度相對(duì)較高時(shí)則不利于大豆種子醇溶蛋白提取及SDS-PAGE體系的優(yōu)化。