劉冉 ，葛魯鄒 ，張海東 ，趙東 ，侯偉良 ，鄂曉霏 ，于天水

（1.司法文明協(xié)同創(chuàng)新中心，北京 100088；2.中國(guó)政法大學(xué) 證據(jù)科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100192；3.威海市公安局高區(qū)分局，山東 威海 264200）

骨骼肌分布廣泛，是暴力損傷中極易受累的器官，因而在實(shí)踐中骨骼肌損傷發(fā)生率較高，是鑒定實(shí)踐中常見(jiàn)的損傷類型。骨骼肌損傷修復(fù)機(jī)制、骨骼肌損傷形成時(shí)間以及骨骼肌損傷程度判斷一直受到法醫(yī)學(xué)工作者重視。其中骨骼肌損傷形成時(shí)間推斷對(duì)刑事案件偵查具有重要意義，然而，準(zhǔn)確地推斷骨骼肌損傷時(shí)間一直是法醫(yī)學(xué)鑒定中的難題。本課題組前期相關(guān)研究[1]未考慮死后環(huán)境因素（溫度與濕度）對(duì)所研究指標(biāo)的影響，亦未考慮所研究指標(biāo)分別在生前傷和死后傷中的表達(dá)情況。鑒于以上問(wèn)題，本課題組將尋找參與骨骼肌損傷修復(fù)過(guò)程、死后表達(dá)具有良好的時(shí)間相關(guān)性以及可以鑒別生前傷與死后傷的指標(biāo)，擬建立推斷骨骼肌損傷時(shí)間相關(guān)參考指標(biāo)的數(shù)據(jù)庫(kù)，利用多指標(biāo)對(duì)法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中的骨骼肌損傷時(shí)間進(jìn)行準(zhǔn)確推斷。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）是成纖維細(xì)胞的主要趨化因子，是直接誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞（fibroblast）向肌成纖維細(xì)胞（myofibroblast）轉(zhuǎn)化最重要的細(xì)胞因子[2]。在正常損傷愈合和病理狀態(tài)下，粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）通過(guò)刺激TGF-β1的產(chǎn)生來(lái)誘導(dǎo)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）在肌成纖維細(xì)胞中合成，導(dǎo)致富含該細(xì)胞的肉芽組織形成[3]。但TGF-β1發(fā)揮作用還受到細(xì)胞外基質(zhì)條件和細(xì)胞表面受體的限制。其中，纖連蛋白EⅢA片段（EⅢA-fibronectin，EⅢA-FN）是TGF-β1誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵分子[4]。選擇性封閉EⅢA會(huì)阻礙TGF-β1誘導(dǎo)α-SMA的產(chǎn)生，但EⅢA及FN自身并不能誘導(dǎo)α-SMA的表達(dá)。EⅢA序列能引起FN構(gòu)象的改變，增加FN與其細(xì)胞表面黏附受體整合素結(jié)合的機(jī)會(huì)，后者激發(fā)基質(zhì)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，可增加細(xì)胞對(duì)TGF-β1的敏感性[5]?？傊琓GF-β1和EⅢA-FN參與了骨骼肌損傷后纖維化級(jí)聯(lián)反應(yīng)的起始階段，與損傷時(shí)間具有良好的相關(guān)性。

因此，本研究擬在上述研究成果的基礎(chǔ)上，通過(guò)大鼠骨骼肌挫傷動(dòng)物模型的建立，應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，分別研究生前損傷、生前損傷死后以及死后損傷不同時(shí)間點(diǎn)TGF-β1和EⅢA-FN的分布與動(dòng)態(tài)表達(dá)，旨在為法醫(yī)病理學(xué)損傷時(shí)間推斷提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組

健康成年雄性SD大鼠180只，體質(zhì)量390～410g，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（5只）、生前挫傷組（40只）、生前挫傷死后表達(dá)組（110只）和死后挫傷組（25只）。

正常對(duì)照組大鼠不予致傷。

生前挫傷組于8個(gè)時(shí)間點(diǎn)取材，分別為傷后6h、12 h、24 h、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d，在預(yù)設(shè)的時(shí)間處死大鼠，當(dāng)即取材，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)5只大鼠。以正常對(duì)照組大鼠為對(duì)照。

生前挫傷死后表達(dá)組中，將55只傷后3d和55只傷后5d的大鼠處死后置于溫度為（25±2）℃、相對(duì)濕度為（60±5）%的臺(tái)式高低溫交變濕熱箱（多禾試驗(yàn)設(shè)備有限公司）內(nèi)，分別于死后0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、2d、3d、4d、5d、6d、7d進(jìn)行取材，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)5只大鼠，以死后0h大鼠為對(duì)照。傷后3d大鼠提取的所有死后組織均用于TGF-β1的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，傷后5 d大鼠提取的所有死后組織則用于EⅢA-FN的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。

死后挫傷組分別于大鼠死后0.5 h、1 h、3 h、6 h、12h對(duì)其致傷，傷后立即取材，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)5只大鼠，以正常對(duì)照組以及生前挫傷后6h、10d和14d處死的大鼠為對(duì)照。

1.2 大鼠骨骼肌挫傷模型的制作

本課題組前期已成功建立了大鼠骨骼肌挫傷模型[1]。2%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射（30 mg/kg）麻醉，于右下肢剪毛備皮。將大鼠后肢置于伸膝、踝背屈90°位置，用自制打擊器（質(zhì)量為500 g）打擊大鼠右下肢距跟骨2.5 cm處。此時(shí)，皮膚仍保持完整，脛腓骨無(wú)骨折，損傷后不給予任何處理，每只大鼠分籠飼養(yǎng)并給予飼料及水，保持墊料清潔及空氣通暢。

各挫傷組大鼠按預(yù)設(shè)時(shí)間點(diǎn)頸椎脫臼處死，取右下肢損傷區(qū)肌肉進(jìn)行檢驗(yàn)。正常對(duì)照組和生前挫傷組大鼠樣本一部分立即用4%多聚甲醛中性溶液固定1 d，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋及制作5 μm厚切片，用于免疫組織化學(xué)染色；另一部分立即提取RNA溶液3 μL，-80℃冰箱保存，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。生前挫傷死后表達(dá)組和死后挫傷組大鼠樣本僅進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，處理同生前挫傷組。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

切片脫蠟、水化，水煮修復(fù)后用3%過(guò)氧化氫溶液滅活，正常非免疫山羊血清孵育，兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體（1∶100，sc-146，美國(guó)Santa Cruz公司）和小鼠抗大鼠 Fibronectin[IST-9]單克隆抗體（1∶200，ab6328，英國(guó)Abcam公司）分別作為一抗，應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)（SP法）進(jìn)行染色，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木素核復(fù)染。以磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）代替一抗作為空白對(duì)照。

1.4 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

按PrimeScriptTMRT試劑盒［DRR037S，寶生物工程（大連）有限公司］操作說(shuō)明書(shū)，將1μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。20 μL反應(yīng)體系如下：已配好的RNA工作液（0.5 μg/μL） 2 μL、5×PrimeScriptTM緩沖液 4 μL、PrimeScriptTM逆轉(zhuǎn)錄混合酶Ⅰ 1μL、寡聚胸腺嘧啶引物1μL、隨機(jī)的六核苷酸引物1μL、去RNA酶蒸餾水11 μL。放入2 mL薄壁PCR反應(yīng)管中，瞬時(shí)離心混勻，置于PTC-100型PCR儀（美國(guó)MJ Research公司）中，37℃孵育15min（逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)），85℃孵育5s（逆轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng)）。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

應(yīng)用PRISM?7500 Real-Time PCR System（美國(guó)AB公司），以逆轉(zhuǎn)錄所得cDNA為模板在96孔板內(nèi)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。按照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ［DRR081S，寶生物工程（大連）有限公司］試劑盒要求配制20 μL反應(yīng)體系：SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ10μL、上游引物0.8μL、下游引物0.8μL、ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL、cDNA溶液2 μL、蒸餾水6 μL。所有引物均由寶生物工程（大連）有限公司設(shè)計(jì)，內(nèi)參基因RPL13、TGF-β1基因（Tgfb1）和EⅢA-FN基因（Fn1）的引物序列見(jiàn)表1。兩步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序：95℃ 30s預(yù)變性；95℃ 5s，60℃ 34s，40個(gè)循環(huán)；95℃ 15s，60℃ 30s，95℃ 15s，采集熒光信號(hào)，繪制熔解曲線。為了排除潛在污染，每次上機(jī)都用蒸餾水代替cDNA作為陰性對(duì)照。陰性對(duì)照未見(jiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果由PRISM?7500 Real-Time PCR System自動(dòng)采集給出目的基因和內(nèi)參基因的Ct值，基因表達(dá)量采用 2-ΔΔCt進(jìn)行計(jì)算，其中ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）－ΔCt對(duì)照組（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）。采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

表1 引物序列

2 結(jié) 果

2.1 正常對(duì)照組與生前挫傷組大鼠骨骼肌TGF-β1和EⅢA-FN的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

正常對(duì)照組大鼠骨骼肌胞質(zhì)及間質(zhì)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)TGF-β1，骨骼肌胞質(zhì)內(nèi)弱表達(dá)EⅢA-FN。

傷后6 h，少量多形核白細(xì)胞（polymorphonuclear leukocyte，PMN）和單個(gè)核細(xì)胞（mononuclear cell，MNC）分別微弱表達(dá)TGF-β1和EⅢA-FN。傷后12～24 h，大量PMN和MNC強(qiáng)表達(dá)TGF-β1和EⅢA-FN。傷后3～14 d，挫傷區(qū)開(kāi)始出現(xiàn)成纖維樣細(xì)胞（fibroblastic cell，F(xiàn)BC）、新生血管及新生多核肌管，并且表達(dá)TGF-β1。而EⅢA-FN主要分布于細(xì)胞外基質(zhì)，并于傷后3～7d表達(dá)逐漸增多，之后表達(dá)減少。TGF-β1和EⅢA-FN的蛋白表達(dá)變化見(jiàn)圖1～2。

圖1 生前挫傷組大鼠骨骼肌不同時(shí)間點(diǎn)TGF-β1的表達(dá)（SP×400）

圖2 生前挫傷組大鼠骨骼肌不同時(shí)間點(diǎn)EⅢA-FN的表達(dá)（SP×400）

2.2 生前挫傷組大鼠骨骼肌TGF-β1和EⅢA-FN mRNA的表達(dá)

與正常對(duì)照組比較，生前挫傷組大鼠骨骼肌TGF-β1 mRNA的表達(dá)于傷后6 h輕微減少，而后逐漸增加，至3d達(dá)到峰值，再逐漸下降，至傷后10～14d接近正常對(duì)照組水平。其中，傷后3d，TGF-β1 mRNA的表達(dá)平均值為12.91，表達(dá)值范圍為11.84～14.03，高于其他時(shí)間點(diǎn)TGF-β1 mRNA的表達(dá)值（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表2。

與TGF-β1 mRNA的表達(dá)趨勢(shì)相似，EⅢA-FN mRNA的表達(dá)亦于傷后6h減少，然后快速升高，于傷后5 d到達(dá)高峰，隨后下降，并于傷后10 d開(kāi)始略低于對(duì)照組水平。其中，傷后5 d，EⅢA-FN mRNA的表達(dá)平均值為5.34，表達(dá)值范圍為4.26～6.21，其他時(shí)間點(diǎn)EⅢA-FN mRNA的表達(dá)值均低于4.26。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，傷后5 d、7 d EⅢA-FN mRNA的表達(dá)與其他時(shí)間點(diǎn)之間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3 生前挫傷死后表達(dá)組大鼠骨骼肌TGF-β1和EⅢA-FN mRNA的表達(dá)

生前挫傷死后表達(dá)組中，和死后0h相比，TGF-β1和EⅢA-FN mRNA的表達(dá)值分別于死后3h和6h開(kāi)始增加，并分別于死后6h和12h達(dá)到峰值，然后逐漸下降至死后7 d。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，死后不同時(shí)間點(diǎn)TGF-β1 mRNA的表達(dá)與死后0h之間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；除死后3h、24h和2d外，其他時(shí)間點(diǎn)EⅢAFN mRNA的表達(dá)與死后0h之間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表3。

2.4 死后挫傷組大鼠骨骼肌TGF-β1和EⅢA-FN mRNA的表達(dá)

死后挫傷組中，死后0.5～12h TGF-β1和EⅢAFN mRNA的表達(dá)情況見(jiàn)表4。死后不同時(shí)間點(diǎn)TGF-β1和EⅢA-FN mRNA的表達(dá)值均明顯低于正常對(duì)照組及生前挫傷后6h、10d和14d處死的大鼠，而在死后不同時(shí)間點(diǎn)之間TGF-β1或EⅢA-FN mRNA的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 生前挫傷組大鼠骨骼肌不同時(shí)間點(diǎn)TGF-β1和EⅢA-FN mRNA的表達(dá)平均值及范圍 （n=5）

表3 生前挫傷死后表達(dá)組大鼠骨骼肌不同時(shí)間點(diǎn)TGF-β1和EⅢA-FN mRNA的表達(dá)平均值及范圍（n=5）

表4 死后挫傷組大鼠骨骼肌不同時(shí)間點(diǎn)TGF-β1和EⅢA-FN mRNA的表達(dá)平均值及范圍 （n=5）

3 討 論

本研究報(bào)道了大鼠骨骼肌生前挫傷后不同時(shí)間點(diǎn)TGF-β1和EⅢA-FN的蛋白表達(dá)及mRNA動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)，并探討了大鼠死后骨骼肌挫傷后不同時(shí)間點(diǎn)TGF-β1和EⅢA-FN mRNA的表達(dá)趨勢(shì)，研究了死后環(huán)境因素對(duì)于TGF-β1和EⅢA-FN mRNA表達(dá)的影響，為法醫(yī)學(xué)損傷時(shí)間推斷的研究提供了全新的視角。

本研究免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，TGF-β1蛋白主要定位于MNC和FBC，與大鼠皮膚切創(chuàng)肉芽組織中表達(dá)[6-7]一致。TGF-β1可以使巨噬細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β），再通過(guò)IL-1β的繼發(fā)作用，參與局部炎癥反應(yīng)?；罨蟮腡GF-β1主要通過(guò)整合素（integrin）/黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）、Smad3蛋白和p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK）通路誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞分化[8-10]。肌成纖維細(xì)胞具有發(fā)達(dá)的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，可以分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)，包括Ⅰ～Ⅵ型膠原等。但是EⅢAFN蛋白表達(dá)明顯不同于TGF-β1蛋白，除了損傷早期其位于炎癥細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，傷后3～7d主要表達(dá)于細(xì)胞外基質(zhì)，也與大鼠皮膚挫傷后EⅢA-FN蛋白的表達(dá)[11]基本相同。細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)EⅢA-FN具有趨化作用，促進(jìn)炎癥細(xì)胞、成纖維細(xì)胞附著和游走，從而達(dá)到再生和修復(fù)作用[12]。此外，EⅢA-FN作為細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)于肌成纖維細(xì)胞的形成具有關(guān)鍵性作用。

根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果，大鼠骨骼肌生前挫傷后TGF-β1和EⅢA-FN mRNA的表達(dá)均呈現(xiàn)先增高后降低的變化趨勢(shì)，分別于傷后3d和5d達(dá)到峰值，其表達(dá)值范圍為11.84～14.03和4.26～6.21，而其他傷后不同時(shí)間點(diǎn)TGF-β1和EⅢA-FN mRNA表達(dá)值均低于11.84和4.26。因此，如果TGF-β1和EⅢAFN mRNA表達(dá)值分別大于11.84和4.26，則可以提示骨骼肌傷后時(shí)間為3d和5d。此外，如果不能確定某一指標(biāo)是否可以區(qū)分生前傷與死后傷，那么該指標(biāo)的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值則會(huì)降低。因此，本研究不僅觀察了TGF-β1和EⅢA-FN與骨骼肌傷后存活時(shí)間的關(guān)系，還重點(diǎn)研究了其是否可以鑒別生前傷與死后傷。由于生物學(xué)死亡的早期階段組織細(xì)胞和器官對(duì)刺激尚能產(chǎn)生超生反應(yīng)，故本研究中死后挫傷組不同時(shí)間點(diǎn)均可以檢出TGF-β1和EⅢA-FN mRNA，但是表達(dá)值均明顯低于正常未致傷大鼠以及生前挫傷后6 h、10d和14d處死的大鼠，這表明TGF-β1和EⅢA-FN在死后早期骨骼肌超生反應(yīng)中表達(dá)甚微，具有大鼠骨骼肌生前傷與死后傷的鑒別能力。

目前人們對(duì)于基因表達(dá)通路在人體死亡后發(fā)生的變化知之甚少。POZHITKOV等[13]應(yīng)用基因芯片分別對(duì)死后0～96h斑馬魚(yú)和死后0～48h小鼠的腦及肝組織進(jìn)行1 063個(gè)基因的mRNA轉(zhuǎn)錄譜檢測(cè)，其中大多是在死后0.5 h內(nèi)增加。FERREIRA等[14]則從基因型-組織表達(dá)（genotype-tissue expression，GTEx）項(xiàng)目中獲得36種器官組織的死后數(shù)據(jù)，研究發(fā)現(xiàn)：人體骨骼肌大多數(shù)基因在死后早期（小于1 h）表達(dá)改變，并且超過(guò)600個(gè)基因在死后不同時(shí)間內(nèi)具有顯著性變化，數(shù)量?jī)H次于橫結(jié)腸。本研究亦觀察到大鼠骨骼肌生前損傷后TGF-β1和EⅢA-FN mRNA分別于死后早期（3 h和6 h）表達(dá)即增加。死后樣本中不同種類細(xì)胞的存活可能是死后轉(zhuǎn)錄增加的因素之一，如成纖維細(xì)胞[15]、嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞[16]在死后短時(shí)間內(nèi)不會(huì)消失，可以存活56～86 h，小鼠骨骼肌干細(xì)胞甚至可以在死亡后14～17 d保持休眠狀態(tài)并保留再生能力[17]。這些存活的細(xì)胞會(huì)主動(dòng)和持續(xù)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，尤其是參與生存和應(yīng)激的調(diào)控基因會(huì)被激活[13]。為了研究TGF-β1和EⅢA-FN mRNA的死后表達(dá)情況，本研究設(shè)定的死后環(huán)境溫度為（25±2）℃、相對(duì)濕度為（60±5）%。由于溫度和濕度均為固定值，尚不能完全模擬實(shí)際情況。因此，下一步工作將在動(dòng)態(tài)變化的溫度和濕度環(huán)境中研究傷后骨骼肌基因譜的死后表達(dá)。