【摘 要】目的:觀察海洛因?qū)Υ笫箢~葉和海馬區(qū)腦組織形態(tài)學(xué)改變及Ub、UbE1在腦組織中的表達(dá),探討海洛因?qū)χ袠猩窠?jīng)系統(tǒng)功能和形態(tài)的影響及其發(fā)生機制。方法:選擇SD大鼠,分為3組(短時組2w、長時組4w及正常對照組),首日每次皮下注射海洛因3mg/kg,每天2次,逐日按3mg/kg遞增海洛因注射量,連續(xù)9天(第9天每次劑量達(dá)27mg/kg),第10天用5.0mg/kg納洛酮腹腔注射,誘發(fā)戒斷癥狀,對海洛因成癮大鼠模型戒斷癥狀進(jìn)行評分;對照組按同樣方式注射等量生理鹽水。采用免疫組織化學(xué)方法分別檢測Ub、UbE1在神經(jīng)元中的表達(dá)變化。結(jié)果:Ub和UbE1主要表達(dá)在神經(jīng)元細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)內(nèi),細(xì)胞外未見表達(dá)。圖像分析顯示Ub、UbE1的表達(dá)量均為海洛因長時依賴組(4w)<海洛因短時依賴組(2w)<非海洛因依賴組,差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論:海洛因中毒可引起腦組織形態(tài)學(xué)改變,表現(xiàn)為神經(jīng)元數(shù)量減少、神經(jīng)元變性等,其機制可能與泛素蛋白酶體功能障礙有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】海洛因;大鼠額葉;中樞神經(jīng)系統(tǒng);泛素-蛋白酶體系統(tǒng)
海洛因(heroin),化學(xué)名為二醋嗎啡,是成癮性極強的嗎啡衍生物。大量人群流行病學(xué)、動物實驗研究結(jié)果均表明[1,2,3],海洛因依賴可導(dǎo)致廣泛神經(jīng)元變性壞死、萎縮退化及脫髓鞘改變;臨床上大多有智能減退, 表現(xiàn)為計算力、理解力、定向力、記憶力、判斷力減退, 甚至癡呆。因此,近年來認(rèn)為海洛因依賴也屬于一種與記憶、癡呆癥相關(guān)的慢性、復(fù)發(fā)性神經(jīng)變性疾病[4]。
泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system,UPS)是機體修復(fù)或消除異常蛋白質(zhì)的重要途徑,在神經(jīng)變性疾病中發(fā)揮著重要作用。近幾年來,隨著UPS的分子機制研究取得的巨大的進(jìn)展,UPS在神經(jīng)變性疾病的發(fā)病機制中的作用也得到了許多研究的肯定。UPS功能的缺陷,無論是UPS水平的過高還是過低,都可能導(dǎo)致神經(jīng)變性疾病的發(fā)生。國內(nèi)外對于海洛因成癮及復(fù)吸所引起的神經(jīng)損害是否也受UPS的調(diào)控尚未見報道。本文通過建立海洛因依賴大鼠模型,研究Ub、UbE1在大鼠額葉、海馬區(qū)表達(dá)水平的變化,探討海洛因致腦損傷機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
健康SD大鼠30只,購自貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。3月齡,體重200-220g,雌雄各半。
1.2 藥品和試劑
海洛因由貴州省公安廳提供。泛素(Rabbit Anti-Ubiquitin)、泛素激活酶(Ubiquitin-activating enzymel, UbE1)購自北京博奧森公司;生物素化二抗(山羊抗兔IgG)購自北京博奧森公司,其余試劑為國產(chǎn)分析純。
1.3 動物模型
經(jīng)過適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后,按體重及性別隨機分為3組,每組10只,長時組(皮下注射海洛因4w),短時組(皮下注射海洛因2w),正常對照組(皮下注射等量生理鹽水),飼養(yǎng)期分別為2周和4周,參照以往文獻(xiàn)成功復(fù)制海洛因依賴模型的方法[5],給予SD大鼠海洛因皮下注射,首日每次劑量3mg/kg,每天2次,逐日按3mg/kg遞增海洛因注射量,連續(xù)9天(第9天每次劑量達(dá)27mg/kg)。對照組按同樣方式注射等量生理鹽水。每天觀察動物生長發(fā)育狀況及體重變化情況。第10天用5.0 mg/kg納洛酮腹腔注射,誘發(fā)戒斷癥狀觀察30min,對海洛因成癮大鼠模型戒斷癥狀進(jìn)行評分,確認(rèn)海洛因依賴模型成功。短時組繼續(xù)皮下注射27mg/kg海洛因4天(共計2周),每天2次;長時組繼續(xù)皮下注射27mg/kg海洛因18天(共計4周),每天2次。生理鹽水對照組各5只大鼠分別采用與模型組相同劑量的生理鹽水注射2周、4周。
1.4 動物行為變化觀察
觀察大鼠毛色、飲食、活動情況、精神狀態(tài),用電子秤稱量大鼠體重。參照Seebers等評分標(biāo)準(zhǔn),進(jìn)行大鼠催促戒斷癥狀評分。
1.5 取材和標(biāo)本制備
各組大鼠分別用戊巴比妥腹腔注射麻醉,灌注4%的甲醛溶液固定,參照鼠腦立體定位圖譜冠狀取海馬區(qū)、前額葉皮質(zhì)組織(包含周邊組織)。
1.6 HE染色和尼氏染色
多聚甲醛固定,石蠟包埋組織連續(xù)切片,片厚4μm,取海馬、前額葉皮質(zhì)腦組織切片,進(jìn)行常規(guī)HE染色,參照周君[6]的方法進(jìn)行尼氏染色,略有改動。
1.7 免疫組織化學(xué)Envision法
切片常規(guī)脫蠟至水,0.01mol/L枸緣酸鈉緩沖溶液(PH6.0)微波抗原修復(fù),蒸餾水洗2min,PBS沖洗3次,5min/次,3%H2O2室溫避光孵育10 分鐘,除去內(nèi)源性過氧化氫酶,蒸餾水洗2min,PBS沖洗3次,5min/次,胰酶(1:1稀釋)37℃恒溫箱中消化20min,使抗原位點暴露,蒸餾水洗2min,PBS沖洗3次,5min/次,分別滴加一抗多克隆Ub、UbE1 (用PBS稀釋1:100、1:100),4℃冰箱孵育過夜,復(fù)溫,PBS沖洗3次,5min/次,滴加兔二抗IgG(PV6001),37℃孵育30min,PBS沖洗3次,5min/次,DAB液顯色,蘇木精輕度復(fù)染,常規(guī)脫水、透明、封片。1.8 圖像分析
通過Biomias 2000 圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行計算分析,具有陽性表達(dá)的區(qū)域隨機選取4個視野,每個視野隨機選取陽性表達(dá)部位進(jìn)行平均灰度值測定,平均灰度高則表達(dá)強,反之則弱。
1.8 統(tǒng)計方法
運用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件數(shù)據(jù)包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(D)表示,兩組間的比較采用獨立樣本T檢驗的分析方法,*P<0.05表示與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1 海洛因依賴戒斷大鼠模型評分、體重
大鼠在9d皮下注射遞增劑量的海洛因后,用納洛酮催促后30min內(nèi)出現(xiàn)了濕狗樣顫抖、伸展、清理皮毛、吞咽、站立、扭體、齒顫、上瞼下垂、流涎等戒斷癥狀,對戒斷癥狀進(jìn)行評分,短時組評分18.1±2.1,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),長時組評分23.5±2.4,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),正常對照組評分2.8±1.5,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。短時組催促戒斷癥狀前體重230.4±15.1,戒斷后體重197.7±18.3,體重明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);長時組催促戒斷癥狀前體重225.6±13.9,戒斷后體重186.7±16.7,體重明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);對照組催促戒斷癥狀前體重265.9±19.7,戒斷后體重265.8±21.1,體重?zé)o明顯改變。
2.2 HE染色及尼氏染色
海洛因依賴組(包括短時組和長時組)前額葉、海馬區(qū)都出現(xiàn)正常神經(jīng)元數(shù)量減少、神經(jīng)元變性(包括神經(jīng)元固縮、深染、偏位,細(xì)胞核仁消失,尼氏體減少)、膠質(zhì)細(xì)胞增生、膠質(zhì)小結(jié)形成、嗜神經(jīng)現(xiàn)象等形態(tài)學(xué)改變,而對照組少見上述改變。尼氏染色顯示海洛因依賴組Nissl小體數(shù)量減少(P<0.05),且海馬區(qū)和前額葉皮質(zhì)均隨用藥時間延長Nissl小體減少更明顯(P<0.05)。
2.3 Ub免疫組織化學(xué)染色觀察
Ub陽性表達(dá)廣泛存在于前額葉皮質(zhì)及海馬區(qū)神經(jīng)元的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中,免疫組織化學(xué)定量分析可見:長時組<短時組<對照組,統(tǒng)計有顯著差異,P<0.05;前額葉皮質(zhì)及海馬區(qū)陽性表達(dá)比較,無統(tǒng)計學(xué)意義,見圖1。
2.4 UbE1免疫組織化學(xué)染色觀察
UbE1陽性表達(dá)廣泛存在于大腦皮質(zhì)及海馬神經(jīng)元的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中,細(xì)胞外未見表達(dá),免疫組織化學(xué)定量分析可見:長時組<短時組<對照組,統(tǒng)計有顯著差異,P<0.05;前額葉皮質(zhì)及海馬區(qū)陽性表達(dá)比較,無統(tǒng)計學(xué)意義,見圖2。
3 討論
海洛因容易通過血腦屏障直接作用于腦細(xì)胞,產(chǎn)生毒性作用。研究發(fā)現(xiàn),海洛因依賴死者生前均出現(xiàn)不同程度的反應(yīng)遲鈍、情感淡漠、注意力不集中、懶言少語等表現(xiàn),與阿爾茨海默病、帕金森癥等神經(jīng)變性疾病癥狀相似[3,7]。死亡病例腦組織病理學(xué)檢查可見不同程度的彌漫性神經(jīng)細(xì)胞變性壞死、嗜神經(jīng)現(xiàn)象多見,可見淀粉樣小體、膠質(zhì)細(xì)胞增生等[3]。
本試驗通過海洛因遞增皮下注射成癮、催促戒斷癥狀法建立海洛因依賴大鼠模型,腹腔注射5.0 mg/kg納洛酮后,大鼠出現(xiàn)明顯的濕狗樣顫抖、伸展、清理皮毛、吞咽、站立、跳躍、齒顫、上瞼下垂、流涎等癥狀,且體重急劇下降,與人使用海洛因后產(chǎn)生的戒斷癥狀相似。本試驗通過HE、尼氏染色發(fā)現(xiàn),海洛因依賴大鼠前額葉、海馬區(qū)都出現(xiàn)正常神經(jīng)元數(shù)量減少、神經(jīng)元變性、膠質(zhì)細(xì)胞增生、膠質(zhì)小結(jié)形成、嗜神經(jīng)現(xiàn)象、Nissl小體數(shù)量減少等形態(tài)學(xué)改變,該研究與以往的研究結(jié)果相一致[3,5],肯定了海洛因?qū)δX組織的損害作用,提示海洛因依賴對腦組織的損傷以神經(jīng)元變性、壞死為主,可能與海洛因引起呼吸抑制致全身缺氧,進(jìn)而造成大量脫髓鞘改變及神經(jīng)元變性有關(guān)。
泛素蛋白降解系統(tǒng)是細(xì)胞內(nèi)一系列生命進(jìn)程的重要調(diào)節(jié)方式,與疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。它主要由泛素、泛素啟動酶(包括泛素激活酶、泛素結(jié)合酶、泛素連接酶)、26S蛋白酶體和去泛素化酶組成。泛素蛋白酶體系在高等真核生物細(xì)胞中的功能主要體現(xiàn)在兩個方面:一方面降解細(xì)胞內(nèi)的蛋白,另一方面是非降解作用,調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)不同蛋白的定位和活性[8]。泛素活化酶1(ubiquitin-activating enzyme 1,UbE1)可以活化所有參與結(jié)合反應(yīng)的泛素,并將活化泛素轉(zhuǎn)移到E2酶。張利達(dá)[9]等對脫毒大鼠針刺百會和大椎治療發(fā)現(xiàn),減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡,調(diào)節(jié)大鼠海馬、中腦腹側(cè)背蓋區(qū)(VTA)的Ub、E3、26s mRNA和蛋白的表達(dá),可干預(yù)海洛因致腦損傷作用。本研究觀察海洛因依賴大鼠腦組織中Ub、UBE1廣泛定位于神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中,甚至在軸突和樹突中也有表達(dá),應(yīng)用圖像分析陽性信號顯示,Ub、UBE1在海洛因依賴長時組、短時組中表達(dá)水平均較正常對照組有不同程度的降低(p<0.05)。目前已知,蛋白質(zhì)的多泛素化是一種控制信號,凡被Ub標(biāo)記的蛋白質(zhì)最終被降解。一些易聚集蛋白(如Tau蛋白、α-Synuclein、淀粉樣前體蛋白等)有纖維狀的形態(tài)學(xué)特點,不易被相應(yīng)的酶降解,并且異常蛋白的增加和腦內(nèi)的聚集在神經(jīng)變性疾病的發(fā)病機制中起著關(guān)鍵作用,可對神經(jīng)元產(chǎn)生毒性作用[10]。泛素蛋白酶體系統(tǒng)具有識別這類多余的和錯誤折疊的蛋白質(zhì),以保持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)平衡的作用,UbE1失活和泛素化水平功能障礙是致死性的。由實驗結(jié)果可見,海洛因依賴成癮可致額葉、海馬區(qū)腦組織的UbE1表達(dá)量減少,且泛素化水平降低,可以推測泛素蛋白酶體系功能紊亂可能是海洛因?qū)Υ笫蟪砂a復(fù)吸或腦組織損害的原因之一。
(通訊作者:汪元河)
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作者簡介
黃仕美(1982-),女,貴州省貴陽市人。碩士學(xué)位。貴州醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院講師,兼主檢法醫(yī)師。主要研究方向為神經(jīng)病理。