石偉杰，李欣陽，張 勇，王全穎，張永豐，李 莉，杜雨蒙，楊 超

(國家海洋局 秦皇島海洋環(huán)境監(jiān)測中心站，河北 秦皇島 066002 )

近年來，秦皇島近岸海域由微微型浮游植物引起的褐潮頻發(fā)。該海域褐潮具有細(xì)胞密度極高，暴發(fā)面積大，持續(xù)時間較長等特點。Zhang等[1]通過對優(yōu)勢種18S rDNA序列監(jiān)測分析，確定褐潮藻種為抑食金球藻(Aureococcusanophagefferens)。我國是第三個出現(xiàn)抑食金球藻褐潮的國家。褐潮發(fā)生期間，海域水體透明度降低，抑食金球藻能適應(yīng)低光照環(huán)境，細(xì)胞迅速繁殖，底棲藻類光合作用卻受到抑制，嚴(yán)重危害了海域生態(tài)系統(tǒng)；另一方面褐潮不僅對扇貝、魚類及其他海洋生物的重要棲息造成嚴(yán)重的破壞，還能抑制濾食貝類的進(jìn)食，從而導(dǎo)致其生長受阻，對海域養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[2-4]。隨著人們對海洋生態(tài)環(huán)境的日益重視，抑食金球藻褐潮已成為研究的熱點。國內(nèi)外對抑食金球藻研究主要集中于其生理生化方面及其對生態(tài)環(huán)境的影響[2-7]，關(guān)于重金屬對抑食金球藻生長影響的報道較少。鐵、錳、鋅和銅等是秦皇島海域海水中常見重金屬離子，同時也是藻細(xì)胞生長過程中必不可少的元素，其中有學(xué)者認(rèn)為鐵和錳與赤潮發(fā)生有一定的關(guān)系[8-9]。本試驗通過探討錳、銅、鋅和鐵4種重金屬離子對抑食金球藻生長綜合效應(yīng)的影響，以期為秦皇島海域抑食金球藻引發(fā)褐潮的研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗藻種

抑食金球藻來自國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心，保存于L1培養(yǎng)基中[10]，光照條件4000 lx，光暗周期為12L∶12D，培養(yǎng)溫度為(25±1) ℃。

1.2 試驗方法

分別用分析純的CuSO4、MnCl2和ZnSO4溶解于去離子水中，配制成0.1 g/L的重金屬母液；用FeCl3配制成2.0 g/L的母液。試驗時，用消毒的海水將重金屬母液稀釋至試驗所需的離子質(zhì)量濃度。

1.2.1 4種重金屬離子對抑食金球藻生長的影響試驗

試驗在250 mL的三角燒瓶中進(jìn)行，CuSO4據(jù)其質(zhì)量濃度設(shè)為0(對照組)、5、25、125、625 μg/L試驗組，每組設(shè)有3個平行，其他營養(yǎng)鹽均采用L1培養(yǎng)基[10]。MnCl2和ZnSO4試驗也設(shè)置同樣的質(zhì)量濃度梯度，按上述方法進(jìn)行。FeCl3據(jù)其質(zhì)量濃度設(shè)為0(對照組)，100、500、2500、12 500、62 500 μg/L試驗組，也按上述同樣的方法進(jìn)行試驗。將處于指數(shù)生長期的藻種接種到上述各試驗組中培養(yǎng)，培養(yǎng)液最終體積為200 mL，起始藻種密度為1.10×104個/mL，培養(yǎng)條件同1.1，每日定時搖瓶3次。在指數(shù)生長期末期，測定各試驗組細(xì)胞密度、相對生長率和葉綠素含量。

1.2.2 重金屬離子對抑食金球藻生長的綜合效應(yīng)試驗

通過1.2.1試驗篩選出對抑食金球藻生長影響較大的3種重金屬離子，選取每種重金屬離子3個合適的質(zhì)量濃度，設(shè)計正交試驗，除以上3種重金屬離子質(zhì)量濃度外，其他營養(yǎng)鹽均采用L1培養(yǎng)基[10]，培養(yǎng)條件同1.1。試驗組培養(yǎng)液最終體積為200 mL，起始藻種密度為1.80×104個/mL，每日定時搖瓶3次。正交試驗進(jìn)行7 d，試驗結(jié)束后測定各試驗組細(xì)胞密度、相對生長率、葉綠素含量和3種金屬離子質(zhì)量濃度。

1.3 參數(shù)測定

葉綠素含量測定的方法為過濾10 mL藻液后放干燥冷藏箱保存，采用分光光度計法進(jìn)行分析，即以丙酮溶液提取藻細(xì)胞色素，依次在664、647、630 nm波長下測定吸光值，按Jeffrey-Humphrey的方程式計算葉綠素a的質(zhì)量濃度[11]，以μg/L表示。

藻細(xì)胞密度計數(shù)采用分光光度法測定。將培養(yǎng)好的藻按比例稀釋成一定密度組，每組用計數(shù)框測定細(xì)胞密度3次，取平均值。另將上述相應(yīng)的密度組用分光光度計(UV Power)測定其吸光度。將吸光度和細(xì)胞密度進(jìn)行擬合，求得回歸方程y=0.000738x+0.0177(r2=0.9987)[y為吸光度，x為藻細(xì)胞密度(104個/mL)]。測定每個試驗組藻細(xì)胞吸光度，代入方程可得藻細(xì)胞密度。

藻液中的錳、銅、鋅和鐵4種重金屬離子按《海洋行業(yè)規(guī)范》(HY/T 147.1—2013)[12]中的分析方法進(jìn)行。藻細(xì)胞吸收重金屬量按下式計算：

重金屬吸收量/μg=V×(Ca-Cb)

式中，V為培養(yǎng)液的體積(L)，Ca為初始加入重金屬的質(zhì)量濃度(μg/L)，Cb為試驗結(jié)束后測得重金屬的質(zhì)量濃度(μg/L)。

每日定時取樣并測定藻細(xì)胞密度，按下式計算相對生長率：

相對生長率=(lnNt-lnN0)/t

式中，N0為初始藻細(xì)胞密度(個/mL)，Nt為t日后藻細(xì)胞密度(個/mL)，t為培養(yǎng)時間(d)。

1.4 統(tǒng)計分析

采用SPSS 11.5軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行單因子方差分析、多重比較(P<0.05表示顯著)，并對抑食金球藻細(xì)胞密度、相對生長率和葉綠素含量與重金屬離子吸收量之間進(jìn)行相關(guān)性分析。用Origin Pro 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種重金屬離子對抑食金球藻的生長影響

不同錳離子質(zhì)量濃度對抑食金球藻細(xì)胞密度、相對生長率和葉綠素含量的影響見圖1。單因子方差分析結(jié)果表明，錳離子對抑食金球藻細(xì)胞密度、相對生長率和葉綠素質(zhì)量濃度有顯著影響(P<0.05)。當(dāng)錳離子質(zhì)量濃度為0～25 μg/L時，上述參數(shù)隨質(zhì)量濃度的升高呈現(xiàn)上升的趨勢，當(dāng)錳離子質(zhì)量濃度大于25 μg/L時，抑食金球藻細(xì)胞密度、相對生長率和葉綠素質(zhì)量濃度均呈現(xiàn)下降趨勢。多重比較結(jié)果顯示，25 μg/L組細(xì)胞密度、相對生長率和葉綠素質(zhì)量濃度顯著高于其他組，分別為2.52×106個/mL、0.776和10.6 μg/L。0 μg/L試驗組上述參數(shù)顯著低于其他試驗組，分別為1.58×106個/mL、0.710和5.58 μg/L。因此，抑食金球藻生長最適宜的錳離子質(zhì)量濃度為25 μg/L。

圖1 不同錳離子質(zhì)量濃度對抑食金球藻細(xì)胞密度、相對生長率和葉綠素質(zhì)量濃度的影響

不同銅離子質(zhì)量濃度對抑食金球藻細(xì)胞密度、相對生長率和葉綠素質(zhì)量濃度的影響見圖2。單因子方差分析結(jié)果表明，銅離子對抑食金球藻細(xì)胞密度、相對生長率和葉綠素質(zhì)量濃度有顯著影響(P<0.05)。多重比較結(jié)果顯示，5 μg/L試驗組細(xì)胞密度、相對生長率和葉綠素質(zhì)量濃度顯著高于其他試驗組，分別為2.41×106個/mL、0.770和12.5 μg/L。125 μg/L和625 μg/L試驗組細(xì)胞密度和相對生長率顯著低于其他組，兩組之間差異不顯著(P>0.05)。625 μg/L試驗組葉綠素質(zhì)量濃度最低，僅為7.01 μg/L。因此，抑食金球藻生長最適宜的銅離子質(zhì)量濃度為5 μg/L。

圖2 不同銅離子質(zhì)量濃度對抑食金球藻細(xì)胞密度、相對生長率和葉綠素質(zhì)量濃度的影響

圖3 不同鋅離子質(zhì)量濃度對抑食金球藻細(xì)胞密度、相對生長率和葉綠素質(zhì)量濃度的影響

不同鋅離子質(zhì)量濃度對抑食金球藻細(xì)胞密度、相對生長率和葉綠素含量的影響見圖3。單因子方差分析結(jié)果表明，鋅離子對抑食金球藻細(xì)胞密度、相對生長率和葉綠素質(zhì)量濃度有顯著影響(P<0.05)。多重比較結(jié)果顯示，0 μg/L對照組細(xì)胞密度、相對生長率和葉綠素質(zhì)量濃度顯著高于其他試驗組，分別為2.38×106個/mL、0.768和11.3 μg/L。125 μg/L 和625 μg/L試驗組細(xì)胞密度和相對生長率顯著低于其他組，兩組之間差異不顯著(P>0.05)。25、125 μg/L 和625 μg/L試驗組葉綠素質(zhì)量濃度顯著低于其他兩組，分別為8.54、8.48 μg/L 和8.51 μg/L，3組之間差異不顯著(P>0.05)。除對照組外，鋅離子其他試驗組對抑食金球藻生長產(chǎn)生抑制作用，因此不將鋅離子作為后續(xù)綜合效應(yīng)試驗的因子。

不同鐵離子質(zhì)量濃度對抑食金球藻細(xì)胞密度、相對生長率和葉綠素質(zhì)量濃度的影響見圖4。單因子方差分析結(jié)果表明，鐵離子對抑食金球藻細(xì)胞密度、相對生長率和葉綠素質(zhì)量濃度有顯著影響(P<0.05)。多重比較結(jié)果顯示，12 500 μg/L和62 500 μg/L試驗組細(xì)胞密度、相對生長率和葉綠素質(zhì)量濃度顯著高于其他組，但兩者之間上述參數(shù)差異均不顯著(P>0.05)。對照組的細(xì)胞密度、相對生長率和葉綠素質(zhì)量濃度最低，分別為7.21×104個/mL、0.268和0.179 μg/L。考慮到62 500 μg/L質(zhì)量濃度較高，因此，對抑食金球藻生長最適宜的鐵離子質(zhì)量濃度為12 500 μg/L。

2.2 重金屬離子對抑食金球藻生長綜合效應(yīng)

圖4 不同鐵離子質(zhì)量濃度對抑食金球藻細(xì)胞密度、相對生長率和葉綠素質(zhì)量濃度的影響

表1 正交試驗重金屬離子質(zhì)量濃度設(shè)置 μg/L

表2 正交試驗表及響應(yīng)值

表3 3種重金屬離子吸收量與細(xì)胞密度、相對生長率和葉綠素含量相關(guān)性分析統(tǒng)計表

注：“**”表示相關(guān)性極顯著(P<0.01)，其余為相關(guān)性不顯著(P>0.05).

3 討 論

抑食金球藻褐潮形成的元素不僅包含營養(yǎng)鹽、溫度、鹽度和光照等[2,13]，重金屬對褐潮的形成也有一定的作用。重金屬離子是藻類生長發(fā)育過程中必不可少的元素，在藻類光合作用、呼吸作用和蛋白質(zhì)與核酸合成等代謝過程中發(fā)揮著重要的作用[14]。低質(zhì)量濃度的金屬離子促進(jìn)藻細(xì)胞生長，而當(dāng)金屬離子超過一定質(zhì)量濃度時，對藻細(xì)胞生長表現(xiàn)為抑制特性。

3.1 錳離子對抑食金球藻生長的影響

錳是藻類葉綠素合成的輔助因子，也是維護葉綠素體膜結(jié)構(gòu)的必需元素，并在光合電子傳遞過程中參與水的光解作用[15]。同時錳離子也是硝酸還原酶的活化劑，在藻類對硝酸鹽的吸收代謝中起著關(guān)鍵的作用[2,6]。缺錳時可能引起藻類葉綠素合成受阻，葉綠素體膜結(jié)構(gòu)被破壞，使藻類光合活性受到抑制[16-17]，藻類對硝酸鹽的轉(zhuǎn)化過程受到影響，藻細(xì)胞生長受到限制。在試驗中，錳離子質(zhì)量濃度為0～25 μg/L時，藻細(xì)胞密度隨錳離子質(zhì)量濃度的升高而增加，說明此時錳離子為細(xì)胞生長的限制因子。隨著錳離子質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)葉綠素合成逐漸恢復(fù)，光合作用和呼吸作用均能正常進(jìn)行，細(xì)胞生長較快。錳離子質(zhì)量濃度大于25 μg/L時，細(xì)胞生長受到抑制。郭金耀等[17]研究了錳離子對鹽藻(Dunaliellasalina)的生長、蛋白質(zhì)和β-胡蘿卜素合成的影響，結(jié)果表明，當(dāng)錳離子質(zhì)量濃度過高或過低時，藻細(xì)胞密度較低，同時蛋白質(zhì)和β-胡蘿卜素含量也較低，鹽藻生長受阻。曹春暉等[16]研究結(jié)果顯示，當(dāng)錳離子濃度為10-12～10-8mol/L時，米氏凱倫藻(Kareniamikimotoi)細(xì)胞密度和葉綠素相對含量隨錳離子濃度的升高而增加；當(dāng)錳離子濃度為10-8～10-4mol/L時，細(xì)胞密度隨錳離子濃度的升高而降低。上述研究結(jié)果與本試驗結(jié)果基本相符。

3.2 銅離子對抑食金球藻生長的影響

銅離子通過與藻細(xì)胞中的藻膽體結(jié)合，參與光合電子傳遞過程，促進(jìn)光合作用的二氧化碳固定， 有利于藻細(xì)胞的生長發(fā)育。但高質(zhì)量濃度的銅離子，能使藻細(xì)胞積累活性氧，導(dǎo)致脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的過氧化作用，從而使丙二醛含量升高，超氧化物歧化酶活性降低，阻礙其生長發(fā)育[18]。也有學(xué)者認(rèn)為，低質(zhì)量濃度的銅離子能促進(jìn)藻細(xì)胞生長；但高質(zhì)量濃度銅離子與細(xì)胞表面的官能團結(jié)合，使其活性喪失，從而影響細(xì)胞的光合作用和呼吸作用，細(xì)胞生長受阻[19]。試驗中，當(dāng)銅離子質(zhì)量濃度為0～5 μg/L時，對細(xì)胞生長表現(xiàn)為促進(jìn)作用；當(dāng)銅離子質(zhì)量濃度為25～625 μg/L時，細(xì)胞密度隨質(zhì)量濃度的升高而降低。晉利等[20]研究了不同銅離子濃度及不同時間對銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)生長及葉綠素?zé)晒忏~銹的影響，結(jié)果表明，96 h內(nèi)銅離子濃度為1 μmol/L時，其細(xì)胞密度、PSⅡ最大光合效率、PSⅡ?qū)嶋H光合效率和光能利用效率與對照組差異不顯著(P>0.05)，隨著銅離子濃度的增加，上述參數(shù)均顯著降低。張樹林等[21]研究了不同質(zhì)量濃度銅離子(0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mg/L)對銅綠微囊藻生長和毒性影響，結(jié)果表明，96 h時不同質(zhì)量濃度銅離子對銅綠微囊藻的生長均產(chǎn)生脅迫作用，細(xì)胞密度均比對照組低。其銅離子質(zhì)量濃度設(shè)置較高，最小質(zhì)量濃度為0.3 mg/L，而本試驗中銅離子質(zhì)量濃度為0～625 μg/L，質(zhì)量濃度設(shè)置較低，當(dāng)質(zhì)量濃度大于5 μg/L時，抑食金球藻生長也受到抑制。

3.3 鋅離子對抑食金球藻生長的影響

鋅是藻類光合作用和生長過程中許多酶的重要組成成分和激活劑，其中碳酸酐酶是藻類吸收利用無機氮的關(guān)鍵酶[22]。高含量鋅能導(dǎo)致藻細(xì)胞類囊體大多溶解消失，葉綠體遭到破壞，葉綠素a含量下降，光合作用受到影響，并抑制葉綠體總還原型輔酶Ⅱ的形成，從而使細(xì)胞生長受阻[23]。高含量鋅也能抑制蘋果酸脫氫酶的合成，導(dǎo)致細(xì)胞糖代謝受到影響。楊洪等[24]試驗結(jié)果表明，不同濃度(0～100 μmol/L)的鋅離子均能對小球藻(Chlorellavulgaris)的生長產(chǎn)生抑制作用。胡晗華等[25]認(rèn)為，鋅含量過高或過低均能抑制藻細(xì)胞生長。鋅對藻細(xì)胞的促進(jìn)作用與藻種有關(guān)，不同的藻類生長所需的鋅含量不同。張鐵明[22]研究結(jié)果表明，當(dāng)鋅離子質(zhì)量濃度為0.02～1 μg/L時，銅綠微囊藻生長較好，細(xì)胞密度顯著增加；當(dāng)鋅離子質(zhì)量濃度大于100 μg/L時，其生長受到影響。鋅離子對斜生柵藻(Scenedesmusobiquus)生長的影響也呈現(xiàn)相似的規(guī)律，當(dāng)鋅離子質(zhì)量濃度為0.1～100 μg/L，其細(xì)胞密度顯著高于對照組；鋅離子質(zhì)量濃度大于1000 μg/L時，藻細(xì)胞生長受到影響，細(xì)胞密度低于對照組。本試驗中，鋅離子質(zhì)量濃度為5～625 μg/L，抑食金球藻生長均受到抑制，這與楊洪等[24]試驗結(jié)果相符，與張鐵明[22]的銅綠微囊藻試驗結(jié)果的情況也一致，但與斜生柵藻生長所需鋅離子質(zhì)量濃度差異較大。

3.4 鐵離子對抑食金球藻生長的影響

鐵是藻細(xì)胞生長代謝過程中多種酶系的輔助因子，是細(xì)胞色素、鐵巰基蛋白和鐵氧化還原蛋白的重要組成元素[22]，能促進(jìn)藻類的生長，同時也是藻類生長的限制因子之一[22,26]。鐵含量較低將導(dǎo)致藻類葉綠素合成受阻[27]，光合作用能力下降，藻細(xì)胞生長受到影響。在本試驗中，當(dāng)鐵離子質(zhì)量濃度為0～12 500 μg/L時，細(xì)胞密度隨鐵離子質(zhì)量濃度的升高而增加，葉綠素含量和相對生長率也呈現(xiàn)相同的規(guī)律。當(dāng)鐵離子質(zhì)量濃度較低時，鐵離子為藻細(xì)胞生長的限制因子，藻細(xì)胞隨鐵離子質(zhì)量濃度的增加而迅速生長，鐵離子表現(xiàn)為促生長作用。當(dāng)鐵離子質(zhì)量濃度為62 500 μg/L時，鐵離子不再是限制因子，此時并未表現(xiàn)出促生長作用。左冬梅等[26]研究表明，在10-9～10-6mol/L時，隨著鐵濃度的增加，藻類光合放氧及葉綠素合成均受到促進(jìn)，當(dāng)鐵濃度較低(10-9～10-8mol/L)時，尖刺擬菱形藻(Pseudonitzschiapungens)生長受到抑制。曹春暉等[28]研究結(jié)果顯示，鐵對旋鏈角毛藻(Chaetoceroscurvisetus)的細(xì)胞密度、世代時間和生長率均有顯著影響。張鐵明[22]試驗結(jié)果表明，低質(zhì)量濃度鐵離子限制了銅綠微囊藻、斜生柵藻和脆桿藻(Fragilariasp.)的生長，當(dāng)鐵離子質(zhì)量濃度升高時藻細(xì)胞密度和葉綠素含量也升高，表現(xiàn)為促進(jìn)作用。以上研究結(jié)論與本試驗結(jié)果相符。

3.5 重金屬離子對抑食金球藻生長的綜合效應(yīng)

在海域環(huán)境中存在有很多藻類生長所需微量元素，這些元素對藻類生長不是單一效應(yīng)，而是相互間表現(xiàn)為協(xié)同或拮抗作用等綜合效應(yīng)[28-29]。曹春暉等[28]研究表明，鐵離子對旋鏈角毛藻生長的影響大于錳離子，其中錳離子對細(xì)胞密度沒有影響。本試驗研究結(jié)果顯示，鐵離子對抑食金球藻生長的影響顯著大于銅離子和錳離子。與曹春暉等[28]研究結(jié)果相一致。而秦曉明等[29]試驗結(jié)果顯示，影響錐狀斯氏藻(Scrippsiellatrochoidea)生長的主次因素為Mn>Fe-EDTA>NO3-N>PO4-P。李灝等[30]通過研究N、P、Fe和Mn對亞歷山大藻(Alexandriumsp. LC3)生長的影響得出，4種因素對其影響次序為P>Mn>N>Fe。以上研究得出，鐵對藻類生長的影響小于錳，這主要可能由于是藻種的類群不同，不同藻種類群生長發(fā)育時對金屬離子的代謝途徑也不同，本試驗研究的抑食金球藻屬于棕鞭藻門，而錐狀斯氏藻和亞歷山大藻均屬于甲藻門。金屬吸收速率和藻細(xì)胞的生長速率有一定相關(guān)性[31]，本試驗通過對3種離子吸收量與抑食金球藻生長的相關(guān)性分析得出，鐵離子與細(xì)胞生長顯著相關(guān)，而其他2個金屬離子與細(xì)胞生長相關(guān)性均不顯著。因此，本試驗結(jié)果表明，抑食金球藻受到鐵離子質(zhì)量濃度的影響最大。

有研究表明[32-33]，近海海域中大量營養(yǎng)鹽的輸入影響浮游植物對重金屬離子的吸收。本研究僅從重金屬離子質(zhì)量濃度方面討論其對抑食金球藻生長的影響，對于營養(yǎng)鹽與重金屬聯(lián)合作用對褐潮形成的影響，重金屬離子影響褐潮形成的機制，以及離子質(zhì)量濃度閾值等方面的認(rèn)知還需要更進(jìn)一步的深入研究。