張曉雨，李 霞,2，秦艷杰，單莉娟，周詩(shī)嘉，王茂林，梁 艷，王縉云

(1.大連海洋大學(xué)，遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連116023； 2.大連海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023 )

松江鱸(Trachidermusfasciatus)又名四鰓鱸，屬鲉形目、杜父魚科、松江鱸屬，為降海洄游性魚類，是我國(guó)渤海、黃海、東海沿岸及相鄰淡水水域的習(xí)見魚類。松江鱸肉質(zhì)鮮美細(xì)嫩且體態(tài)多變，被譽(yù)為“中國(guó)四大名魚”之一[12]。同時(shí)，松江鱸由于近年來(lái)數(shù)量的減少，已被列為國(guó)家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物。關(guān)于松江鱸的生物學(xué)研究較少，邵炳緒[13]研究了松江鱸的生長(zhǎng)習(xí)性；韋正道等[14]報(bào)道了影響松江鱸生長(zhǎng)的環(huán)境因子。近幾年關(guān)于松江鱸的人工育苗和養(yǎng)殖研究的報(bào)道較多[15-18]。在細(xì)胞方面，目前已報(bào)道的相關(guān)研究有松江鱸脾[19]和鰭[20]細(xì)胞系的短期體外培養(yǎng)以及重金屬對(duì)松江鱸腎細(xì)胞系的毒性研究[10]等。筆者對(duì)可連續(xù)傳代的松江鱸腎組織細(xì)胞系進(jìn)行生長(zhǎng)狀況描述和細(xì)胞遺傳學(xué)分析，并測(cè)定其對(duì)病毒、重金屬鎘的敏感性，旨在探明松江鱸腎細(xì)胞系的特性，為該細(xì)胞系在松江鱸病毒性疾病的研究及其作為重金屬鎘污染的生物學(xué)標(biāo)志物研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用松江鱸腎組織細(xì)胞系由大連海洋大學(xué)細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室提供。鯉春病毒血癥病毒(Springviraemiaofcarpvirus)和魚類諾達(dá)病毒(Piscinenodavirus)由大連海洋大學(xué)病害實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)于25 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱，所用的培養(yǎng)基為20% FBS-DMEM/F12，采用文獻(xiàn)[18]中胰蛋白消化法傳代。

1.2.2 細(xì)胞凍存與復(fù)蘇

參照文獻(xiàn)[21]稍作改動(dòng)，按照1∶1∶3比例，將二甲基亞砜(DMSO)、FBS和DMEM/F12配制成凍存液，并于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。選取75代生長(zhǎng)狀態(tài)良好，并處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的松江鱸腎細(xì)胞，用0.25%的胰酶消化后，加入培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并收集在無(wú)菌離心管中。將細(xì)胞懸液以轉(zhuǎn)速1500 r/min離心5 min。棄上清液，向離心管中加入1 mL凍存液，重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1.0×106個(gè)/mL后，轉(zhuǎn)移到無(wú)菌凍存管中。將裝有細(xì)胞的凍存管按照順序進(jìn)行梯度降溫，操作步驟為：4 ℃冰箱中放置30 min，-20 ℃冰箱中4 h，-80 ℃冰箱中24 h，之后轉(zhuǎn)移到液氮(-196 ℃)中，長(zhǎng)期保存。

從液氮中取出已凍存30 d的細(xì)胞，迅速放在40 ℃的溫水中水浴解凍，待凍存液90%融化后，轉(zhuǎn)移至25 ℃的溫水中水浴1 min。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管中，向離心管中加入1 mL 20% FBS-DMEM/F12的培養(yǎng)基，1500 r/min，離心5 min，棄上清液。在離心管中加入2 mL 20% FBS-DMEM/F12的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。充分混勻后，吸取100 μL細(xì)胞懸液到青霉素小瓶中，向其中加入100 μL的臺(tái)盼藍(lán)，在光學(xué)顯微鏡下，用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算凍存細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率/%=(n2/n1)×100%

式中，n1為細(xì)胞總數(shù)(個(gè))，n2為活細(xì)胞數(shù)(個(gè))。

1.2.3 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的75代松江鱸腎細(xì)胞，用0.25%的胰酶消化，加入2 mL 20% FBS-DMEM/F12培養(yǎng)基吹打細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞懸液密度至5×104～8×104個(gè)/mL。將細(xì)胞懸液接種至24孔板中，每孔接種500 μL，共接種21孔。將24孔板放于25 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24 h取3孔細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并計(jì)算其密度，連續(xù)計(jì)數(shù)7 d。以培養(yǎng)時(shí)間(d)為橫坐標(biāo)，以細(xì)胞密度(個(gè)/mL)為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞的群體倍增時(shí)間：

T=t×lg2/lg(nt/n0)

式中，T為群體倍增時(shí)間(d)，nt為時(shí)間t(d)后的細(xì)胞數(shù)(個(gè))，n0接種細(xì)胞數(shù)(個(gè))。

1.2.4 細(xì)胞染色體分析

染色體制備方法參照文獻(xiàn)[22]并稍做改動(dòng)。取35代生長(zhǎng)狀態(tài)良好并處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的松江鱸腎細(xì)胞，向培養(yǎng)基中加入秋水仙素，調(diào)整秋水仙素質(zhì)量濃度為1 μg/mL，放回25 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，用0.25%的胰酶消化重懸細(xì)胞。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管中，1000 r/min，離心10 min，棄上清液。向離心管中加入低滲液，在25 ℃下低滲30 min，低滲液為0.075 mol/mL KCl溶液。30 min后1000 r/min離心5 min。用Carnoy固定液固定15 min，連續(xù)固定3次，之后放入4 ℃冰箱中過(guò)夜。染色體制片方法采用冷滴片法，并在室溫下自然干燥。用Giemsa染液染色30 min，用流水輕輕洗去浮色后室溫下自然干燥。在顯微鏡下找到完整的染色體分裂相，統(tǒng)計(jì)數(shù)目并拍照。

1.2.5 兩種病毒對(duì)松江鱸腎細(xì)胞的感染試驗(yàn)

選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的50代松江鱸腎細(xì)胞，吸去舊培養(yǎng)基，用無(wú)菌PBS輕輕沖洗細(xì)胞2次。將細(xì)胞分為3組，分別為2個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，2個(gè)試驗(yàn)組分別加入0.1 mL鯉春病毒血癥病毒液和0.1 mL魚類諾達(dá)病毒液，隨后各加入0.1 mL 20% FBS-DMEM/F12培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個(gè)平行。將3組細(xì)胞放入25 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，分別吸去病毒液和培養(yǎng)基，加入5 mL 20% FBS-DMEM/F12培養(yǎng)基，再放回25 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。每日觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照記錄細(xì)胞病變效應(yīng)，無(wú)論接毒細(xì)胞是否出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)，都繼續(xù)進(jìn)行盲傳接毒，每隔5 d盲傳一次。

1.2.6 鯉春病毒血癥病毒在松江鱸腎細(xì)胞系上的滴度測(cè)定

選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的50代松江鱸腎細(xì)胞，用0.25%胰酶消化重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液密度調(diào)整至1.0×105個(gè)/mL。將細(xì)胞懸液接種至96孔板中，每孔接種200 μL，放回25 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，吸除舊培養(yǎng)基，更換為相同體積的病毒懸液，病毒懸液按照10倍系列稀釋，每稀釋度8孔。之后放回25 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照記錄細(xì)胞病變效應(yīng)出現(xiàn)情況。根據(jù)Reed-Muench公式計(jì)算病毒滴度值。

1.2.7 松江鱸腎細(xì)胞系對(duì)鎘離子敏感性研究

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期生長(zhǎng)狀態(tài)良好的60～70代松江鱸腎細(xì)胞，用0.25%胰酶消化重懸細(xì)胞，調(diào)整至細(xì)胞密度為1.0×105個(gè)/mL，接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種200 μL懸液。將其放在25 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄培養(yǎng)基，加入等體積的含有氯化鎘的培養(yǎng)基，鎘離子濃度分別為0、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200 μmol/L，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)。放回25 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，向每孔中加入40 μL MTT，放入CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)4 h。棄培養(yǎng)基，用PBS快速?zèng)_洗2次。在每個(gè)孔內(nèi)加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，室溫振蕩15 min。用酶標(biāo)儀測(cè)其在570 nm波長(zhǎng)下的吸光度值(A)。將氯化鎘濃度為0的一組設(shè)為陰性對(duì)照組，沒有細(xì)胞只加入相同體積新鮮培養(yǎng)液的一組設(shè)為陽(yáng)性對(duì)照組。

細(xì)胞存活率/%=(A試驗(yàn)組-A陽(yáng)性對(duì)照組)/(A陰性對(duì)照組-A陽(yáng)性對(duì)照組)×100%

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞凍存與復(fù)蘇

松江鱸腎細(xì)胞凍存30 d后復(fù)蘇，細(xì)胞貼壁情況良好，36～48 h后，可以鋪滿瓶底。經(jīng)計(jì)算，存活率為(90.8±1.37)%。

2.2 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

由第75代松江鱸腎細(xì)胞生長(zhǎng)曲線可見，在25 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中，于20% FBS-DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)的松江鱸腎組織細(xì)胞在0～2 d處于潛伏期，2～4 d進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，4～6 d進(jìn)入穩(wěn)定期(圖1)，經(jīng)計(jì)算，松江鱸腎組織細(xì)胞的群體倍增時(shí)間為55.2 h。

2.3 染色體分析

通過(guò)對(duì)35代松江鱸腎組織細(xì)胞中100個(gè)圖像清晰、中期分裂相分散較好的松江鱸腎細(xì)胞的染色體進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)染色體數(shù)目分布為37～42，其中染色體眾數(shù)為40的細(xì)胞占全部計(jì)數(shù)細(xì)胞的70%。通過(guò)核型分析可知，核型公式為K(2n)=40=16m+10sm+14t，NF=76，即松江鱸腎細(xì)胞有8對(duì)中部著絲點(diǎn)染色體(m)，5對(duì)亞中部著絲點(diǎn)染色體(sm)，7對(duì)端部著絲點(diǎn)染色體(t)(圖2、圖3)。

圖1 第75代松江鱸腎細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

圖2 松江鱸腎細(xì)胞的染色體數(shù)目分布

圖3 松江鱸腎細(xì)胞的中期分裂相

2.4 兩種病毒對(duì)松江鱸腎細(xì)胞的感染試驗(yàn)

正常松江鱸腎細(xì)胞為長(zhǎng)纖維型(圖4a)，被鯉春病毒血癥病毒感染3 d后的松江鱸腎細(xì)胞收縮變圓、折光度增加，聚集成團(tuán)或解體死亡。感染4 d后的松江鱸腎細(xì)胞碎片增多，細(xì)胞脫落，產(chǎn)生典型細(xì)胞病變效應(yīng)(圖4b)，經(jīng)測(cè)定病毒滴度為106.53/mL。在盲傳2代后發(fā)現(xiàn)松江鱸腎細(xì)胞對(duì)魚類諾達(dá)病毒不敏感，細(xì)胞未出現(xiàn)病變。

2.5 鎘離子對(duì)松江鱸腎細(xì)胞成活率的影響

用不同濃度的氯化鎘處理松江鱸腎細(xì)胞后，隨著鎘離子濃度的增加松江鱸腎細(xì)胞存活率逐漸降低，細(xì)胞存活率與鎘離子濃度有明顯的劑量依賴關(guān)系(圖5)。根據(jù)存活率與濃度的自然對(duì)數(shù)劑量—效應(yīng)方程y=-0.00448x+1.1025(r2=0.95832)，可得半致死濃度為(130±9.1) μmol/L。當(dāng)鎘離子濃度達(dá)到200 μmol/L時(shí)，細(xì)胞難以存活。

圖4 正常松江鱸腎細(xì)胞(a)和接種病毒后的典型細(xì)胞病變效應(yīng)(b)

圖5 鎘離子對(duì)松江鱸腎細(xì)胞成活率的影響

3 討 論

3.1 松江鱸腎細(xì)胞生長(zhǎng)特性分析

曾有研究提出松江鱸腎細(xì)胞系的染色體數(shù)目與本試驗(yàn)結(jié)果相同，均為2n=40，但是其染色體臂數(shù)為NF=64和NF=60[26]，與本試驗(yàn)中的核型公式K(2n)=40=16m+10sm+14t中NF=76不同。分析可能為松江鱸所處的生活環(huán)境和取樣時(shí)間不同所致。

李樹深[27]指出，染色體端部著絲粒較多的種類為原始種類，中部和亞中部著絲粒較多的是特化種類，染色體臂數(shù)較少的類群同染色體臂數(shù)較多的類群相比，染色體臂數(shù)較多的類群特化。絨杜父魚(Hemitripterusvillosus)同松江鱸同屬于杜父魚科，其核型為2n=46=20m+16sm+10t，NF=82[28]。絨杜父魚的染色體臂數(shù)多于松江鱸，說(shuō)明絨杜父魚相比松江鱸，為特化類群，松江鱸端部著絲粒多于絨杜父魚，中部和亞中部著絲粒少于絨杜父魚，由此可以說(shuō)明，松江鱸相較絨杜父魚，為原始種類。

3.2 松江鱸腎細(xì)胞的病毒敏感性

一般情況下，動(dòng)物病毒對(duì)物種及其細(xì)胞系的敏感性均有特異性。但是有研究表明，一種魚類細(xì)胞系對(duì)幾種病毒均具有敏感性，例如斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)腦組織細(xì)胞系(GB11)對(duì)神經(jīng)壞死病毒(Neuronecrosisvirus)和石斑魚虹彩病毒(Grouperiridovirus)敏感[29]。同時(shí)也有研究發(fā)現(xiàn)，一種病毒能感染幾種細(xì)胞系，例如中華鱉病毒(Trionyxsinesisvirus)能使鯉魚上皮乳狀瘤細(xì)胞、鰻鱺性腺細(xì)胞和草魚卵巢細(xì)胞產(chǎn)生病變[30]；神經(jīng)壞死病毒感染斜帶石斑魚腦細(xì)胞[29]和花鱸(Lateolabraxmaculatus)腦細(xì)胞[31]后，均能使細(xì)胞產(chǎn)生病變。

鯉春病毒血癥病毒，又名鯉彈狀病毒，屬?gòu)棤畈《究?，水泡病毒?Vesiculorirus)。鯉春病毒血癥是由鯉春病毒血癥病毒引起鯉魚科的一種急性、出血性、傳染性疾病，死亡率極高，多發(fā)于鯉科魚類，是全球性魚類疾病[32]。研究表明，本試驗(yàn)建立的松江鱸腎組織細(xì)胞系對(duì)鯉春病毒血癥病毒敏感，可用來(lái)分離和擴(kuò)增該病毒。目前在松江鱸的人工養(yǎng)殖中尚未發(fā)現(xiàn)大規(guī)模病毒病的暴發(fā)，但腎組織細(xì)胞系的建立可為將來(lái)病毒病的研究打下基礎(chǔ)。

3.3 鎘離子對(duì)松江鱸腎細(xì)胞成活率的影響

鎘是我國(guó)水生生態(tài)系統(tǒng)中常見的重金屬污染物，具有高致毒性，較低劑量的鎘就能使水生動(dòng)物中毒，甚至死亡[33]。本試驗(yàn)用不同濃度的鎘離子處理松江鱸腎細(xì)胞24 h后，結(jié)果顯示，隨著鎘離子濃度的升高細(xì)胞存活率降低，半致死濃度為(130±9.1) μmol/L。近年來(lái)，關(guān)于鎘離子對(duì)魚類的毒性研究較多，鎘離子對(duì)大彈涂魚(Boleophthalmuspectinirostris)的半致死濃度為433.2 μmol/L[34],對(duì)鯽魚和泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)的半致死濃度分別為344 μmol/L和351 μmol/L[35]，說(shuō)明相對(duì)于成體魚，細(xì)胞系對(duì)鎘離子更敏感，這可能與魚體本身具有自我調(diào)節(jié)能力有關(guān)，但也說(shuō)明細(xì)胞系更適宜用來(lái)作為水質(zhì)監(jiān)測(cè)的指標(biāo)和機(jī)理研究。