雒曉芳，許淑娟，潘和平*

1西北民族大學實驗教學部；2西北民族大學生命科學與工程學院，蘭州 730030

鐵皮石斛是蘭科石斛屬的多年生草本植物。不僅是傳統(tǒng)的珍貴中藥材，也是高檔的觀賞花卉，擁有很高的觀賞價值。鐵皮石斛含有多種內(nèi)生真菌，但只有一些內(nèi)生真菌能有效地促進石斛的生長發(fā)育，組織、宿主、環(huán)境等因素的影響在組織和宿主中表現(xiàn)出一定的差異[1]。

微生物與植物體相互作用關(guān)系由來已久，大多數(shù)植物體的根、莖、葉中都分布著數(shù)量眾多和種類繁多的微生物[2]。內(nèi)生菌作為植物微生態(tài)系統(tǒng)中的天然組成部分，對植物具有多方面的積極作用。在生物防治上，植物內(nèi)生菌系統(tǒng)地分布于植物體內(nèi)，有充分的碳源和氮源的供應(yīng)，比暴露于外界的惡劣環(huán)境中更有利于發(fā)揮作用[3]。所以具有重要經(jīng)濟價值和藥用價值的鐵皮石斛內(nèi)生真菌成為篩選新活性物質(zhì)的重要資源[4-8]。

隨著人們對天然色素的關(guān)注度不斷提高，現(xiàn)在人們發(fā)現(xiàn)某些細菌、真菌等微生物產(chǎn)生的色素也可以作為天然染料用于紡織品的染色中，成為天然染料的新的一大來源[9-11]。天然色素的色澤不穩(wěn)定，在使用過程中易受多種因素(如光、溫度、氧化、pH值、介電極性等)的影響，并影響褪色和變色，影響其著色效果[12-18]。因此研究色素的穩(wěn)定性具有非常重要的意義。

本實驗從鐵皮石斛中分離出1株產(chǎn)色素的內(nèi)生真菌，其色素為水溶性胞外色素。以這株產(chǎn)橙紅色色素鐵皮石斛內(nèi)生菌為材料，對產(chǎn)生橙紅色色素的穩(wěn)定性進行初步探究，為該色素進一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實驗材料

在云南省普洱市寧洱縣五里坡選取生長優(yōu)良，表面無病蟲害的仿野生生長三年以上整個植株。觀察形態(tài)特征，綠桿“硬腳”，植株莖較圓，與節(jié)部有黑褐色環(huán)狀間隙，萼片和花瓣黃綠色，經(jīng)由西北民族大學生命科學與工程學院郭鵬輝老師和實驗教學部微生物學分室的雒曉芳老師鑒定為鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)。

1.2 培養(yǎng)基

麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基：氯霉素0.1 g ，pH為6.0±0.2，麥芽膏粉30 g ，瓊脂15 g蒸餾水1 L，121 ℃高壓滅菌30 min。

馬鈴薯瓊脂糖培養(yǎng)基(PDA)， pH為6.0：把土豆沖洗干凈，去皮。將200 g切成小塊，加入純水1 L，煮沸半小時，補純水至1 L。在濾液中加入10 g瓊脂，煮沸后加入20 g糖，溶解(用糖培養(yǎng)霉菌，用葡萄糖作酵母培養(yǎng)物)補水，121分鐘滅菌30 min。

高鹽察氏培養(yǎng)基：氯化鉀0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g ，氯化鈉60 g ，蔗糖30 g ，瓊脂20 g ，蒸餾水1 L， 121 ℃高壓滅菌30 min。

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏 1 g ，酵母膏 2 g，蛋白胨 5 g ，NaCL 5 g ，瓊脂 15 g，加水定容至1 L。調(diào)pH為7.4，加熱溶解，121 ℃高壓滅菌30 min。

LB固體培養(yǎng)基：胰化蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 5 g，瓊脂粉15 g，搖動容器直至溶質(zhì)溶解。用5mol/L NaOH調(diào)pH至7.4，去離子水定容至1 L。 加熱溶解，121 ℃高壓滅菌30 min.。

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：牛肉膏1 g ，酵母膏2 g，蛋白胨5 g，NaCl 5 g，瓊脂15 g，加水定容至1 L。調(diào)PH為7.4，加熱溶解，121 ℃高壓滅菌30 min。

LB液體培養(yǎng)基：胰化蛋白胨10 g，酵母提取物 5 g，NaCl 5 g，搖動容器直至溶質(zhì)溶解。用5mol/L NaOH調(diào)pH至7.4，去離子水定容至1 L。 加熱溶解，121 ℃高壓滅菌30 min。

1.3 試劑

鹽酸、蔗糖、氫氧化鈉、無水乙醇、異丙醇、10%SDS、雙氧水、1X TAE(pH 8.0)、1%氯化汞、亞硫酸鈉、硫酸雙氫鏈霉素、青霉素G鉀 、10 mg/mL Rnase(Sigma)、PCR試劑盒、乳酸石炭酸棉藍染色液、5%石炭酸水溶液。

2 方法

2.1 菌種篩選

選取新鮮健康的鐵皮石斛植株的根段、莖段和葉片用流水沖洗干凈，按照插片法將切片等距離均勻分別放置于含鏈霉素(50～100 mg/L)和青霉素(100～300 mg/L)的5種固體培養(yǎng)基上(3～4片/皿)，分別為麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基、高鹽察氏培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基。于26 ℃黑暗條件下培養(yǎng)5～10天待切片周圍長成肉眼可見的菌落時，以平板劃線法分離真菌培養(yǎng)。將初篩后獲得的一株優(yōu)勢菌種連續(xù)富集培養(yǎng)三次。富集培養(yǎng)均無出現(xiàn)雜菌，繼續(xù)以平板劃線法分離純化菌株，重復(fù)三次。通過肉眼對培養(yǎng)特征的觀察選擇生長優(yōu)良的菌株。將所得的單菌株接于斜面上26 ℃培養(yǎng)3～5天后，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 真菌鑒定

真菌菌體用液氮研磨后提取總DNA，然后用ITS擴增引物ITS1和ITS4進行PCR擴增并測序。將測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(NR) 進行比對，并將序列進行BLAST比對，構(gòu)建進化樹。

2.3 色素測定

2.3.1 色素的提取

用接種環(huán)取活化后的菌絲體于麥芽汁瓊脂固體培養(yǎng)基中，在 26 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)3～5天。至產(chǎn)生的色素達到飽和時除去菌絲體，保留僅存色素的培養(yǎng)基，然后按體積比1∶2(w/v)加入蒸餾水在60 ℃水浴條件下進行浸提1 h，經(jīng)過8層紗布過濾掉培養(yǎng)基等大塊的固體雜質(zhì)，用濾紙過濾后37 ℃烘箱干燥得到橙紅色素粗提物。用蒸餾水配制濃度為 1% 的色素溶液作為母液。

2.3.2 色素吸收光譜曲線的測定

取1%的色素溶液，用G10S UV-VIS雙光束紫外可見分光光度計在 300～700 nm 范圍內(nèi)掃描，以 10 nm為掃描間隔，記錄數(shù)據(jù)，利用 Excel軟件分析找到最大吸收波長。測出的最強吸收峰波長值將作為后續(xù)實驗中的參考值。

2.3.3 色素色價測定

色價測定參照GB 1886.34-2015 “食品安全國家標準食品添加劑辣椒紅”的方法做了適當調(diào)整：準確稱取0.25 g 色素粗品，精確至 0.000 2 g，用蒸餾水溶解于 25 mL 的容量瓶中，配制成濃度為 1% 的色素溶液，適當稀釋使吸光值控制在 0.3 ～ 0.7 范圍內(nèi)，用蒸餾水為對照，測定其在最大吸收波長處的吸光值。色價 E 和色價保存率計算公式如下：

2.4 色素的穩(wěn)定性研究

2.4.1 溫度對色素穩(wěn)定性的影響

取適當稀釋后的色素溶液，分別置于 4、20、40、60、80、100 ℃ 恒溫水浴鍋中避光保溫 1 h，迅速冷卻至常溫觀察顏色變化，以蒸餾水為對照分別測定其在最大吸收波長處的吸光值，計算色素色價保存率。

2.4.2 pH對色素的影響

取適當稀釋后的色素溶液，分別用 1mol/mL NaOH 和 1mol/mL HCl調(diào)節(jié) pH 為 2、4、6、8、10、12，室溫避光靜置 1 h，觀察顏色變化，分別測定其在最大吸收波長處的吸光值計，計算色素色價保存率。

2.4.3 光照對色素穩(wěn)定性的影響

取 5 mL 適當稀釋的色素溶液于玻璃皿中，用保鮮膜封口，分別置于自然光照、紫外光照和避光條件下持續(xù)處理 24 h，分別測定其在3、6、9、12 h時的最大吸收波長處的吸光值，計算色素色價保存率。

2.4.4 氧化劑與還原劑對色素穩(wěn)定性的影響

取9 mL 適當稀釋的色素溶液，分別加入 1 mL濃度為 0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%的氧化劑 H2O2和濃度為 0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%的還原劑Na2SO3。室溫避光靜置 1 h，分別測定其在最大吸收波長處的吸光值，計算色素色價保存率。

2.4.5 金屬離子對色素穩(wěn)定性的影響

取9 mL 適當稀釋的色素溶液，分別加入 1 mL濃度為1%的5種金屬離子溶液FeCl3、ZnSO4、CuSO4、CaCl2和MnCl2，室溫避光靜置1 h，分別測定其在最大吸收波長處的吸光值，計算色素色價保存率。

2.4.6 常見添加劑對色素穩(wěn)定性的影響

取9 mL 適當稀釋的色素溶液，分別加入 1 mL濃度為5%、10%、15%、20%、25%的NaCl、蔗糖、葡萄糖溶液。室溫避光靜置 1 h，分別測定其在最大吸收波長處的吸光值，計算色素色價保存率。

3 結(jié)果與分析

3.1 菌株的形態(tài)特征

用5種不同的固體及對應(yīng)的液體培養(yǎng)基經(jīng)過初篩、富集培養(yǎng)以及分離純化，得到一株鐵皮石斛優(yōu)勢內(nèi)生真菌，將其命名為X1。菌株 X1菌落在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)26 ℃培養(yǎng)3天，即形成較典型的菌落，菌落呈白色、蛛網(wǎng)狀，無隔。分生孢子梗發(fā)生于基質(zhì)，壁平滑，帚狀枝為雙輪生或三輪生，梗基每輪2～3個，瓶梗每輪4～8個，分生孢子為橢圓形，壁平滑，分生孢子鏈圓柱狀。

3.2 分子生物學鑒定

3.2.1 16S rDNA擴增

圖1 X1的 PCR電泳圖Fig.1 Electrophoretic diagram of X1

Marker條帶組成：100 bp，250 bp，500 bp，750 bp，1 000 bp，2 000 bp，3 000 bp，5 000 bp。750 bp條帶濃度為60 ng/3 μL，顯示為加亮帶，其余條帶濃度均為30 ng/3 μL。電泳方向從下向上。

3.2.2 進化樹構(gòu)建

將X1菌株鐵皮石斛內(nèi)生真菌優(yōu)勢菌的16S rDNA的核酸序列經(jīng)序列用比對用軟件MEGA5.1進行多重比對并繪制了系統(tǒng)進化樹。結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明：X1菌株與鏈孢霉菌屬中的Neurosporaafricana的16S rDNA序列有99%的同源性，可見X1與鏈孢霉菌具有較近的遺傳距離。結(jié)合形態(tài)學及分子生物學染色實驗結(jié)果綜合分析，將X1與鏈孢霉菌屬中的Neurosporaafricana具有較近的遺傳距離。

圖2 X1系統(tǒng)進化樹Fig.2 Ehylogenetic tree of X1

3.3 色素穩(wěn)定性

3.3.1 不同波長條件下色素紫外吸收光曲線

圖3 不同波長下橙紅色色素的OD曲線Fig.3 The OD curve of orange red pigment at different wavelengths

由圖3可知，300～210 nm范圍內(nèi)為下降趨勢，320～400 nm范圍內(nèi)為持續(xù)上升，至400～700 nm為緩慢下降的趨勢，故可得最大吸收峰為波長λ為400 nm。故本實驗選擇400 nm 作為最大吸收波長。

3.3.2 不同溫度條件對色素色價的影響

圖4 不同溫度對色素色價的影響Fig.4 The effect of different temperatures on the color color of the pigment

由圖4可知，20～60 ℃時色素的保存率處于上升階段，60～100 ℃是色素的保存率則處于連續(xù)下降階段，溫度為60 ℃時其色價保存率最好為82%即對色素的影響較小，對色素有護色反應(yīng)。所以選擇60 ℃作為該色素的提取溫度。

3.3.3 不同pH值對色素色價的影響

圖5 不同pH值對色素色價的影響Fig.5 The effect of different pH on the color value of pigment

用 1mol/m L Na OH 和 1mol/m L HCl調(diào)節(jié)經(jīng)稀釋的色素溶液的pH 分別為 2、4、6、8、10、12，室溫放置1 h，取不同pH的1 mL色素溶液測定吸光度值。由圖5可知，pH為2～8時的色價保存率持續(xù)上升，pH在8～12的時候連續(xù)下降，所以色價保存率最好為pH=8時，色價保存率為56%。說明pH的變化對色素的色價影響較大。色素宜儲存于中性或弱堿性環(huán)境，強堿性環(huán)境比酸性環(huán)境對色素的色價穩(wěn)定性影響更大。

3.3.4 不同光照條件對色素穩(wěn)定性的影響

圖6 不同光照條件對色素色價的影響Fig.6 The effect of different light on the color price of pigment

將10 mL色素溶液放置于自然光、紫外、避光三個條件下室溫持續(xù)處理12 h。每3 h取1 mL的色素溶液測定吸光度值。由圖6可知，紫外條件下，0～6 h范圍內(nèi)色素溶液的色價持續(xù)上升，6～12 h色素溶液色價持續(xù)下降。自然光條件下，0～3 h色價先下降，3～6 h色價上升，6 h后色素溶液色價持續(xù)下降。避光條件下，對該色素色價的影響可忽略不計。在自然光和紫外條件下， 6 h時均會發(fā)生增色反應(yīng)，間接證明紫外對該色素具有增色反應(yīng)。避光條件下，對該色素的色價影響可忽略不計，可將色素溶液避光保存。

3.3.5 不同濃度H202和Na2SO3溶液對橙紅色素穩(wěn)定性的影響

圖7 H202和Na2SO3對色素色價的影響Fig.7 The effect of H2O2 and Na2SO3 on color value of pigment at different concentrations

由圖7可知，經(jīng)氧化劑H202和還原劑Na2SO3處理后，色素對H202和Na2SO3溶液較敏感。隨著濃度的上升，整體呈下降趨勢，對色素一直保持減色反應(yīng)。

3.3.6 不同金屬離子對色素穩(wěn)定性的影響

圖8 不同金屬離子溶液對色素色價的影響Fig.8 The effect of different metal ion in the solution of the dye color value

由圖8可知，濃度為1%的Fe3+、Zn2+、Cu2+、Ca2+和Mn2+5種金屬離子溶液對色素溶液均有不同程度影響。其中，F(xiàn)e3+、Ca2+對色素溶液具增色反應(yīng)，Zn2+、Cu2+、Mn2+對色素溶液有保色效果。

3.3.7 不同常見添加劑對色素穩(wěn)定性的影響

由圖9可知，經(jīng)不同濃度NaCl溶液處理后，5%～10%范圍內(nèi)色素色價呈上升趨勢，于10%時色素色價達到峰值，10%之后色素溶液色價持續(xù)下降。經(jīng)不同濃度葡萄糖溶液處理后，5%～15%范圍內(nèi)色素色價呈上升趨勢，15%時色素色價達到峰值，15%～25%色素溶液色價持續(xù)下降。不同濃度的蔗糖對該色素的色價幾乎沒有影響。

圖9 不同常見添加劑對色素色價的影響Fig.9 The effect of different common additives on color Price of pigments

4 討論

內(nèi)生真菌(endophytic fungi) 指長期生活在植物的根、莖、葉等器官的組織內(nèi)部，但一般不引發(fā)植物體病害的真菌。鏈格孢是經(jīng)濟上重要的真菌屬之一。大多數(shù)種類兼性寄生于植物上， 引起多種經(jīng)濟植物病害，造成田間和產(chǎn)后損失。有幾個鏈格孢小孢子種可侵染人和動物， 引起皮癬、甲癬、顎骨髓炎等疾病。鏈格孢產(chǎn)生的某些真菌毒素是重要的致癌因素。另一方面， 鏈格孢也是有應(yīng)用潛力的生物資源， 如一些鏈格孢次生代謝物具有殺蟲、殺菌和殺原生生物活性。長柄鏈格孢中某些菌株分生孢子壁中含有激發(fā)子組份， 可被用來制成防治煙草赤星病的生防制劑等[19]。X1菌株與脈孢菌中的Neurosporaafricana親源關(guān)系最近，為99%。脈孢菌屬在遺傳研究及生化途徑研究上廣泛應(yīng)用，且其菌體內(nèi)含豐富蛋白質(zhì)、維生素B12等，可用于工業(yè)發(fā)酵和制作飼料。

發(fā)現(xiàn)并選擇能夠大量生產(chǎn)色素的真菌，作為一種新型的天然染料應(yīng)用與紡織品的染色中，利用真菌培養(yǎng)的優(yōu)勢對于色素進行工業(yè)化生產(chǎn)，將有望解決天然植物染料不能滿足人們的需求的難題，使得天然染料更好的為人們使用[20]。因此，本實驗選擇X1內(nèi)生真菌所產(chǎn)生的橙紅色色素對其穩(wěn)定性進行初期研究。經(jīng)研究分析，發(fā)現(xiàn)該水溶性橙紅色色素色價保存率易受到批次影響，不同批次的1%色素溶液色價均有差異。并且也發(fā)現(xiàn)該色素溶液不能低溫保存，低溫保存對其色價有很大影響。每次提取配制的色素溶液，只可以于常溫避光放置一周。后續(xù)實驗將會通過多個單因子實驗和正交實驗對橙紅色色素的提取工藝進行優(yōu)化，為色素進行工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。