miR-146a多態(tài)性與非小細(xì)胞肺癌易感性的研究

應(yīng) 偉，王興遠(yuǎn)，江 波，周 偉*

(廣安市人民醫(yī)院腫瘤科，四川 廣安 638000)

肺癌是全球癌癥死亡的主要原因，每年造成100多萬(wàn)人死亡[1]，85%的病例為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)。NSCLC是一種上皮細(xì)胞惡性腫瘤，又分為腺癌、鱗狀細(xì)胞癌和大細(xì)胞癌[2]，究其病因主要有遺傳和環(huán)境因素[3-4]，遺傳因素中目前已經(jīng)鑒定了一些NSCLC突變基因，如EGFR和KRAS[5-8]，但其確切的發(fā)病機(jī)制仍不清楚。近年來(lái)，隨著基因組研究的不斷發(fā)展，單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)與NSCLC的關(guān)系逐步被揭示[9]。包括微小RNA(miRNA)的SNP，miRNA屬于非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后參與調(diào)節(jié)靶miRNA，可調(diào)節(jié)的基因多達(dá)人類基因的30%[10-12]。已有研究[13-14]發(fā)現(xiàn)一些miRNA與肺癌的風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后顯著相關(guān)。Takamizawa等[15]報(bào)告let-7 miRNA的低表達(dá)促進(jìn)肺癌的進(jìn)展，而Hayashita等[16]發(fā)現(xiàn)miR-17-92上調(diào)可能降低肺癌風(fēng)險(xiǎn)。在遺傳因素中miRNA SNP與肺癌的發(fā)生密切相關(guān)，可能是SNP可以改變miRNA的生物學(xué)功能，進(jìn)而影響個(gè)體罹患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)[17-19]。為此本文通過(guò)對(duì)四川廣安地區(qū)漢族人群miR-146a rs2910164 G/C基因多態(tài)性分析，探討其與非小細(xì)胞肺癌遺傳易感性的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集四川省廣安市人民醫(yī)院2016年3月—2018年3月收治入院的非小細(xì)胞肺癌患者，共采集198例患者的靜脈血標(biāo)本作為病例組。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理學(xué)確診為原發(fā)性NSCLC、未進(jìn)行抗癌治療、無(wú)腫瘤家族史，其中鱗癌81例、腺癌115例、腺鱗癌2例。排除標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)檢查排除肺部占位性病變、無(wú)痰中帶血或血痰、胸痛等癥狀。對(duì)照組218例為同期醫(yī)院體檢的健康人群。

1.2 試劑與儀器

miR-146a引物和2×Taq PCR Master Mix(Qiagen生物科技有限公司)，標(biāo)準(zhǔn)酶試劑盒(英國(guó)RNADOX公司)，Gold View I型核酸染色劑(上海拜力生物科技有限公司)，Sac I-HF限制性核酸內(nèi)切酶(Fermentas公司)，核酸提取試劑盒(北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司)。DHG-9140A型鼓風(fēng)干燥機(jī)(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，S21-6電熱恒溫水浴箱(上海博訊儀器公司)，可調(diào)微量移液器(德國(guó)Eppendorf公司)，ChemiDoc XRC凝膠電泳成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.3 標(biāo)本采集

采用真空抗凝(EDTA)管采集空腹靜脈外周血3 mL，3 000 r/min離心10 min，收集血細(xì)胞，置于-80℃冷凍貯存、待檢。

1.4 基因型分析

采用酚-氯仿抽提法對(duì)血液樣本進(jìn)行DNA提取，通過(guò)Nanodrop檢測(cè)其濃度后用PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)技術(shù)檢測(cè)基因型，miR-146a rs2910164基因的引物上游為5'-CATGGGTTGTTGTGTCAGTGTCAG AGCT-3'，下游為5'-AACCTTCTGACCTCTGTCTTCCG T-3'，PCR反應(yīng)體系10 μL中含模板 DNA 1 μL，上游引物 2 μL，下游引物 2 μL，2×Taq PCR Master Mix 4 μL，去離子水4.6 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性34 min，94℃、30 s，58℃、30 s，72℃、1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 延伸5 min。用Sac I-HF酶對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，并置于37℃恒溫水浴4 h、取出進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)及染色。最后基因型由2位研究者進(jìn)行判讀，若判讀結(jié)果不一致時(shí)，則重新檢測(cè)1次。隨機(jī)抽取10%的樣本進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)算基因型的頻率及是否符合Hardy-Weinberg平衡。單因素及多因素Logistic回歸分析，計(jì)數(shù)資料采用單因素χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)和比值比(OR)計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)比例與95%可信區(qū)間(confidence intervals，CI)。均以雙側(cè)α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象一般資料

病例組和對(duì)照組在性別、年齡的分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，吸煙在兩組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 對(duì)照組與病例組人群一般資料的比較

2.2 rs2910164酶切結(jié)果

rs2910164被酶切成 GG、GC、CC基因型(圖1)，CC基因型為122和25 bp 2條帶；GC基因型為147、122和25 bp 3條帶；GG基因型為147 bp和25 bp 2條帶；3種基因型中25 bp條帶均未顯示。

圖1 rs2910164酶切后電泳圖

2.3 rs2910164基因分型與測(cè)序

GG、GC、CC分型在對(duì)照組分別為103例(47.25%)、85例(38.99%)、30例(13.76%)；在病例組分別為 31 例(15.66%)、99 例(50.00%)、68 例(34.34%)。隨機(jī)抽取10%的樣本進(jìn)行DNA測(cè)序，見(jiàn)圖2。其結(jié)果與PCR-RFLP分型結(jié)果一致，基因分型頻率滿足Hardy-Weinberg遺傳平衡(P>0.05)。

2.4 rs2910164基因型與非小細(xì)胞肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系

不同基因模型下的Logistic回歸分析結(jié)果見(jiàn)表2。CC基因型顯著增加非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[OR(95%CI)為7.26(6.69，7.87)]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，校正性別、年齡、吸煙因素后OR(95%CI)為6.82(6.28，7.41)，差異亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。顯性基因模型中GC/CC可使非小細(xì)胞肺癌的患病風(fēng)險(xiǎn)增加5.14倍，校正混雜因素后OR(95%CI)為5.04(4.72，5.39)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。隱性基因模型中，CC基因型罹患非小細(xì)胞肺癌的風(fēng)險(xiǎn)是GG/GC基因型的2.94倍，校正性別、年齡、吸煙因素后差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。等位基因模型中C等位基因明顯增加人群罹患非小細(xì)胞肺癌的風(fēng)險(xiǎn)，OR(95%CI)為2.92(2.21，3.89)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖2 rs2910164基因測(cè)序結(jié)果

表2 rs2910164基因型與非小細(xì)胞肺癌風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系

2.5 rs2910164與非小細(xì)胞肺癌臨床特征之間的關(guān)系

在病例組中，根據(jù)不同的腫瘤特征進(jìn)行分組(表3)，采用Logistic回歸分析顯性基因模型與非小細(xì)胞肺癌臨床特征的關(guān)系。通過(guò)校正吸煙、性別、年齡等因素，各個(gè)基因模型與非小細(xì)胞肺癌病理類型、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間無(wú)明顯相關(guān)性，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 rs2910164與非小細(xì)胞肺癌臨床特征之間的關(guān)系

2.6 基因-環(huán)境的交互分析

采用非條件Logistic回歸“后退法”，在校正性別、年齡的前提下，將吸煙納入回歸模型。結(jié)果顯示rs2910164 GC和CC基因型與吸煙之間無(wú)交互作用(β=-0.048，P=0.520；β=-0.145，P=0.088)。見(jiàn)表4。

表4 吸煙與基因型的交互作用

3 討論

miR-146包括miR-146a、miR-146b，其中miR-146a位于人類5號(hào)染色體loc285628的外顯子區(qū)域，具有較高的穩(wěn)定性和保守性，并在轉(zhuǎn)錄后通過(guò)與靶基因集合參與多種生物學(xué)過(guò)程(包括免疫、炎癥、腫瘤等)[20-21]。在參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中，可能是由于rs2910164 G到C等位基因的突變導(dǎo)致G∶U與C∶U之間的錯(cuò)配，使得成熟miR-146a的產(chǎn)生與表達(dá)受到影響[22]，含有C等位基因miR-146a前體的轉(zhuǎn)錄活性較低，最終影響miR-146a與靶mRNA的結(jié)合[23]，進(jìn)而影響了個(gè)體罹患腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)。

迄今為止，有關(guān)miR-146a rs2910164基因多態(tài)性在腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)中的研究較多，但存在諸多的不一致。例如，雜合子基因型GC可增加人群罹患甲狀腺乳頭狀癌的風(fēng)險(xiǎn)[24]；Shen等[25]研究發(fā)現(xiàn)C等位基因可增加人群罹患家族性乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)；Xu等[26]發(fā)現(xiàn)CC基因型可降低罹患前列腺癌的風(fēng)險(xiǎn)；Jeon等[27]報(bào)道攜帶CG/GG基因型的個(gè)體與韓國(guó)人群中的CC基因型相比，肺癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)明顯降低。Xiao等[28]通過(guò)對(duì)6篇病例-對(duì)照研究進(jìn)行Meta分析發(fā)現(xiàn)，miR-146a rs2910164 CC基因型與GG基因型相比可增加人群罹患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)；Fang等[29]研究發(fā)現(xiàn)肺癌病例組中CC基因型、C等位基因較正常對(duì)照組中明顯增多；Vinci等[30]發(fā)現(xiàn)rs2910164 GC基因型可顯著增加非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。上述研究結(jié)果表明rs2910164基因多態(tài)性與腫瘤的易感性之間存在明顯的差異性。本次研究表明，廣安地區(qū)漢族人群miR-146a rs2910164基因多態(tài)性C等位基因可增加人群罹患非小細(xì)胞肺癌的風(fēng)險(xiǎn)，攜帶GC/CC基因型的個(gè)體患肺癌的危險(xiǎn)性增加5.04倍。

研究[13-14]表明miRNA與肺癌的風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后顯著相關(guān)，為進(jìn)一步探討rs2910164基因多態(tài)性與NSCLC臨床特征之間的關(guān)系，本研究通過(guò)顯性基因模型下的不同特征分析，并未發(fā)現(xiàn)rs2910164基因多態(tài)性與NSCLC的臨床特征有關(guān)聯(lián)。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)rs2910164 C等位基因可增加人群罹患NSCLC的風(fēng)險(xiǎn)，但由于SNP在不同種族、人群、生活環(huán)境等的差異，在未來(lái)仍需要進(jìn)一步的大樣本、多中心的研究加以驗(yàn)證。