丁秀秀，黃琳惠，黃奕江

(海南省人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，?？?570311)

趨化因子(chemotactic cytokines,CC)可以促進(jìn)白細(xì)胞移動[1]，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)70多種趨化因子以及40多種趨化因子受體。趨化因子和其受體結(jié)合，可以在肺部疾病中起到重要的作用[2-3]。CC作為趨化家族中的一員[4-5]，常在肺部感染中起作用[6]，其主要針對的是CC單核或者巨噬細(xì)胞[7-8]。當(dāng)肺部發(fā)生感染時，CC及其受體的缺乏或者過低的含量表達(dá)，可以使初級免疫細(xì)胞巨噬細(xì)胞的肺部浸潤變少，從而減少其吞噬殺菌的功能[9]。在肺葉組織中，最多的細(xì)胞為肺泡巨噬細(xì)胞, 而巨噬細(xì)胞是人體固有免疫系統(tǒng)的初級防御[10]。有當(dāng)肺組織受到炎癥因子刺激以后，細(xì)胞膜上的TLR受體會被活化[11]，之后通過級聯(lián)信號傳遞，活化下游通路，最終激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB轉(zhuǎn)位入核，誘導(dǎo)炎癥因子轉(zhuǎn)錄表達(dá)。但是大量炎癥因子的表達(dá)，會促進(jìn)炎癥的級聯(lián)放大，形成肺內(nèi)炎癥“瀑布”反應(yīng)，導(dǎo)致ALI/ARDS的發(fā)生[12-13]。TRIF蛋白基因被敲除的小鼠，在刺激其TLR3和TLR4受體時，其NF-κB的轉(zhuǎn)位入核活性會明顯降低[14-15]，炎癥因子的分泌也會顯著減少，從而得出炎癥因子的分泌是通過TLR受體的激活從而激活下游的NF-κB通路。在敲除TAK1蛋白基因以后，可以能下調(diào)由脂多糖所誘導(dǎo)的NF-κB蛋白的活化和炎癥因子表達(dá)。小RNA也可以調(diào)控炎癥反應(yīng)。雖然小RNA不參與編碼蛋白，但是卻可以抑制mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)蛋白，互補(bǔ)降解掉目的基因，這在研究中非常的重要，可以通過小mRNA去除掉對實驗或者生命體有影響的目的基因。研究發(fā)現(xiàn)，檢測脂多糖(LPS)處理A549細(xì)胞前后發(fā)生顯著變化的miRNAs，并驗證miR-1247-3P在不同濃度LPS處理后細(xì)胞中有高表達(dá)，提示其可能在ARDS的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用[16]。故本研究選擇microRNA-1247作為研究靶點，并且由于CC趨化因子配體16是調(diào)控炎性介質(zhì)的關(guān)鍵因子，故推斷miR-1247-3P有可能通過靶向CC趨化因子配體16而發(fā)揮作用，該推斷已經(jīng)在預(yù)實驗中得到驗證。本研究即探討microRNA-1247通過趨化因子CC配體16抑制脂多糖誘導(dǎo)的急性肺炎的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選取雌性清潔級8周齡BALB/c小鼠30只，體重每只約22～25 g，由海南醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供[SCXK(瓊)2016-0009]，小鼠飼養(yǎng)于溫度20℃～28℃清潔級鼠籠[SYXK(瓊)2014-0025]。

1.2 主要試劑與儀器

脂多糖溶液(美國Sigma公司，批號：Sigma-L2880)；兔抗小鼠IRAK6多克隆抗體(Abcam公司，英國)；兔抗小鼠TAK多克隆抗體(Abcam公司，英國)；兔抗小鼠IKK多克隆抗體(Abcam公司，英國)；兔抗小鼠NF-κB p52多克隆抗體(Invitrogen公司，美國)；兔抗小鼠TNF-α多克隆抗體(Abcam公司，英國)；兔抗小鼠IL-1β多克隆抗體(Abcam公司，英國)；小鼠IL-1β ELISA檢測試劑盒(南京碧云天公司)；小鼠TNF-α ELISA檢測試劑盒(南京碧云天公司)；兔抗小鼠CCR16多克隆抗體(Invitrogen公司，美國)；兔抗小鼠TLR4多克隆抗體(Invitrogen公司，美國)。Ⅲ型顯微外科手術(shù)器械(寧波醫(yī)用縫針有限公司)；小鼠固定架(北京吉安得爾科技有限公司)； US/S5TB230型小動物手術(shù)臺(北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司)； Misonix Sonicator 4000型超聲波破碎儀(Misonix 公司，美國)； DDB-300型多通道電子蠕動泵(浙江象山石浦海天電子儀器廠)；Waters 2695型高效液相色譜系統(tǒng)(Waters公司，美國)； Centrifuge 5810R型低溫高速離心機(jī)(Eppendorf公司，德國)；全自動電泳系統(tǒng)(Bio-Rad公司，美國)； 18-ODS型色譜柱(Dima公司，美國)；金盤多媒體圖像處理系統(tǒng)(成都金盤電子科大多媒體技術(shù)有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物分組

將30只8周齡小鼠隨機(jī)分為3組，急性肺炎模型組(6 h)、急性肺炎模型組(12 h)和正常組，每組10只小鼠。

實驗小鼠在實施實驗前一夜進(jìn)行饑餓處理，但水量供應(yīng)。按照8 mg/kg濃度的脂多糖，以質(zhì)量添加標(biāo)準(zhǔn)，將10 mL的脂多糖溶液(lipopolysaccharides,LPS)經(jīng)過氣管滴加到小鼠的肺部用以構(gòu)建急性肺炎模型。采取小鼠股動脈血液實施血氣分析，以動脈血氣低于90%為LPS急性肺炎小鼠模型制作成功的標(biāo)準(zhǔn)。該實驗研究經(jīng)由實驗動物使用與管理委員會批準(zhǔn)的IACUC號為2017-0017。本研究實驗過程中按實驗動物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷實施具體措施。

1.3.2 樣本采集

在構(gòu)建急性肺炎模型6 h和12 h以后，將BALB/c小鼠麻醉處死并解剖，觀察肺部損傷情況。其中左側(cè)肺葉用肺泡灌洗，檢測TNF-α和IL-1β含量；右肺葉用以檢測蛋白及microRNA-1247含量。

1.3.3 血氣分析及肺葉組織干濕重檢測

小鼠在氣管滴加脂多糖(LPS)構(gòu)建急性肺炎模型6 h和12 h以后，解剖抽出腹腔中主動脈血進(jìn)行血氣分析。

1.3.4 qRT-PCR檢測肺葉中的microRNA-1247轉(zhuǎn)錄水平

取200 μL右側(cè)肺葉組織勻漿樣本，應(yīng)用qRT-PCR檢測右側(cè)肺葉中的microRNA-1247表達(dá)情況。PCR引物序列見表1。

1.3.5 ELISA法檢測TNF-α和IL-1β蛋白含量

應(yīng)用小鼠IL-1β及TNF-α的ELISA檢測試劑盒，將標(biāo)準(zhǔn)品用稀釋液按照要求以一定比例稀釋，然后嚴(yán)格按照說明書要求操作。將所得到的數(shù)據(jù)以Excel繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，最終將結(jié)果代入標(biāo)曲，計算出樣品TNF-α和IL-1β含量數(shù)值，之后再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)，計算含量。TNF-α與IL-1β的含量根據(jù)ELISA方法，蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線見表2，小鼠的TNF-α蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=173x2+30x+79.8，R2=0.9927；IL-1β的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=16x2+197x+13，R2=0.9989。由標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)可知，實驗數(shù)據(jù)線性良好，且R2均超過0.99，說明數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，曲線可用。注：最低檢測濃度為10 pg/mL。見表2。

1.3.6 Western blot法檢測CCR16和TLR4受體蛋白表達(dá)情況

①膜封閉：把NC膜放入到平皿中，同時向容器中添加濃度為5%的脫脂奶粉，溶液以完全蓋住膜為宜，置于水平搖床暗處封閉0.5～1.5 h。②洗膜：在除去脫脂奶粉溶液以后，取出NC膜置于TBST中洗滌3次，每次洗滌5～10 min。③加入一抗(CCR16和TLR4受體蛋白的一抗)：將一抗用0.6% TBST稀釋，將NC膜剪至合適的大小，使蛋白面朝上放在含有抗體的小盒中，期間不斷的輕輕的晃動孵育盒，抗體與膜充分接觸，在4℃下孵育一夜。④洗膜：取出NC膜，并放置于FBS溶液中洗滌3次，每次大概20 min。⑤加入二抗：二抗使用0.6% 的PBS稀釋500倍以后，室溫孵育1 h以上。⑥洗膜：取出NC膜，將膜放于TBST溶液中洗滌4次，每次20 min。⑦膜顯色，室溫晾干，拍照保存。

表1 qRT-PCR引物序列

表2 TNF-α與IL-1β蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)(n=10)

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠血氣分析及肺葉組織干濕重比較

BALB/c小鼠模型組的PaO2以及氧和指數(shù)(PaO2/ FiO2)與正常組相比都有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且由模型組(6 h,12 h)的小鼠氧和指數(shù)不難看出模型組符合臨床ALI的診斷標(biāo)準(zhǔn)，也證明建模成功。模型組的PaCO2值和正常相比無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。模型組小鼠的肺組織干濕重(6 h、12 h)與正常組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表3)。

2.2 各組小鼠的血漿炎癥因子表達(dá)水平變化

本實驗測定了TNF-α與 IL-1β的表達(dá)量。與正常對照組balb/c小鼠進(jìn)行比較，模型組(6 h、12 h)的炎癥因子TNF-α、IL-1β 的表達(dá)水平與正常組相比無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。而腫瘤壞死因子TNF-α的表達(dá)量在造模后6 h和12 h以后略有升高，但是變化不明顯。IL-1β的表達(dá)量在造模后6 h和12 h以后也略有升高，但是變化也不明顯，此變化趨勢與TNF-α變化趨勢相似(表4)。

2.3 模型組小鼠肺組織中microRNA-1247含量與正常組的倍數(shù)關(guān)系

與正常組小鼠進(jìn)行比較，模型組在造模后6 h和12 h組織中的microRNA-1247的含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且模型組12 h倍數(shù)要高于6 h，說明隨著造模時間的延長，microRNA-1247的生成量越來越高(表5)。

2.4 各組小鼠CCR16和TLR4受體蛋白表達(dá)情況

WB結(jié)果顯示，CC趨化因子配體16(CCR16)與正常組進(jìn)行比較，模型組在造模后6 h和12 h組織中的CCR16 蛋白表達(dá)量有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且模型組12 h含量要高于6 h，其表達(dá)量的變化和microRNA-1247變化呈現(xiàn)一定正相關(guān)。而細(xì)胞表面受體蛋白TLR4與正常組進(jìn)行比較，模型組在造模后6 h和12 h組織中的TLR4 蛋白表達(dá)量有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且模型組12 h含量要低于6 h組和正常組，其表達(dá)量的變化和microRNA-1247變化呈現(xiàn)一定負(fù)相關(guān)(表6及圖1)。

2.5 各組小鼠IRAK6和TAK蛋白表達(dá)量比較

模型組的IRAK6和TAK蛋白表達(dá)量與正常組相比較，模型組在造模后6 h和12 h后組織中IRAK6和TAK蛋白表達(dá)量有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且模型組12 h灰度值要低于6 h(表7及圖2)。

表3 各組小鼠血氣值及肺組織干濕重結(jié)果(n=10)

注：與對照組比較，*P<0.05。

Note. Compared with the control group,*P<0.05.

表4 各組小鼠血漿中炎癥因子含量對比結(jié)果(n=10)

注：與對照組比較，*P<0.05。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05.

表5 不同誘導(dǎo)時間肺組織中microRNA-1247倍數(shù)(n=10)

注：與對照組比較，*P<0.05。

Note. Compared with the control group,*P<0.05.

表6 各組小鼠腎小管自噬體膜標(biāo)志蛋白表達(dá)量比較(n=10)Table 6 Comparison of expression of autophagic membrane markers in renal tubules of the mice in each group

注：與對照組比較，*P<0.05。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05.

圖1 Western blot檢測CCR16和TLR4受體蛋白表達(dá)情況Figure 1 Expression of CCR16 and TLR4 receptor proteins detected by Western blot

表7 各組小鼠IRAK6和TAK蛋白表達(dá)量比較(n=10)

注：與對照組比較，*P<0.05。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05.

圖2 Western blot檢測IRAK6和TAK蛋白表達(dá)情況Figure 2 Expressions of IRAK6 and TAK proteins detected by Western blot

2.6 各組小鼠IKK蛋白表達(dá)量比較

模型組的IKK蛋白表達(dá)量與正常組相比較，模型組在造模后6 h和12 h后組織中IKK蛋白表達(dá)量有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，模型組12 h灰度值低于6 h(表8及圖3)。

表8 各組小鼠IKK蛋白表達(dá)量比較(n=10)

注：與對照組比較，*P<0.05。

Note. Compared with the control group,*P<0.05.

圖3 Western blot檢測IKK蛋白表達(dá)情況Figure 3 Expression of IKK protein detected by Western blot

2.7 各組小鼠NF-κB p52蛋白表達(dá)量比較

WB檢測結(jié)果顯示，與正常組進(jìn)行比較，模型組在造模后6 h和12 h組織中的細(xì)胞炎癥重要的轉(zhuǎn)位入核蛋白NF-κB p52表達(dá)量有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且模型組12 h灰度值低于6 h低于正常組，其表達(dá)量的變化和microRNA-1247變化呈現(xiàn)一定負(fù)相關(guān)(表9及圖4)。

表9 各組小鼠NF-κB蛋白表達(dá)量比較(n=10)

注：與對照組比較，*P<0.05。

Note. Compared with the control group,*P<0.05.

圖4 Western blot檢測小鼠轉(zhuǎn)位入核蛋白NF-κB p52表達(dá)情況Figure 4 NF-κB p52 translocation detected by Western blot

3 討論

肺組織是身體最大的臟器，且有很多毛細(xì)血管。它的結(jié)構(gòu)和生理功能的特殊性，決定了其容易受損的特性?，F(xiàn)已證實，TLRs識別受體在哺乳動物中廣泛存在，它在調(diào)節(jié)人體免疫進(jìn)程中非常的重要。目前己經(jīng)發(fā)現(xiàn)10幾種TLRs受體，他們在固有免疫中承擔(dān)的作用不同，是刺激物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到下游十分重要的受體蛋白。TLR4在革蘭陰性細(xì)菌感染中承擔(dān)重要作用。革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁成分脂多糖在釋放以后，會與細(xì)胞膜表面的受體CD14形成復(fù)合物，并活化TLR4受體，進(jìn)一步活化下游蛋白，促進(jìn)其下游蛋白的表達(dá)，最終降解I-kB將NF-κB釋放，使NF-κB發(fā)生轉(zhuǎn)位入核，啟動炎癥基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，由此引發(fā)炎癥反應(yīng)[16]。

在Dang等[17]的研究中顯示小鼠在通過氣管向肺部滴加LPS誘導(dǎo)的模型中檢測到了miR-146a基因的上調(diào)。但是，小鼠通過霧化吸入LPS構(gòu)建模型后，卻沒有檢測到miR-146a基因的上調(diào)表達(dá)[18]。出現(xiàn)這一結(jié)果的原因可能是miR-146a的表達(dá)有種屬之間特異性，因此本實驗所證實的LPS誘導(dǎo)的急性肺炎模型中microRNA-1247基因的上調(diào)表達(dá)，在不同的種屬小鼠, 小鼠或者不同LPS誘導(dǎo)方式的模型之間都可能有不同的表達(dá)。

許多文獻(xiàn)表明LPS誘導(dǎo)的炎癥模型導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)會呈現(xiàn)瀑布式發(fā)生，這就增加了小鼠在炎癥發(fā)生過程中的致死率。本文研究結(jié)果表明LPS由氣管滴入到肺部誘導(dǎo)的模型組小鼠的PaO2以及氧和指數(shù)(PaO2/ FiO2)和肺葉組織干濕重與正常組相比差異顯著。而炎癥因子TNF-α、IL-1β 的mRNA表達(dá)水平差異卻并不明顯。后續(xù)實驗結(jié)果顯示模型組在造模后6 h和12 h以后組織中的microRNA-1247表達(dá)量較正常組升高的十分明顯。這與以往的文獻(xiàn)相比，小RNA含量升高的更明顯，且下游蛋白的研究也更為透徹。為了探索小RNA的升高的是否與炎癥因子的低表達(dá)有關(guān)，應(yīng)用后續(xù)的WB實驗驗證。WB結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組在造模6 h和12 h后肺葉組織中的CCR16 蛋白表達(dá)量差異顯著，且隨著造模時間的延長逐漸升高。其表達(dá)量的升高與MICRNA-1247的含量成正相關(guān)。而細(xì)胞表面受體蛋白TLR4表達(dá)量與正常組相比，兩組模型組的TLR4表達(dá)量明顯降低，與MICRNA-1247的表達(dá)量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。IRAK6、TAK、IKK蛋白與正常組相比較，蛋白表達(dá)量在造模后顯著降低。轉(zhuǎn)位入核蛋白NF-κB與正常組相比較，在造模后6 h和12 h后肺葉組織中NF-κB蛋白表達(dá)量也相應(yīng)降低，與MICRNA-1247的表達(dá)量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。而TLR4正是NF-κB通路的受體蛋白，而IRAK6、TAK和IKK是NF-κB蛋白的上游蛋白，它們的減少直接決定NF-κB的活化與轉(zhuǎn)位入核，從而影響炎癥因子的表達(dá)。由此得出炎癥因子的降低與microRNA-1247的表達(dá)升高有關(guān)，通過microRNA-1247的高表達(dá)，抑制TLR4和NF-κB因LPS而引起的高表達(dá)，進(jìn)而減少炎癥因子的分泌，防止由于炎癥因子的過量釋放造成的機(jī)體損傷。且CC趨化因子配體16的明顯升高也可以得出microRNA-1247抑制LPS誘導(dǎo)的急性肺炎的機(jī)制是通過CCR16抑制肺泡巨噬細(xì)胞的TLR4信號通路的活化，通過減少TLR4 受體的表達(dá)，級聯(lián)反應(yīng)的影響下游蛋白IRAK6、TAK和IKK的含量表達(dá)，從而影響NF-κB轉(zhuǎn)位入核從而減少肺部炎癥因子的釋放，進(jìn)而減輕炎癥反應(yīng)。本研究選擇檢測NF-κB p52來反應(yīng)其核轉(zhuǎn)位的原因是，與正常組進(jìn)行比較，模型組在造模后6 h和12 h組織中的細(xì)胞炎癥重要的轉(zhuǎn)位入核蛋白NF-κB p52表達(dá)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義，因其表達(dá)量的變化和microRNA-1247變化呈現(xiàn)一定負(fù)相關(guān)，故推測microRNA-1247抑制了NF-κB p52蛋白的表達(dá)量，從而減少炎癥因子的表達(dá)。

綜上所述，在急性肺炎模型中，microRNA-1247是通過趨化因子配體CCR16抑制因LPS誘導(dǎo)的急性肺炎而導(dǎo)致的各種細(xì)胞因子及蛋白表達(dá)量的升高。