王莎莎，朱輝斌，盧晟盛*，潘登科

(1. 廣西大學動物科學技術學院，亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，南寧 530004； 2. 成都中科奧格生物科技有限公司，成都 610041； 3. 四川省醫(yī)學科學院/四川省人民醫(yī)院 器官移植研究所，成都 610072)

遺傳性酪氨酸血癥Ⅰ型(Hereditary tyrosinemia typeⅠ, HTⅠ)是由于延胡索酸乙酰乙酸水解酶(fumarylacetoacetate hydrolase, FAH) 缺乏而引起的代謝性疾病。1992年，Kvittingen等[1]發(fā)現(xiàn)不同臨床表型的FAH表達量不同，之后Bergman等[2]發(fā)現(xiàn)FAH基因突變是造成此疾病的主要原因。酪氨酸代謝障礙是由FAH減少或缺失所引起，致使琥珀酰丙酮等有害產(chǎn)物大量積聚對肝和腎造成損害[3-6]。緩解HTⅠ 癥狀最有效的方法是2-(2-硝基-4-三氟甲基苯甲?；?-1,3-環(huán)己二酮(2-nitro-4-trifluoroⅠmethylbenzoyl-1,3-cyclohexanedione, NTBC)配合低酪氨酸飲食[7]，但是NTBC對機體存在副作用，并且需要通過持續(xù)用藥來維持治療效果[8-10]，目前能夠治愈HTⅠ 的唯一方法是肝移植。作為治療致命性肝病最為有效的方法[11]，肝移植的供體通常來源于活體捐贈或者瀕死病人，但其數(shù)量有限且不能滿足病患需求[12-13]。1993年通過對小鼠FAH基因進行編輯建立了HTⅠ小鼠模型[14]，隨后大鼠和兔子模型[15-16]也被陸續(xù)建立，2017年美國研究人員成功利用FAH單基因敲除大白豬，通過自然繁育獲得表型明顯的純合基因敲除個體[17]，這些動物模型的創(chuàng)建為FAH基因突變引起的疾病機理、表型及治療等開展深入的研究提供了基礎。

FAH基因的敲除可對機體產(chǎn)生持續(xù)且不可逆的肝損傷，阻礙肝細胞的增殖，誘發(fā)自身肝細胞凋亡，提供了適宜外源性干細胞再生的“空位”，可利用人類干細胞進行增值修復。隨著異種嵌合研究的不斷深入使得制備人源化肝得以實現(xiàn)，為異種嵌合和異種移植研究提供可行性材料。因此制備FAH基因敲除巴馬小型豬，為尋求利用基因缺陷豬制備人源化肝進行替代治療策略提供了一條新思路。本研究利用CRISPR/Cas9技術敲除巴馬小型豬FAH基因，并對其生理狀況和繁育能力進行評估，獲得了健康的單等位基因敲除豬，為后續(xù)通過自然繁育得到雙等位基因敲除巴馬小型豬與制備人源化肝奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

普通級野生型巴馬小型豬雌性4頭(6～8月齡，體重16～20 kg)、雄性4頭(6～8月齡，體重16～20 kg)、受體母豬8頭(6～8月齡，體重150～200 kg)，均飼養(yǎng)于四川省邛崍養(yǎng)殖場[SCXK(川)2019-032][SYXK(川)2019-221]。實驗動物飼養(yǎng)和實驗過程中按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷，本研究的福利倫理審批號為2018002。

1.1.2 細胞系

GGTA1基因敲除(α-1, 3-galactosyltransferase knockout, GTKO)巴馬小型豬耳成纖維細胞系保存于本實驗室。

1.1.3 質粒

pX330質粒由中國農(nóng)業(yè)大學胡溢清博士惠贈；pCMV-C-EGFP質粒購自碧云天生物技術有限公司(上海)。

1.2 主要試劑與儀器

Premix LA Taq DNA聚合酶(Takara Biotechnology, 大連)； DNA提取試劑盒、凝膠回收試劑盒(Zymo Research, USA)；限制性內(nèi)切酶BbsⅠ(New England Biolabs, USA)；總RNA提取試劑盒(TIANGEN，北京)；電轉染試劑盒(Lonza, Germany)；DMEM-High Glucose (Gibco, USA；細胞培養(yǎng)相關耗材(Corning, USA)；胚胎培養(yǎng)相關耗材(Thermo Scientific, USA)；兔源FAH一抗(Sigma-Aldrich, USA)；羊抗兔二抗-HRP(艾博抗貿(mào)易有限公司，上海)；其他化學試劑參照已發(fā)表文章[18-19]。電泳槽(六一儀器廠，北京)； 流式細胞儀(Becton Dickinson FACScan，法國)； CO2培養(yǎng)箱(Nuaire，美國)；卵母細胞融合儀(CF150/B，BLS，匈牙利)；顯微操作系統(tǒng)(TransferManNK2，Eppendorf，德國)一次性細胞培養(yǎng)皿(35 mm、60 mm，Griner，德國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 打靶載體構建

根據(jù)查找所得豬FAH基因序列信息(Gene ID:100623036)，運用Optimized CRISPR Design (http://crispr.mit.edu/)在其第二外顯子(Exon2)構建6個靶向sgRNA。將合成的sgRNA二聚化后與通過BbsⅠ 酶切回收的pX330表達載體連接，連接后送測序，測序結果適宜的質粒進行轉化、擴繁、提取，-20℃保存。

1.3.2 轉染

巴馬小型豬耳成纖維細胞，用含有20%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的杜氏改良培養(yǎng)基 (Dulbecco’s modified Eagle medium, DMEM) 培養(yǎng)，至細胞生長匯合度到80%及以上時，用0.1%胰蛋白酶消化并收集1×106細胞，取4 μg pX330質粒與1 μg綠色熒光蛋白(pCMV-C-EGFP)質粒加入電轉液重懸細胞，Lonza核轉染儀進行電轉染，將轉染后的細胞移入60 mm細胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)。

1.3.3 sgRNA敲除效率檢測

在sgRNA靶點兩側設計引物(表 1)，轉染72 h后對混合細胞提取DNA，稀釋至50 ng/μL，-20℃保存，擴增目的片段，PCR反應體系如表2，PCR反應條件為：95℃ 5 min； (95℃ 30 s, 62℃ 30 s, 72℃ 25 s)× 32個循環(huán)；72℃ 8 min；16℃ ∞，產(chǎn)物跑膠純化回收目的片段，TA克隆，涂于含AMP+的LB固體瓊脂糖平板，挑取40個菌落測序，計算sgRNA敲除效率，挑選敲除效率最高的sgRNA靶點質粒進行后續(xù)實驗。

表1 寡核苷酸序列

表2 PCR擴增反應體系

1.3.4 單細胞克隆的獲得及鑒定

pX330質粒與pCMV-C-EGFP質粒如1.3.2共轉染GGTA1基因敲除巴馬小型豬耳成纖維細胞，48 h后通過流式細胞儀富集帶綠色熒光的細胞，將富集的細胞有限稀釋接種到10 cm細胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，每隔48 h更換一次培養(yǎng)基，直至單細胞克隆出現(xiàn)。顯微鏡下挑選狀態(tài)良好的單細胞克隆，經(jīng)DPBS洗滌后用胰蛋白酶消化后移入48孔細胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)，待生長匯合至80% 以上，取部分細胞進行FAH基因突變類型鑒定，鑒定引物信息及PCR擴增反應體系見1.3.3，挑選陽性且狀態(tài)良好的單細胞克隆用于體細胞核移植。

1.3.5FAH基因敲除克隆豬的制備及鑒定

1.3.4中所得FAH陽性單細胞克隆作為核供體，胞質受體選擇去核的體外成熟卵母細胞。盲吸法去除卵母細胞的細胞核與第一極體，用電融合法激活重構胚[20]。分別將雙等位基因敲除細胞克隆(FAH-/-)胚胎與單等位基因敲除細胞克隆(FAH+/-)胚胎，移植到受體母豬中，胚胎移植方法及培養(yǎng)條件參照潘登科等[21]。其中FAH-/-胚胎移植組2頭受體母豬為了緩解HTⅠ 的臨床癥狀，移植后每天每頭飼喂50～100 mg NTBC，第28天B超檢測受體豬的妊娠情況，之后每月進行一次B超檢測，妊娠至117 d左右產(chǎn)仔。待仔豬出生后，采集耳組織樣本并提取基因組DNA，經(jīng) PCR擴增目的片段、TA克隆及測序來確定仔豬FAH基因突變類型，鑒定引物信息及PCR擴增反應體系見1.3.3。

1.3.6 仔豬血常規(guī)及血生化檢測

5月齡FAH+/-仔豬5頭、同月齡野生型仔豬4頭，禁食16 h采血，抽血當日在其清醒狀態(tài)下從前腔靜脈采集血液7 mL，取2 mL 注入抗凝采血管中，輕輕搖動混合均勻避免凝血，進行血常規(guī)檢測；剩余5 mL注入促凝管中，3000 r/min離心10 min，取血清進行血生化檢測。

1.3.7 組織學切片觀察

采集FAH+/-豬及野生型對照豬的同月齡的肝組織約1 cm3的塊狀體，將其完全浸泡于4%的多聚甲醛中固定，之后將其進行脫水、石蠟包埋、冷凍放置、切片及脫蠟。制備好的石蠟切片進行蘇木精-伊紅染色處理，染色后清洗并用中性樹膠固定，顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.3.8 Western blot檢測

分別取一頭5月齡FAH+/-仔豬與野生仔豬肝和腎組織樣本研磨成細粉狀，加入 800 μL RIPA裂解液，冰上裂解30 min，收集裂解液，4℃ 12 000 r/min離心10 min，收集上清液，BCA法測定蛋白濃度，添加上樣緩沖液，100℃水浴 8 min 變性蛋白。取 12% SDS-PAGE 分離蛋白，轉PVDF膜，封閉，選用GAPDH 作為內(nèi)參，一抗4℃過夜孵育，二抗37℃孵育2 h，ECL 發(fā)光法顯色曝光。

1.3.9FAH+/-豬繁育能力及統(tǒng)計學分析

F0代FAH+/-公豬在生長到6月齡時性成熟，用野生型母豬與其配種，記錄下母豬的妊娠數(shù)、每窩產(chǎn)仔豬數(shù)以及存活的仔豬數(shù)，與相同月齡的相同時期相同品種的初產(chǎn)野生母豬繁育狀況進行比對。待F1代FAH+/-豬性成熟后，用FAH+/-公豬與FAH+/-母豬交配，記錄F1代母豬妊娠數(shù)及窩產(chǎn)仔豬數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 打靶載體構建及效率檢測

在巴馬小型豬FAH基因的Exon2上設計構建了6個不同的sgRNA打靶載體，與pX330質粒連接構建表達載體并進行效率驗證(FAH-g1～FAH-g6)。其中FAH-g2的突變效率為28%(11/40)(圖1)，為有效載體。

2.2 單細胞克隆突變類型的鑒定

轉染后，流式富集帶熒光細胞，取部分細胞經(jīng)DNA測序，F(xiàn)AH基因突變效率為81.8%。鑒定22個單細胞克隆，獲得FAH-/-單細胞克隆16個，其中純合型13個、雜合型3個；FAH+/-單細胞克隆2個、野生型4個(表3)。

2.3 FAH基因敲除豬的制備與鑒定

狀態(tài)良好的FAH-/-與FAH+/單克隆細胞被用于體細胞核移植。FAH-/-重構胚胎1191枚，F(xiàn)AH+/重構胚胎346枚，共1537枚移植6頭受體母豬。2頭受體母豬移植FAH+/-重構胚胎，1頭妊娠至終期，5頭仔豬出生(表4，圖2)，PCR測序鑒定5頭仔豬均為同一類型(+1 bp)的FAH單等位基因敲除豬(圖3)；FAH-/-重構胚胎移植組，4頭受體母豬(表4)，飼喂NTBC組中一頭妊娠至終期，出生4頭豬仔，1頭于出生后4天死亡，2頭出生后5天死亡，1頭出生后6天死亡，經(jīng)PCR測序鑒定4頭均為FAH雙等位基因敲除豬。

注：下劃線：sgRNA 識別靶序列；粉色字母：原間隔序列臨近基序(PAM)；E1～E14：外顯子1～外顯子14。圖1 FAH基因sgRNA靶位點Note. Underlined text: sgRNA recognizes a target sequence. Pink letter: protospacer adjacent motif (PAM). E1-E14: exon 1-exon 14.Figure 1 Target site of the FAH gene sgRNA

表3 單細胞克隆敲除類型

表4 FAH基因突變細胞體細胞核移植結果

注：+：妊娠；-：未妊娠；/：無。

Note. +: Pregnancy; -: Not pregnancy; /: Not detected.

圖2 FAH單等位基因敲除仔豬Figure 2 FAH single allele knockout piglets

圖3 FAH單等位基因敲除仔豬測序結果Figure 3 Sequencing results of the FAH single allele knockout piglets

2.4 仔豬血液檢測

血常規(guī)檢測顯示，F(xiàn)AH+/-豬與野生型豬在淋巴細胞數(shù)檢測結果上存在顯著差異(P<0.05，表5)，但FAH+/-豬與野生型豬的檢測數(shù)值均在參考文獻的正常數(shù)值范圍內(nèi)[22]，表明FAH單等位基因敲除豬的生理健康正常(表5)。血液生化指標檢測顯示，F(xiàn)AH+/-豬與野生型豬的尿素氮含量差異極顯著(P<0.01，表6)。HTⅠ 病人血液中的酪氨酸、苯丙氨酸等氨基酸的含量較正常對照組增高，因此對FAH+/-巴馬小型豬和野生型巴馬小型豬進行血液氨基酸檢測(表6)，檢測結果顯示FAH+/-組與野生對照組在酪氨酸、苯丙氨酸等氨基酸的變化上無顯著差異(P>0.05)。

表5 FAH+/-仔豬血常規(guī)檢測

注：與野生型相比，*P<0.05，**P<0.01。表6同。

Note. Compared with the wild type,*P< 0.05,**P< 0.01. The same in the figure 6.

表6 FAH+/-仔豬血生化指標檢測

注：A：WT豬的肝組織；B：FAH+/-豬的肝組織。圖4 肝組織學形態(tài)變化(HE染色，× 400)Note. A: Liver tissue of WT pig. B: Liver tissue of FAH+/- pig.Figure 4 Histology of the liver tissues. HE staining

2.5 組織學切片觀察

對所制得FAH+/-巴馬小型豬及野生型豬肝的組織學切片進行HE染色后發(fā)現(xiàn)(圖4)：細胞核都被染成深藍色，其余組織部分被染成深淺各不相同的粉色，對比觀察，右側圖片即FAH+/-肝HE染色發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)較明顯的空泡樣變化，說明FAH基因單等位敲除會影響機體肝發(fā)育并出現(xiàn)較明顯的病變但并不會影響機體的正常的生長狀況。

2.6 Western blot檢測

結果顯示：在樣品上樣量相同的情況下，F(xiàn)AH+/-巴馬小型豬肝和腎中FAH的表達量與野生型巴馬小型豬相比均顯著降低；經(jīng)Image J 1.8.0對灰度值進行分析可得：FAH+/-巴馬小型豬肝和腎中FAH的表達量與野生型巴馬小型豬相比，差異極顯著(P<0.01)，表明FAH單等位基因敲除影響了FAH蛋白的表達(圖5)。

2.7 FAH+/-豬繁育能力分析

F0代FAH+/-豬配種后產(chǎn)下3窩仔豬，經(jīng)統(tǒng)計每窩平均產(chǎn)仔數(shù)為(9.00±1.41)頭，每窩平均仔豬存活數(shù)為(8.33±0.94)頭(表7)。斷奶時，所有仔豬均健康存活，其中9頭為FAH+/-豬，其余為野生型豬。待F1代FAH+/-豬性成熟后，根據(jù)存活及健康狀況，用F0代FAH+/-公豬與F1代FAH+/-母豬交配，產(chǎn)下一窩仔豬，由于產(chǎn)房溫度較低，產(chǎn)下的10頭仔豬只存活1頭，經(jīng)測序鑒定F2代仔豬中FAH單等位基因敲除6頭，雙等位基因敲除3頭，野生型2頭，存活仔豬編號為FAH-162，基因型鑒定結果為FAH單等位基因敲除(圖6)。

注：WT：野生型；GAPDH：內(nèi)參；與野生型相比，*P<0.05，**P<0.01。圖5 Western blot檢測FAH蛋白表達量Note. WT means wild type. GAPDH serves as an internal control. Compared with the wild type,*P< 0.05,**P< 0.01.Figure 5 FAH protein expression levels detected by Western blot

表7 F0代FAH+/-豬窩產(chǎn)仔數(shù)及存活數(shù)

圖6 FAH-162 FAH基因敲除仔豬測序結果Figure 6 Sequencing results of the FAH-162FAH knockout piglets

3 討論

本研究利用CRISPR/Cas9技術對GGTA1基因敲除巴馬小型豬[23]的體細胞進行編輯，創(chuàng)建了FAH單等位基因敲除小型豬，利用FAH+/-豬通過自然繁育將得到FAH-/-豬，此基因敲除豬會出現(xiàn)肝損傷，形成肝“空位”，有利于人類干細胞的再生[24]，由于利用豬制備人源化肝會攜帶部分豬自體細胞，造成超急性免疫排斥反應(hyperacute rejection, HAR)，而敲除豬的GGTA1基因能解決HAR[25-29]，因此在該基因敲除小型豬體細胞進行基因編輯，將有利于對人源化肝及異種移植的深入研究[28]，為相關異種嵌合和異種移植提供了可行性分析。

多年來大家一直對基因敲除動物的健康狀況密切關注，眾多的研究表明克隆對動物自體的影響微乎其微[27,31-33]。本研究對比分析了基因敲除巴馬小型豬與野生型間血常規(guī)與血生化檢測結果，F(xiàn)AH基因敲除后實驗組豬尿素氮的水平明顯下降，可能是由于FAH基因突變會造成HTⅠ，模型豬中該基因的缺失導致FAH的表達量有所下降，從而潛在影響了蛋白代謝和腎功能；HE染色觀察到FAH基因單等位基因敲除會對機體肝細胞及組織形態(tài)造成一定影響，但不會對其健康狀況造成危害。FAH+/-豬與野生型豬的淋巴細胞數(shù)存在顯著差異(P<0.05)，但FAH+/-豬與野生型豬的檢測數(shù)值均在參考文獻的正常數(shù)值范圍內(nèi)，表明獲得的FAH基因敲除豬健康狀況良好，可正常進行養(yǎng)殖，為后續(xù)的實驗創(chuàng)造良好的實驗基礎。

巴馬小型豬初產(chǎn)約8.5頭每窩，經(jīng)產(chǎn)約10頭每窩[22]。利用FAH+/-巴馬公豬與同種野生型母豬交配，窩產(chǎn)仔平均數(shù)為(9.0±1.41)頭。從以上數(shù)據(jù)來看，本研究得到的FAH+/-豬的繁殖能力正常，并且利用FAH+/-巴馬公豬與FAH+/-巴馬母豬配種，通過NTBC糾正FAH-/-胎兒在子宮中的致命發(fā)育缺陷，維持正常發(fā)育，F(xiàn)AH+/-豬已繁育到F2代，表明得到的基因編輯克隆豬的繁殖能力并未受到影響。FAH+/-豬的創(chuàng)建為通過自然繁育制備FAH-/-豬提供了基礎，為進一步利用基因敲除豬與人干細胞制作嵌合人源化肝奠定了良好的實驗材料基礎。

本研究表明，F(xiàn)AH單等位基因敲除不會對個體造成異常的不良健康狀況，但會造成肝和腎中FAH的表達量降低，表明對該基因敲除豬肝和腎微環(huán)境的變化存在著潛在的影響。在FAH+/-豬自然繁育的過程中發(fā)現(xiàn)雙等位基因敲除豬出生后很難存活，可能是由于為防止其發(fā)育缺陷而飼喂的NTBC的副作用致使仔豬存活受阻，此現(xiàn)象為以后FAH-/-的飼喂繁育提供了研究數(shù)據(jù)。本研究得到的FAH+/-豬的繁育能力正常，血生理生化指標也在正常數(shù)據(jù)范圍內(nèi)，F(xiàn)AH+/-小型豬的成功制備，為后續(xù)推動FAH-/-豬的建立和繁育以及利用基因敲除豬通過與人干細胞進行嵌合體制作，制備出人源化肝的研究，提供了優(yōu)良的實驗材料與研究基礎。