劉志昊，穆大業(yè)，占玲俊*，章曉聯(lián)*

(1. 武漢大學基礎(chǔ)醫(yī)學院免疫學系，病毒學國家重點實驗室，湖北省過敏及免疫相關(guān)疾病重點實驗室和醫(yī)學研究院，武漢 430071；2. 中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心，北京 100021)

結(jié)核病已成為全球第九大死因，持續(xù)威脅人類健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization， WHO)報告，2017年全球結(jié)核病新發(fā)病例數(shù)約為 1000 萬例，新增 55.8 萬例利福平耐藥結(jié)核病，其中82%是耐多藥結(jié)核病，給結(jié)核的防治帶來極大的障礙[1]。

早診斷、早治療尤其是有效治療是防治結(jié)核病的關(guān)鍵，因此WHO近年來不斷推動結(jié)核的快速診斷、藥敏實驗(drug susceptibility testing，DST)快速檢測和新藥及短程化療方案的開發(fā)[2]。目前結(jié)核的診斷和藥敏實驗包括以基因檢測為基礎(chǔ)的檢測法和培養(yǎng)法，其中培養(yǎng)法是WHO推薦的金標準法。盡管現(xiàn)在以基因檢測為基礎(chǔ)的檢測方法可在2～24 h內(nèi)獲得診斷和一二線藥物藥敏實驗結(jié)果[3-5]，但基于基因檢測的方法無法判定菌的存活，且對某些重要二線藥物耐藥分子的認知不足，基因檢測法的應(yīng)用有局限，培養(yǎng)法在結(jié)核的診斷與DST與臨床治療方案制定中仍有重要作用[6]。臨床樣本的培養(yǎng)中多項研究均證明BACTEC MGIT 960系統(tǒng)培養(yǎng)和傳統(tǒng)L-J培養(yǎng)法檢測結(jié)果具有高度的可比性和一致性[7-8]，然而BACTEC MGIT 960從操作標準化與檢測時間上均優(yōu)于L-J培養(yǎng)法，故BACTEC MGIT 960培養(yǎng)在臨床上在結(jié)核診斷和一二線藥物藥敏實驗中應(yīng)用逐步增多[9]。

在結(jié)核動物模型的體內(nèi)藥物和疫苗效果評價的最主要的判斷指標之一是檢測組織荷菌量[10-12]，目前采用L-J或7H11培養(yǎng)法進行菌落計數(shù)，通過菌落計數(shù)結(jié)果分析判斷藥物或疫苗在動物模型中是否有效，而BACTEC MGIT 960僅用于體外新藥的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)[13-14]或臨床痰標本的藥敏測定，較少應(yīng)用于結(jié)核感染動物模型中荷菌量檢測。因此，本研究通過BACTEC MGIT 960培養(yǎng)法與L-J培養(yǎng)法檢測結(jié)核模型對照小鼠和利福平(rifampin，RIF)治療后結(jié)核感染小鼠模型中的荷菌量變化，以比較兩種方法在小鼠結(jié)核動物模型中組織荷菌量的精確性和吻合度，以期將BACTEC MGIT 960培養(yǎng)系統(tǒng)用于結(jié)核藥物和疫苗早期效果評價從而快速獲得結(jié)果。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株

結(jié)核分枝桿菌標準株H37Rv(菌株編號93009)由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.1.2 實驗動物

6～8周齡SPF級C57BL/6雌性小鼠36只，體重17～19 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SCXK (京) 2016-0006]。動物的飼養(yǎng)與實驗在中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所生物安全3級實驗室(國衛(wèi)ABSL3-059)進行，在感染前1周，將動物放入生物安全3級實驗室適應(yīng)。實驗動物的使用得到了中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會的批準(批準號：ZLJ17002)，在實驗動物飼養(yǎng)和實驗過程中嚴格按照3R原則設(shè)計、開展動物實驗。

1.2 主要試劑與儀器

分枝桿菌中性羅氏培養(yǎng)管購自中國珠海貝索生物技術(shù)有限公司；細菌超聲分散計數(shù)儀購自中國廣東體必康生物科技有限公司；BACTEC MGIT 960全自動分枝桿菌培養(yǎng)儀及相關(guān)試劑購自BD公司；NanoZoomer S60明場熒光切片掃描儀(日本)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組

實驗分為兩組，MGIT960組和L-J培養(yǎng)組，每種方法均用于檢測結(jié)核小鼠模型和RIF治療后小鼠結(jié)核模型中組織荷菌量，感染的模型對照和RIF治療小鼠各18只。

1.3.2 菌液制備

將種子批結(jié)核分支桿菌標準株H37Rv置于中性羅氏培養(yǎng)培養(yǎng)，收獲培養(yǎng)4周的結(jié)核分枝桿菌，無菌過濾制成單細胞懸液，用細菌超聲分散計數(shù)儀分散均勻后制備攻擊用菌懸液，濃度為1.0×107CFU(colony forming units，菌落形成單位)/mL。

1.3.3 動物感染和取材

每只小鼠尾靜脈注射100 mL H37Rv菌液感染C57BL/6小鼠，菌液濃度為1×107CFU/mL[15]。感染7 d后，將小鼠隨機分為RIF治療組與感染對照組，RIF治療組按每天20 mg/kg治療4周，感染對照組注射等量的PBS。無菌條件下4周后小鼠脫頸椎處死，解剖肺、脾、肝組織進行荷菌量的檢測和病理分析。

1.3.4 靶器官組織荷菌量檢測

取左側(cè)肺組織，脾頭三分之一及肝腹背部的小葉，加入1 mL生理鹽水進行組織研磨勻漿。

(1)L-J培養(yǎng)：將勻漿液用生理鹽水按照1∶10的比例進行梯度稀釋，分別取1∶100、1∶1000、1∶10 000三個稀釋梯度稀釋液50 L，接種于分支桿菌中性羅氏培養(yǎng)管進行培養(yǎng)，每個梯度接種3管，培養(yǎng)3至4周進行菌落計數(shù)[15]。

(2)BACTEC MGIT 960培養(yǎng)：按照BACTEC MGIT 960全自動分支桿菌系統(tǒng)操作指南要求，取1:10稀釋的研磨液0.5 mL接種于BACTEC MGIT 7H9培養(yǎng)管中，加入0.8 mL添加劑，放入BACTEC MGIT 960全自動分枝桿菌培養(yǎng)儀中培養(yǎng)，每日觀察培養(yǎng)結(jié)果，記錄出現(xiàn)陽性結(jié)果的最早時間稱為報陽時間(time to positive，TTP)[16]。

1.3.5 病理學檢測

無菌條件下將剩余肺、脾、肝組織于4%多聚甲醛中固定，經(jīng)脫水、浸蠟、包埋，切成5 μm切片后行HE染色，觀察各組織病變情況。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 BACTEC MGIT 960全自動分枝桿菌培養(yǎng)儀培養(yǎng)結(jié)果

RIF治療組肺、肝及脾組織報陽時間分別為(187.11±10.20) h、(347.22±12.70) h、(276.39±13.09) h，模型對照組肺、肝及脾報陽時間分別為(142.50±11.70) h、(251.67±16.63) h、(230.28±7.22) h(表1)。RIF治療組臟器報陽時間均長于感染對照組，差異有顯著性(P< 0.001)(圖1)，說明RIF治療組小鼠臟器菌量較少即RIF能在小鼠體內(nèi)能抑制結(jié)核分支桿菌。

2.2 分支桿菌中性羅氏培養(yǎng)管培養(yǎng)結(jié)果

RIF治療組肺、肝及脾組織菌落數(shù)分別為(5.15±0.15) log10CFU、(3.30±0.23) log10CFU、(3.40±0.25) log10CFU，模型對照組肺、肝及脾菌落數(shù)分別為(5.90±0.25) log10CFU、(3.88±0.31) log10CFU、(4.15±0.30) log10CFU(表2)。RIF治療組臟器菌落數(shù)均少于感染對照組，差異有顯著性(P< 0.001)(圖2)，說明RIF治療組小鼠臟器菌量較少即RIF能在小鼠體內(nèi)能抑制結(jié)核分支桿菌。

表1 小鼠靶器官組織研磨液BACTEC MGIT 960培養(yǎng)結(jié)果

圖1 960培養(yǎng)系統(tǒng)靶器官荷菌量比較Figure 1 Comparison of bacterial loading counts in the target organs by 960 culture system

表2 小鼠靶器官組織研磨液羅氏培養(yǎng)基結(jié)果Table 2 Results of the culture of mouse target organ tissues by L-J culture

注：A、B、C為對照組肺、脾、肝；D、E、F為RIF治療組肺、脾、肝。圖3 小鼠結(jié)核模型中治療組與感染對照組肺脾肝病理變化圖(HE染色，× 50)Note. A, B, C, Lung, spleen, and liver tissues in the control group. D, E, F, Lung, spleen, and liver in the treatment group.Figure 3 Pathological changes in the lung, spleen, and liver in the treatment group and infection control group in the mouse tuberculosis model. HE staining

圖2 羅氏培養(yǎng)法靶器官荷菌量比較Figure 2 Comparison of bacterial loading counts in target organs by L-J plate culture

2.3 小鼠組織病理變化

小鼠感染結(jié)核菌4周后，肺組織出現(xiàn)多處炎癥反應(yīng)，呈實變趨勢，其中肺泡壁增厚，肺泡腔被淋巴細胞等炎癥細胞填充，RIF治療后肺泡結(jié)構(gòu)多數(shù)較完整，僅有小面積肺泡被炎癥細胞浸潤。模型小鼠的脾白髓被結(jié)核肉芽腫病變破壞，可見炎癥細胞的聚集，RIF治療后白髓結(jié)構(gòu)相對完整，炎癥細胞聚集較少。模型小鼠肝出現(xiàn)多個散在小肉芽腫樣病變，RIF治療后病變較輕，僅出現(xiàn)少量肉芽腫樣病變及輕度肝細胞水腫。病理結(jié)果說明RIF治療組小鼠肺、脾、肝病變均較輕，即RIF在小鼠體內(nèi)能抑制結(jié)核分支桿菌。如圖3所示。

3 討論

在藥效評價和疫苗評價中，通過分析動物模型中組織荷菌量是前期評判藥物治療效果的主要方法，采用羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)法進行菌落培養(yǎng)是常用方法之一[17-18]。然而，L-J培養(yǎng)法由于耗時長，操作繁瑣需要新的替代方法。

BACTEC MGIT 960雖然具有培養(yǎng)時間短、操作標準化、工作量較小的優(yōu)點，用于結(jié)核分支桿菌臨床檢測及藥敏實驗等定性分析，但較少在動物模型中應(yīng)用。在抗結(jié)核新藥AZD5847、PA-824組合療法臨床試驗中，采用BACTEC MGIT 960、固體培養(yǎng)法同時培養(yǎng)受試者痰標本，根據(jù)標本TTP與CFU結(jié)果判斷藥物早期殺菌活性(early bactericidal activity，EBA)，兩種培養(yǎng)方法結(jié)果一致[16,19]。因此，本實驗參考此方法，通過建立小鼠急性結(jié)核感染模型，用兩種方法同時評估結(jié)核模型小鼠及RIF治療的小鼠組織荷菌量，驗證兩種方法在模型應(yīng)用中的一致性，從而探索將MGIT 960運用于結(jié)核小鼠動物模型中結(jié)核藥物和疫苗效果的快速評估。

本實驗結(jié)果顯示，小鼠感染結(jié)核后，雖無明顯的臨床表現(xiàn)，但是組織病變和菌培養(yǎng)結(jié)果證實，結(jié)核感染模型構(gòu)建成功。其中MGIT 960和L-J培養(yǎng)兩種方法均顯示：RIF治療后肺、脾、肝3個靶器官組織培養(yǎng)結(jié)果與模型小鼠培養(yǎng)結(jié)果相比，差異均有顯著性，兩種培養(yǎng)方法結(jié)論一致，并且MGIT 960全自動分枝桿菌培養(yǎng)培養(yǎng)時間125～354 h(即平均239 h)遠低于羅氏培養(yǎng)基法4周(672 h)培養(yǎng)時間，3個靶器官在模型和RIF治療后之數(shù)值差異更大，較傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)法組間差異區(qū)分度高，在藥效或疫苗評價中優(yōu)勢更明顯。

綜上所述，BACTEC MGIT 960培養(yǎng)法可運用于結(jié)核感染動物模型中荷菌量的檢測，且與L-J培養(yǎng)法相比具有培養(yǎng)周期短、區(qū)分度高的優(yōu)勢，有望應(yīng)用于結(jié)核藥物和疫苗效果的快速評估。