李志操，黃 波，向文碧，孫琮杰，吳西軍，周艷華， 何志旭，舒莉萍*

(1. 貴州醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞工程生物醫(yī)藥技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，組織工程與干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中心，臨床醫(yī)學(xué)院兒科學(xué)教研室， 貴州省再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550004；2. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院成體干細(xì)胞轉(zhuǎn)化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550004； 3. 遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院兒科學(xué)教研室，貴州 遵義 563003)

紅細(xì)胞數(shù)量減少是引起貧血的一個主要原因，目前最有效、最直接的治療手段是輸注紅細(xì)胞，但每次輸注的量大且存在血污染、酸中毒和過敏反應(yīng)等風(fēng)險(xiǎn)[1-2]。紅細(xì)胞的生成除了需要造血原料外，調(diào)節(jié)因子的參與也是其中必要一環(huán)，而gata1(globin transcription factor 1)作為一個重要的紅系轉(zhuǎn)錄因子[3]，主要參與紅細(xì)胞的形成、增殖和成熟，對正常造血起著至關(guān)重要的作用，是紅細(xì)胞生成的重要調(diào)控因子且在一定程度上參與造血發(fā)育過程[4-5]。

目前主要利用小鼠進(jìn)行造血發(fā)育的研究，但是發(fā)育慢、成本高、且不便于觀察，使其在研究過程中有一定的局限性。近年來，斑馬魚作為一個出色的探索造血發(fā)育疾病的模式生物越來越受廣大科研工作者的喜愛[6]，利用斑馬魚模型具有體型小、體外受精、繁殖力強(qiáng)、且胚胎發(fā)育早期透明易于觀察和操作、發(fā)育周期短、成本低、與人類基因組高度保守等特點(diǎn)[7-8]，使得斑馬魚在造血發(fā)育研究方面擁有其它實(shí)驗(yàn)動物所不具備的天然優(yōu)勢。

cloche對斑馬魚成體成血管干細(xì)胞的產(chǎn)生和維持有很大的作用[9-10]，cloche-/-突變體斑馬魚的特征體是在血液和內(nèi)皮細(xì)胞的發(fā)育都有缺陷[11]，心臟因?yàn)槿狈?nèi)皮細(xì)胞層而被擴(kuò)大，并呈鐘形[12],故本實(shí)驗(yàn)擬利用對先天性原始造血缺cloche-/-突變體斑馬魚進(jìn)行心包腔內(nèi)直接注射純化的gata1+紅系祖細(xì)胞，為進(jìn)一步研究紅系祖細(xì)胞移植后的功能鑒定提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

1.2 主要試劑與儀器

斑馬魚循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)(中國北京愛生科技發(fā)展有限公司)；體視顯微鏡(日本Nikon公司)；生化培養(yǎng)箱(中國科邁公司)；流式細(xì)胞分析儀(美國Beckman FC500)；顯微注射儀(美國Harvard公司)；拉針儀(日本Narishige公司);瓊脂糖(西班牙Biowest); 2-苯硫脲(美國Sigma公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 收集胚胎及觀察熒光

將雄魚和雌魚按1∶1或2∶1的比例放入交配缸內(nèi)用隔板隔開，次日光照10 min后拔板，0.5 h后收集胚胎并清洗掉雜質(zhì)，加入胚胎培養(yǎng)液放置于28℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每8 h更換一次新的胚胎培養(yǎng)液，用體視熒光顯微鏡觀察各個時(shí)間點(diǎn)的熒光表達(dá)情況。

1.3.2 流式細(xì)胞術(shù)分選gata1+細(xì)胞

取500枚22 hpf的zTg(gata1:EGFP)胚胎，去卵膜后用手術(shù)刀片將尾部血島(posterior blood island，PBI)區(qū)切下置于EP管中，用1× PBS快洗三次，研磨棒攪碎，用PBS液沖入平皿，用胰酶消化30～40 min，消化成單個細(xì)胞懸液，再加1 mL FBS終止消化，離心后去一半上清，將剩余液體用尼龍濾網(wǎng)過濾，細(xì)胞懸液離心，棄上清，加PBS清洗細(xì)胞懸液，離心，棄上清，加PBS重懸沉淀上機(jī)分選。收集gata1+細(xì)胞；以相同的方法處理Tubingen野生型斑馬魚作為對照組。

1.3.3gata1+細(xì)胞移植及移植后細(xì)胞的存活、分布情況觀察

將100枚42 hpf的choche-/-突變體斑馬魚胚胎去卵膜后放置于含0.1 mg/mL三卡因(tricaine)麻醉劑的胚胎培養(yǎng)液中，在顯微鏡下按順序?qū)⑴咛ス潭ㄔ陲@微注射板上，并用撥針撥動胚胎使心臟朝注射針方向上揚(yáng)約45°，有利于注射針的推進(jìn)和抽出并注意保持胚胎濕潤，以約200個/尾的細(xì)胞數(shù)量通過顯微注射入cloche-/-突變體斑馬魚心臟內(nèi)。將注射后的斑馬魚胚胎移入不含麻醉劑的胚胎培養(yǎng)液中并放入生化培養(yǎng)箱中，于移植后0, 2, 4, 16 h觀察斑馬魚體內(nèi)的綠色熒光細(xì)胞存活、分布情況。

2 結(jié)果

2.1 連續(xù)觀察轉(zhuǎn)基因斑馬魚系zTg(gata1:EGFP)的熒光表達(dá)情況

注：A～J：分別為各個不同時(shí)相胚胎的明場和熒光。藍(lán)色箭頭：ICM區(qū)；黃色箭頭：頭部。圖1 轉(zhuǎn)基因斑馬魚系zTg(gata1:EGFP)的熒光表達(dá)情況Note. A-J, the bright field and fluorescence photos of different phase embryos. Blue arrows indicate the ICM region; Yellow arrows indicate the head of zebrafish embryos.Figure 1 Fluorescence expression of transgene zebrafish zTg(gata1:EGFP)

通過圖1可以看到在12 hpf 攜帶綠色熒光蛋白的gata1+細(xì)胞在頭部(黃色箭頭所示)和中間細(xì)胞群(intermediate cell mass, ICM)(藍(lán)色箭頭所示)開始表達(dá)，隨后14～18 hpf在頭部和ICM區(qū)逐漸增多(如圖1ABCD所示)，在22 hpf時(shí)頭部和后部ICM區(qū)的gata1+細(xì)胞達(dá)到高峰(圖1E所示)，隨后在24～48 hpf頭部和ICM區(qū)的細(xì)胞逐漸減少(圖FGHIJ)所示，追蹤觀察結(jié)果如圖1所示。

2.2 gata1+細(xì)胞的流式分選結(jié)果

如上所述，根據(jù)zTg(gata1:EGFP)在斑馬魚中的熒光表達(dá)情況，顯示在22 hpf的時(shí)候gata1+細(xì)胞的表達(dá)是最強(qiáng)的，本課題采用了WT進(jìn)行對照(圖2A、2B所示)，確定R2區(qū)域的細(xì)胞為gata1+細(xì)胞(圖2D所示)，結(jié)果如圖2所示。

2.3 移植gata1 +細(xì)胞到cloche-/-突變體斑馬魚心臟后的效果評估

如圖3所示，觀察到gata1+細(xì)胞在cloche-/-突變體心臟內(nèi)增殖，圖A是一個胚胎注射的示意圖，綠色箭頭指的是注射時(shí)的進(jìn)針角度，藍(lán)色箭頭指的是注射的部位，圖B左邊圖示指的是WT野生型斑馬魚，右圖指的是cloche-/-突變體的斑馬魚，通過右圖的黃色箭頭可以明顯的發(fā)現(xiàn)cloche-/-突變體的心臟是增大的，C、D、E、F分別是移植后通過顯微鏡追蹤觀察移植后紅系祖細(xì)胞在cloche-/-突變體心臟增殖的結(jié)果(紅色箭頭)。

注：A：顯微注射示意圖；B：42 hpf野生型斑馬魚和cloche-/-突變體斑馬魚；C：注射gata1+細(xì)胞0 hcloche-/-突變體斑馬魚(42 hpf)的明場及其熒光表達(dá)情況；D：注射gata1+細(xì)胞2 h后cloche-/-突變體斑馬魚(44 hpf)的明場及其熒光表達(dá)情況；E：注射gata1+細(xì)胞4 h后cloche-/-突變體斑馬魚(46 hpf)的明場及其熒光表達(dá)情況；F：注射gata1+細(xì)胞16 h后cloche-/-突變體斑馬魚(58 hpf)的明場及其熒光表達(dá)情況。藍(lán)色箭頭：顯微注射部位；綠色箭頭：顯微注射角度；黃色箭頭：cloche-/-突變體斑馬魚心包變化情況：紅色箭頭：紅系組細(xì)胞增殖情況。圖3 cloche-/-突變體中g(shù)ata1 +細(xì)胞移植后表達(dá)情況Note. A, Schematic illustration of the microinjection. B, Wild-type zebrafish and cloche-/- mutant zebrafish at 42 hpf. C, Expression of gata1+cells in cloche-/- mutant zebrafish after 0 hour of gata1+cells injection (42 hpf) under bright and fluorescent fields. D, Expression of gata1+cells in cloche-/- mutant zebrafish after 2 hours of gata1+ cells injection (44 hpf) under bright and fluorescent fields. E, Expression of gata1+cells in cloche-/- mutant zebrafish after 4 hours of gata1+ cells injection (46 hpf) under bright and fluorescent fields. F, Expression of gata1+cells in cloche-/- mutant zebrafish after 16 hours of gata1+ cells injection (58 hpf) under bright and fluorescent fields. Blue arrow indicates the site of microinjection; Green arrow indicates the angle of microinjection; Yellow arrows indicate the change in pericardium of cloche-/- mutant zebrafish; Red arrows indicate the proliferation of erythroid progenitor cells.Figure 3 Expression of gata1+cells in cloche-/- mutants after transplantation

3 討論

貧血是臨床上比較常見的一種疾病，由外周血紅細(xì)胞容量低于正常下限所導(dǎo)致，主要表現(xiàn)為頭暈、心跳加快和面色蒼白等癥狀，其病因主要包括紅細(xì)胞生成減少、破壞過多以及大量失血[13-14]。輸血是目前最有效地治療方法之一，但輸血存在諸多不利于患者的并發(fā)癥且輸血治療是個長期過程對紅細(xì)胞的需求量大[15]。因此本課題從此角度出發(fā)，設(shè)想通過移植紅系祖細(xì)胞的方式來促進(jìn)自身紅細(xì)胞的生成以減少外源性紅細(xì)胞的輸注和并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。gata1是具有兩個鋅指結(jié)構(gòu)域的關(guān)鍵紅系轉(zhuǎn)錄因子，通過與多種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合協(xié)同發(fā)揮作用，是紅細(xì)胞發(fā)育過程中的必不可少調(diào)控因子[16-18]，它的缺失可引起嚴(yán)重貧血，胚胎干細(xì)胞也只能發(fā)育至原始紅細(xì)胞階段均不能發(fā)育成熟且發(fā)生凋亡，當(dāng)gata1功能恢復(fù)后貧血情況可以得到改善且造血發(fā)育系統(tǒng)也得以恢復(fù)正常[19-21]。

斑馬魚中與紅系造血相關(guān)的轉(zhuǎn)基因系zTg(gata1:EGFP)斑馬魚系已經(jīng)建立，由gata1驅(qū)動綠色熒光蛋白，表達(dá)于在5體節(jié)期后部側(cè)板中胚層(posterior paraxial mesoderm，PLM)區(qū)，到12體節(jié)期gata1+細(xì)胞向內(nèi)側(cè)遷移，隨后細(xì)胞逐漸增多，形成ICM區(qū)。

近年來，斑馬魚逐漸成為造血發(fā)育研究實(shí)驗(yàn)動物模型中的新寵，在其體內(nèi)的移植研究也成為各研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，如原腎注射，腹側(cè)緣注射，但這些移植方法很難準(zhǔn)確定位且易導(dǎo)致大量出血和胚胎存活率低。研究顯示cloche基因在斑馬魚早期血細(xì)胞的形成和血管內(nèi)皮分化的過程當(dāng)中是很重要的一個調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)發(fā)生cloche-/-突變的時(shí)候，cloche-/-突變體斑馬魚可以表現(xiàn)為先天性原始造血的缺陷，由于內(nèi)皮細(xì)胞的分化受影響所以心臟內(nèi)膜缺損導(dǎo)致心房增大，24 hpf可以看到心臟搏動,但是體內(nèi)未見血液循環(huán)。由于cloche-/-突變體斑馬魚心臟明顯增大且能在無血液循環(huán)的條件下存活，是一個很好的造血移植研究模型。故本實(shí)驗(yàn)將純化后的gata1+細(xì)胞通過顯微注射的方法移植入cloche-/-突變體斑馬魚的心腔中，看是否能重建造血。cloche-/-突變體由于先天性原始造血缺陷，在圖3A中可以看到cloche-/-突變體斑馬魚其體內(nèi)沒有血液循環(huán)，心內(nèi)膜的缺損可以看到心房異常擴(kuò)大。通過移植后20 min使用熒光顯微鏡觀察并間隔拍攝，在心臟處可以看到gata1+細(xì)胞表達(dá)(圖3C所示)，隨后每隔兩小時(shí)觀察一次，圖3D、3E可看到心臟處的gata1+細(xì)胞逐漸增多并且逐漸在心臟內(nèi)循環(huán)(如圖3E所示)，在注射16 h后可能由于細(xì)胞遷移導(dǎo)致解聚以致視野中觀察到綠色熒光減弱(如圖3F所示)，但是仍然可以看到心臟內(nèi)增殖的gata1+細(xì)胞，對紅系祖細(xì)胞移植后功能的進(jìn)一步研究具有重大意義。

在斑馬魚體內(nèi)細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)的建立，由于斑馬魚體外受精、胚體發(fā)育早期透明易于觀察，發(fā)育迅速等特點(diǎn)能夠在顯微鏡下觀察并了解所涉及的生物學(xué)機(jī)制，為細(xì)胞移植后疾病的研究提供可能解決這些問題的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。