吳 寬，田小曼

(楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程分院，陜西楊凌 712100)

棗原產(chǎn)于中國，已有8000余年的栽培歷史。中國的大棗生產(chǎn)居世界領(lǐng)先地位，占世界總產(chǎn)量的99%。

1995年全國棗樹栽植面積達(dá)到66.67萬hm2，鮮棗總產(chǎn)突破7.8億kg。2016年中國的棗樹栽植面積達(dá)到150萬hm2，主產(chǎn)區(qū)在山東、河北、山西、陜西、新疆、河南，占全國產(chǎn)量的90%，陜西盛產(chǎn)大棗，遠(yuǎn)銷國內(nèi)外。然而，隨栽培面積擴(kuò)大，生產(chǎn)上危害最大的棗瘋病快速蔓延。長期以來，因?qū)υ摬『Φ陌l(fā)生規(guī)律、品種抗病性研究較少，對病害缺乏有效的防治措施，全國每年因棗瘋病死樹高達(dá)千萬株，直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)億元，嚴(yán)重阻礙棗樹產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1]。因此，對陜西棗瘋病苗木帶病檢測與品種抗病性調(diào)查研究是棗生產(chǎn)中長期亟待解決的問題。

多年來，國內(nèi)外已在棗瘋病的發(fā)生危害、抗生素治療、病原檢測、以及棗樹組培脫毒等方面開展了一些研究[2]。但是由于棗瘋病植原體(Phytoplasma)嚴(yán)格寄生于植物的韌皮部，不能進(jìn)行人工培養(yǎng)，因而對其病原基因組、致病分子機(jī)理、控制技術(shù)的研究都比較缺乏。到目前為止，除日本、韓國對棗瘋病植原體的16S rDNA基因片段[3-4]有一些文獻(xiàn)報道外，王海妮等[1]對棗瘋病植原體16S rDNA基因序列和tuf基因的序列進(jìn)行報道和分類地位鑒定，吳寬等[5]克隆棗瘋病植原體核糖體蛋白基因(rp)并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。本研究開展陜西棗瘋病苗木帶病檢測與品種抗病性調(diào)查，取得新的研究進(jìn)展?，F(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材 料

2016-2018年對陜西彬縣、佳縣、清澗縣等地的棗瘋病發(fā)生現(xiàn)狀、影響因素進(jìn)行調(diào)查采樣，分別采集棗樹苗枝條165份，收集棗園酸棗枝條114份及棗樹病樹周圍的中華擬菱紋葉蟬(Hishimonoideschinensis)、凹緣菱紋葉蟬(Hishimonussellatus)、大青葉蟬(Cicadellaviridis)、條沙葉蟬(Psammotettixstriatus)等樣品30份。分子檢測所用的pMD18-T simple vector、H.Q.&.Q凝膠回收試劑盒為優(yōu)晶生物工程有限公司產(chǎn)品，Marker為DL-2000購于大連TaKaRa公司。EscherichiacoliJM109 菌株、棗瘋病陽性對照均由西北農(nóng)林科技大學(xué)植保學(xué)院分子病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，分子檢測在該實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 方 法

1.2.1 棗樹苗木與昆蟲樣品總DNA的提取 參照文獻(xiàn)[1,6]，取棗樹和酸棗叢枝組織0.2 g，或昆蟲樣品5～6頭，-80 ℃冰凍后充分研磨，加入0.5 mL DNA提取緩沖液(20 g/L CTAB、1.4 mol/L NaCl、100 mmol/L Tris-HCl pH8.0、50 mmol/L EDTA pH 8.0、φ=3% β-巰基乙醇、20 g/L PVP)和等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，在65℃水浴中保溫提取30 min，冷卻至室溫后，12 000 r/min離心10 min，取上清液，再用等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提至蛋白除盡。上清液加入2倍體積的無水乙醇沉淀DNA，沉淀先后用φ=70%乙醇和無水乙醇洗滌后，短暫干燥，加30 μL TE溶解DNA。-20 ℃冰凍保存，備用。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 根據(jù)文獻(xiàn)[3,7]報道的植原體16S rDNA序列通用引物對R16mF2/R16mR1，R16F2/R16R2(由北京賽百盛公司合成)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物對序列如下：R16mF2：5′- CATGCAAGTCGAACGGA-3′,R16mR1:5′-CTTAACCCCAATCATCGAC-3′,R16F2：5′-ACGACTGCTAAGACTGG-3′，R16R2：5′-CGG- GGTTTGTACACACCGC-3′，反應(yīng)體系為25 μL。PCR 產(chǎn)物于10 g/L瓊脂糖凝膠中電泳，經(jīng)溴化乙錠染色后，在紫外透射燈下觀察。

1.2.3 基因克隆與核苷酸序列分析 參考常規(guī)方法開展基因克隆[8]、分類鑒定[9-11]。 把含有目標(biāo)外源片段的重組克隆送上海捷瑞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測定，用BLAST 軟件進(jìn)行檢索，采用Mega 6.0分析進(jìn)化關(guān)系。

1.2.4 菟絲子傳播 將盆栽的健康長春花苗置于菟絲子周圍，將菟絲子的藤蔓一頭纏繞其上，待菟絲子完全寄生長春花后，從菟絲子藤蔓另一頭切斷。將寄生菟絲子的長春花苗盆移至棗瘋病株瘋枝周圍，懸掛固定，將菟絲子藤蔓纏繞在幼嫩瘋枝上，保持傳毒1.5個月。將長春花苗轉(zhuǎn)移溫室培養(yǎng)，除掉菟絲子，紗網(wǎng)防蟲，觀察長春花癥狀，PCR檢測確定是否傳毒成功。

1.2.5 嫁接傳播 采用嵌芽法嫁接。剪取感染JWB長春花的病枝，切成1.5～2 cm莖段留1個葉柄作為接穗，在接穗芽下部的背面斜削一刀成馬蹄形，再在另一面斜削長0.3～0.5 cm，成楔形，然后插入健康長春花砧木的“T”字形切口皮下，用塑料薄膜條纏緊，將植株置于陰涼處，2 d后放入溫室，約2周后接穗成活。

2 結(jié)果與分析

2.1 棗瘋病植原體16S rDNA基因的克隆與同源性分析

對2016-2018年采集的陜西彬縣、佳縣、清澗縣的棗瘋病樣品總DNA進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增與測序，結(jié)果表明：PCR產(chǎn)物健康植株未擴(kuò)增出特異性條帶(圖 1)，陜西彬縣、佳縣、清澗縣3個棗區(qū)的棗瘋病病原植原體的16S rRNA基因序列均為1.2 kb，3個產(chǎn)區(qū)沒有株系分化現(xiàn)象。利用MEGA 6.0軟件分析陜西3個JWB株系與國際基因庫(NCBI)中韓國、日本、印度等13個JWB植原體株系16S rRNA堿基序列的同源關(guān)系，獲得進(jìn)化樹(圖 2)。結(jié)果顯示，棗樹JWB和酸棗棗瘋病(WJWB)植原體16S rRNA高度一致，同源性達(dá)到99.9%，JWB與16S rⅤ組B亞組成員榆樹黃化(EY)和懸鉤子叢枝病(RuS)的同源性分別是98.5%和98.3%?？梢娖鋵儆?6SrⅤ組B亞組。

2.2 苗木帶病分子檢測

從彬縣、佳縣、清澗縣采集的棗樹苗木樣品，采用植原體16S rDNA序列通用引物對R16mF2/R16mR1、R16F2/R16R2進(jìn)行PCR分子檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)市場上的棗樹苗部分帶有棗瘋病，以佳縣棗樹苗的帶病率最高，達(dá)到7.69%，彬縣帶病率最低，為4.35%；棗園酸棗經(jīng)過分子檢測發(fā)現(xiàn)帶病較多，以清澗縣酸棗苗的帶病率最高，達(dá)到 19.05%(表 1)。說明棗樹苗隱性帶病現(xiàn)象普遍，要選擇無病、健壯棗樹苗木建園是防止大面積發(fā)病的重要措施。

2.3 棗瘋病發(fā)病規(guī)律研究

2016-2018年對陜西彬縣、佳縣、清澗縣的棗瘋病進(jìn)行監(jiān)測調(diào)查，結(jié)果表明：棗瘋病每年5月中下旬開始表現(xiàn)癥狀，7月后癥狀逐漸明顯，顯現(xiàn)典型的簇狀黃化、小葉、叢枝癥狀，伴有芽的不正常萌發(fā)和花器退化成葉片。1 a生發(fā)育枝的芽萌發(fā)成叢生枝、節(jié)間短、萎縮黃化。開花以后葉片發(fā)生明顯病變，先是葉肉變黃，逐漸全葉黃化, 黃化后葉緣上卷，質(zhì)地變脆，翠綠焦枯脫落，其他枝條葉片呈現(xiàn)黃綠相間的花葉(圖3)。對葉片中提取的植原體16S rDNA條帶檢測發(fā)現(xiàn)，植原體在植物體內(nèi)的含量呈現(xiàn)季節(jié)性波動，春夏季節(jié)幼嫩組織植原體含量較高，而秋冬季老葉片與樹皮韌皮部組織，植原體含量會明顯降低。同時，調(diào)查還發(fā)現(xiàn)棗園酸棗發(fā)病率高時棗瘋病發(fā)生嚴(yán)重，說明通過昆蟲介體棗瘋病在棗樹與酸棗間相互傳播，酸棗棗瘋病株已經(jīng)成為棗園棗瘋病的一個重要初侵染源。

2.4 品種抗病性調(diào)查

對陜西大棗主產(chǎn)區(qū)棗瘋病調(diào)查結(jié)果顯示，‘砘子棗’‘馬牙棗’‘婆棗’發(fā)病率依次為19.38%、21.25%、25.32%，其次為‘酸鈴棗’‘紅平棗’‘黃河灘棗’‘長紅棗’‘木棗’，發(fā)病率依次為 15.65%、14.47%、14.38%、13.75%和13.13%，‘晉棗’發(fā)病率最低，為11.18%。說明棗樹品種間對棗瘋病抗病性存在明顯差異。 對‘晉棗’樹齡與發(fā)病率關(guān)系調(diào)查發(fā)現(xiàn)，樹齡的長短影響發(fā)病率，7～10 a 樹齡發(fā)病率為3.15%～8.12%，15～20 a樹齡發(fā)病率為9.26%～11.85%，有些老棗園達(dá)到 25.64%～31.36%。

M.標(biāo)準(zhǔn)DNA DL-2000 DNA marker；1～3.分別來自彬縣、佳縣、清澗縣的棗樹苗 Jujube stocks from Binxian, Jiaxian, Qingjianxian respectively；4～6.分別來自3個縣的酸棗苗 Wild jujube stocks from 3 counties above； 7～10.分別來自3個縣的健康棗樹苗 Healthy jujube stocks from 3 counties above；9.陽性棗瘋病株 Positive JWB stocks

圖1 棗樹苗木與酸棗中JWB植原體的PCR檢測
Fig.1 PCR detection of JWB phytoplasma in stocks of jujube and wild jujube

圖2 JWB植原體16S rDNA序列的同源進(jìn)化樹Fig.2 Dendrogram of JWB phytoplasma 16S rDNA sequences

棗區(qū)Jujube region彬縣 Binxian棗樹Jujube酸棗Wild jujube佳縣 Jiaxian棗樹Jujube酸棗Wild jujube清澗縣 Qingjianxian棗樹Jujube酸棗Wild jujube總株數(shù) Total plants463852346742帶病株數(shù) Plants carrying JWB254658帶病率/% Rate of diseased plants 4.3513.167.6917.657.4619.05

2.5 媒介昆蟲帶毒檢測與傳毒循環(huán)規(guī)律調(diào)查

在陜西彬縣、佳縣棗園采集的中華擬菱紋葉蟬(H.chinensis)、凹緣菱紋葉蟬(H.sellatus)、大青葉蟬(C.viridis)、條沙葉蟬(P.striatus)，用PCR檢測帶毒情況，結(jié)果顯示，中華擬菱紋葉蟬、凹緣菱紋葉蟬攜帶棗瘋病植原體，說明這兩種葉蟬是陜西棗區(qū)棗瘋病的媒介昆蟲(圖 3)。監(jiān)測調(diào)查中華擬菱紋葉蟬、凹緣菱紋葉蟬的生活習(xí)性與傳毒規(guī)律，發(fā)現(xiàn)在春季、夏季中華擬菱紋葉蟬、凹緣菱紋葉蟬主要生活在棗樹上，在嫩葉上取食、產(chǎn)卵繁殖，同時，一些中華擬菱紋葉蟬、凹緣菱紋葉蟬轉(zhuǎn)主寄生在棗園雜草或周邊的胡蘿卜、芹菜、茄子等作物上。進(jìn)入秋季氣溫逐漸降低，一些媒介昆蟲遷飛到地面雜草、三葉草、苜蓿、禾谷類作物上，在干草上產(chǎn)卵越冬，待春季氣候溫暖時孵化，葉蟬遷飛返回到棗樹嫩葉上生活，完成生活史。同時，葉蟬從發(fā)病樹取食攜帶病原，遷飛到地面中間寄主時將病害傳播過去，來年春季葉蟬遷飛返回到棗樹又將病原帶回棗樹，完成棗瘋病的一個侵染循環(huán)。葉蟬通過持久性方式傳播棗瘋病，成蟲和幼蟲均能傳病，雌雄交配后雌蟲產(chǎn)的卵，植原體不能入侵，所以卵孵化的幼蟲不再帶毒。

2.6 菟絲子和嫁接傳播

在溫室內(nèi)，采用菟絲子接種傳毒，接種1.5個月，長春花表現(xiàn)叢枝癥狀，表明菟絲子將棗瘋病從棗樹病株傳播到健康幼苗上(圖4-A)。另外，將發(fā)病的長春花幼芽作接穗嫁接到健康長春花上，接種2個月后，健康長春花幼苗逐漸出現(xiàn)叢枝小葉癥狀(圖4-B)，說明在長春花上嫁接能夠傳播棗瘋病。

M. DL-2000 DNA marker; 泳道1.大青葉蟬C.viridis; 2. 中華擬菱紋葉蟬H.chinensis; 3. 條沙葉蟬P.striatus; 4. 凹緣菱紋葉蟬H.sellatus; 5. 健康菟絲子 Healthy dodder; 6～7. 菟絲子傳播感染的長春花 Dodder-infected periwinkle; 8～9. 嫁接感染的長春花 Graft-infected periwinkle; 10. 健康長春花 Healthy periwinkle

圖3 棗瘋病植原體16S rRNA基因的PCR檢測
Fig.3 PCR detection of 16S rRNA gene in JWB phytoplasma

A. 菟絲子傳播感染的長春花 Periwinkle infected by dodder transmission; B.嫁接傳播感染的長春花(左為嫁接，右為健康) Periwinkle infected by graft transmission (Grafted on left and healthy on right)

圖4 棗瘋植原體的菟絲子和嫁接傳播
Fig.4 Transmission of JWB phytoplasma by dodder and grafted

3 討 論

20 世紀(jì)50 年代以來，一些研究單位先后開展棗瘋病的危害調(diào)查、病原存在部位的熒光觀察、傳毒昆蟲種類鑒定、抗生素防治等試驗(yàn)，但是從分子水平上對棗瘋病的苗木帶病檢測、初侵染源、果園病害循環(huán)、媒介昆蟲生活史等方面進(jìn)行的研究還比較少。本試驗(yàn)對陜西省3個主產(chǎn)區(qū)棗瘋病的發(fā)生危害、核苷酸序列測定及病原進(jìn)化關(guān)系、果園病害循環(huán)、品種抗病性、苗木帶毒檢測、菟絲子傳播等進(jìn)行研究，取得新的研究結(jié)果。

3.1 棗瘋病病原的16S rRNA基因序列分析與病害侵染循環(huán)

對3個主產(chǎn)區(qū)棗瘋病植原體16S rRNA基因序列分析，結(jié)果表明，目前陜西省3個主產(chǎn)區(qū)棗瘋病植原體高度一致，沒有分化；棗瘋病植原體和酸棗叢枝病植原體病原一致，隸屬于16S rⅤ組B亞組，與榆樹黃化(EY)親緣關(guān)系最近。分子檢測證明中華擬菱紋葉蟬、凹緣菱紋葉蟬能夠攜帶傳播棗瘋病。兩種葉蟬的寄主有棗樹、胡蘿卜、芹菜、茄子、三葉草、苜蓿、禾谷類等。葉蟬從發(fā)病樹取食攜帶病原，遷飛到地面中間寄主時將病害傳播過去，來年春季葉蟬遷飛返回到棗樹又將病原帶回棗樹，完成棗瘋病的一個侵染循環(huán)。

3.2 苗木帶毒與菟絲子傳播檢測、品種抗病性 調(diào)查

從彬縣、佳縣、清澗縣采集的棗樹苗樣品，采用植原體16S rDNA序列進(jìn)行PCR分子檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，市場上出售的棗樹苗帶病普遍，以佳縣棗樹苗的帶病率最高，達(dá)到7.69%，彬縣帶病率最低，為4.35%；棗園酸棗帶病較多，以清澗縣酸棗苗的帶病率最高，達(dá)到19.05%，說明棗樹苗隱性帶病普遍，所以，建議對棗園周邊的酸棗，要每年清除，清潔田園，減少初侵染源。新建棗園時，要選擇脫毒、健壯棗樹苗木栽植，以防止大面積發(fā)病。另外，避免在棗園周邊種植蔬菜、苜蓿、牧草、果樹，阻斷棗瘋病傳播介體的轉(zhuǎn)主寄主與越冬場所，遠(yuǎn)離棗瘋病的帶毒寄主，減少循環(huán)侵染，為棗瘋病的持續(xù)控制提供技術(shù)支撐。