袁也晴 張學(xué)齊 汪青蓉 張軼庠

摘要：目的? 研究驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員14（KIF14）在前列腺癌（PCa）細(xì)胞中的表達(dá)和對PCa細(xì)胞的生物學(xué)功能的影響。方法? 采用RT-PCR檢測KIF14在PCa細(xì)胞系中的RNA表達(dá)情況。使用siRNA（siKIF14組或siControl組）分別敲減PCa癌細(xì)胞22Rv1，RT-PCR驗(yàn)證敲減效率后，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)、Transwell試驗(yàn)分別檢測對兩側(cè)細(xì)胞增殖、遷移的影響。結(jié)果? KIF14在多種PCa細(xì)胞系中過表達(dá);siKIF14組22Rv1細(xì)胞的 KIF14的mRNA水平相比siControl組降低，表達(dá)量下降達(dá)（88±2）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;在KIF14表達(dá)被敲減后，siKIF14組細(xì)胞增殖相比siControl組在24 h和48 h均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;Transwell小室試驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，24h后，siKIF14組細(xì)胞遷移數(shù)（139.33±28.74）/每視野，較siControl組的（436.00±51.56）/每視野減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論? KIF14是潛在的癌基因，敲減KIF14表達(dá)可抑制PCa細(xì)胞的增殖與遷移，可能在PCa進(jìn)展中發(fā)揮作用。

關(guān)鍵詞：驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員14;前列腺癌;癌基因;增殖

中圖分類號(hào)：R737.25? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.09.022

文章編號(hào)：1006-1959（2019）09-0068-03

Abstract： Objective? To study the expression of kinesin family member 14 （KIF14） in prostate cancer （PCa） cells and its effect on the biological function of PCa cells. Methods? The expression of KIF14 in PCa cell line was detected by RT-PCR. PCR cancer cells 22Rv1 were knocked down by siRNA （siKIF14 group or siControl group）， and the knockdown efficiency was verified by RT-PCR. The effects of cell proliferation and migration were detected by cell counting and Transwell assay， respectively. Results? KIF14 was overexpressed in various PCa cell lines. The mRNA level of KIF14 in 22Rv1 cells of siKIF14 group was lower than that in siControl group， and the expression level decreased （88±2）%， the difference was statistically significant （P<0.05）. After KIF14 expression was knocked down， the cell proliferation of siKIF14 group was lower than that of siControl group at 24 h and 48 h，the difference was statistically significant （P<0.05）. The results of Transwell chamber test showed that after 24 h， the number of cell migration in the siKIF14 group （139.33±28.74）/per visual field was lower than that in the siControl group （436.00±51.56）/per visual field，the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion? KIF14 is a potential oncogene. Knockdown of KIF14 expression can inhibit the proliferation and migration of PCa cells， which may play a role in the progression of PCa.

Key words：Kinesin family member 14;Prostate cancer;Oncogene;Proliferation

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是男性最常見的惡性腫瘤之一，在美國其發(fā)病率居第1位，也是男性癌癥死亡第2大原因[1]。近年來國內(nèi)PCa發(fā)病率及死亡率逐年增高。部分PCa患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已進(jìn)展，失去手術(shù)機(jī)會(huì)，長期存活率不理想[2]。PCa發(fā)生、進(jìn)展以及向激素非依賴轉(zhuǎn)變的分子機(jī)制目前仍不明確，通過研究其機(jī)制，嘗試在分子水平對其進(jìn)行干預(yù)，是目前PCa研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)之一，更有效的治療策略及新靶點(diǎn)是該研究領(lǐng)域亟待解決的問題，對于PCa的防治具有重要意義。盡管在PCa中發(fā)現(xiàn)基因組改變方面取得了較大進(jìn)展，但新的基因組生物標(biāo)記和蛋白質(zhì)仍有待鑒定。驅(qū)動(dòng)蛋白家族蛋白（KIFs）是ATP-和微管相關(guān)的運(yùn)動(dòng)蛋白，參與細(xì)胞分裂，微管聚合物動(dòng)力學(xué)，細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[3]。驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員14（KIF14）含有C末端激酶結(jié)合區(qū)和調(diào)節(jié)胞質(zhì)分裂結(jié)合區(qū)的N末端蛋白[4，5]，在雙極紡錘體形成過程中與染色質(zhì)和微管結(jié)合[4-6]。KIF14表達(dá)上調(diào)可誘導(dǎo)快速且容易出錯(cuò)的有絲分裂，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生過程中的非整倍體形成[6]。雖然KIF14的確切分子功能仍在研究中，但多項(xiàng)證據(jù)表明KIF14是一種癌基因，其在包括肝細(xì)胞癌，胃癌，乳腺癌，膠質(zhì)瘤和卵巢癌等多種類型的腫瘤中過表達(dá)[6-12]。此外，KIF14水平是肝細(xì)胞癌和卵巢癌獨(dú)立的預(yù)后因素，KIF14過表達(dá)促進(jìn)腫瘤生長，而敲減會(huì)降低體外和移植瘤模型的致瘤性[13]。KIF14在PCa中的作用尚不明確，本研究將對KIF14在PCa細(xì)胞中的表達(dá)及其對PCa細(xì)胞的生物學(xué)功能的影響進(jìn)行分析，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染? PCa細(xì)胞系22Rv1購自ATCC。將細(xì)胞維持在含有10%胎牛血清（FBS），1%青-鏈霉素和2.5 mM谷氨酰胺的RPMI 1640培養(yǎng)基（Invitrogen）中，在37℃ 5%CO2條件下培養(yǎng)。KIF14-siRNA（siKIF14，Santa Cruz，sc-60882）和對照siRNA（siControl，Santa Cruz，sc-37007）購自美國Santa Cruz 生物技術(shù)公司。使用RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen，13778）根據(jù)制造商的說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1 RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和定量實(shí)時(shí)PCR? 用Trizol試劑提取RNA。正常前列腺RNA購自美國Clontech公司。隨機(jī)六聚體和SuperScript-Ⅲ（Invitrogen）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。使用實(shí)時(shí)PCR Master Mix（SYBR Green）通過Applied Biosystems 7300實(shí)時(shí)系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。標(biāo)準(zhǔn)曲線用于建立擴(kuò)增效率[14]，每個(gè)實(shí)驗(yàn)一式三份，重復(fù)3次，使用的所有引物見表1。

1.2.2生長曲線? 將22Rv1細(xì)胞以適當(dāng)?shù)拿芏冉臃N在6孔板中，分別用對照siRNA或siKIF14轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后，每24 h計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，包括起始點(diǎn)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)一式三份，重復(fù)3次。

1.2.3 Transwell試驗(yàn)? 在24孔板中用siRNA轉(zhuǎn)染后，使用Transwell小板（8 μm孔徑）評(píng)估細(xì)胞遷移。在上室中加入含無血清培養(yǎng)基的22Rv1細(xì)胞，在下室加入10%FBS培養(yǎng)基，24 h后在顯微鏡下在至少3個(gè)下室隨機(jī)區(qū)域中計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)。結(jié)果從至少3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中獲得。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析? 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5軟件包進(jìn)行分析。計(jì)量資料表示為（x±s）。各組間數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01表示統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著。

2結(jié)果

2.1 KIF14在PCa細(xì)胞中的表達(dá)情況? 通過RT-PCR檢測PCa細(xì)胞系和正常前列腺組織中KIF14的mRNA表達(dá)發(fā)現(xiàn)，與正常前列腺組織相比，KIF14在LAPC4、22Rv1、LNCaP、DU145、PC3等多個(gè)PCa細(xì)胞中明顯上調(diào)（P<0.05），見圖1。

2.2敲減KIF14對PCa細(xì)胞增殖的影響? 在用siRNA轉(zhuǎn)染48 h后，RT-PCR分析顯示，siKIF14組22Rv1細(xì)胞的 KIF14的mRNA水平相比siControl組降低，表達(dá)量下降達(dá)（88±2）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖2A。在KIF14表達(dá)被敲減后，siKIF14組細(xì)胞增殖相比siControl組在24 h和48 h均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖2B。這表明敲減KIF14抑制可PCa細(xì)胞的增殖。

2.3敲減KIF14對PCa細(xì)胞遷移的影響? Transwell小室試驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，24 h后，siKIF14組細(xì)胞遷移數(shù)（139.33±28.74）/每視野，較siControl組的（436.00±51.56）/每視野減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），這表明敲減KIF14抑制可PCa細(xì)胞的遷移，見圖2C。

3討論

腫瘤發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的過程，其中包含許多腫瘤抑制基因，癌基因及其相關(guān)信號(hào)通路的異常破壞。了解PCa腫瘤發(fā)生和發(fā)展的潛在機(jī)制，有利于早期診斷，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和選擇針對PCa的治療策略。本研究將KIF14鑒定為參與腫瘤進(jìn)展和PCa預(yù)后不良的潛在候選癌基因。

KIF14是參與細(xì)胞分裂，微管聚合物動(dòng)力學(xué)，細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的驅(qū)動(dòng)蛋白家族的成員[3]。越來越多的證據(jù)表明KIF14在多種類型的腫瘤中過度表達(dá)，包括肝細(xì)胞癌，乳腺癌等[7-12]，暗示其作為潛在癌基因的作用。KIF14的上調(diào)可能是由基因組擴(kuò)增引起的[9，12]。據(jù)報(bào)道，在肝細(xì)胞癌中，KIF14的缺失下調(diào)Skp2和Cks1的表達(dá)，導(dǎo)致p27Kip1的積累。Skp2和Cks1的下調(diào)也導(dǎo)致胞質(zhì)分裂失敗，這可能抑制腫瘤生長。抑制KIF14通過HCC細(xì)胞中Akt激酶的失活抑制遷移并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7]。在三陰性乳腺癌中也報(bào)道了KIF14對AKT磷酸化的影響[9]。

本研究證明，KIF在多個(gè)PCa細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步對從Oncomine數(shù)據(jù)庫，癌癥微陣列數(shù)據(jù)庫和綜合數(shù)據(jù)挖掘平臺(tái)[16]中提取數(shù)據(jù)，基于來自PCa患者樣本的兩個(gè)數(shù)據(jù)集的分析[17，18]后可以確定，與正常前列腺組織相比，KIF14在PCa中高度過表達(dá)。在PCa細(xì)胞22Rv1中敲減KIF14后，細(xì)胞增殖和遷移能力均受到明顯抑制。這些結(jié)果均表明KIF14可能在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但其促癌作用的機(jī)制以及對預(yù)后的影響目前尚不明確，有待進(jìn)一步深入的研究。

綜上所述，KIF14過表達(dá)有助于前列腺腫瘤進(jìn)展，是潛在的癌基因，KIF14可能是PCa治療的新靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

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