張瑞瑞

（湖北工業(yè)大學(xué) 馬克思主義學(xué)院 湖北省非物質(zhì)文化遺產(chǎn)研究中心，湖北 武漢 430068）

雜醇油是指除乙醇外含有≥3個(gè)碳原子的一元醇的總稱，在白酒中含量較大的為正丙醇、異丁醇和異戊醇[1]。α-酮酸經(jīng)埃里希途徑（Ehrlich）和合成代謝途徑（Harris）形成高級(jí)醇[2]。

白酒中過高的雜醇油含量，對(duì)人體有毒害作用，造成神經(jīng)系統(tǒng)充血，使人感覺頭痛[3]。雜醇油也是造成白酒苦味、澀味和渾濁的原因。降低白酒中的雜醇油含量，是提升白酒品質(zhì)的重要措施之一。

國(guó)內(nèi)外降低雜醇油的含量研究主要集中于原料和酒曲的優(yōu)選[4-5]，發(fā)酵工藝的調(diào)整[6-9]，白酒酒體的過濾等。采用對(duì)酒體的過濾去除白酒中雜醇油的含量，雖有一定效果，但是工藝復(fù)雜[10-12]，而且不可避免的會(huì)對(duì)酒體的口感產(chǎn)生影響?，F(xiàn)在白酒釀造的原料和酒曲都是精選后的原料和酒曲，而且每種白酒的釀造原料和酒曲都有其特定要求，可供選擇的優(yōu)質(zhì)原料和酒曲的種類有限。在工業(yè)化生產(chǎn)的規(guī)模下，發(fā)酵不同批次或同一批次的不同發(fā)酵槽或發(fā)酵罐都不可避免的存在細(xì)微差異，更精細(xì)調(diào)控發(fā)酵工藝從而降低雜醇油含量的挑戰(zhàn)性較大。

酯化酶能高效酯化醇和酸形成酯。正丙醇的沸點(diǎn)為97℃，乙酸正丙酯的沸點(diǎn)為101.6℃[13]；異戊醇的沸點(diǎn)為131.04℃，乙酸異戊酯的沸點(diǎn)為142.06℃[14]；異丁醇沸點(diǎn)為106.94℃，乙酸異丁酯沸點(diǎn)為116.75℃[15]。酯化酶的酯化具有高效和專一性的特點(diǎn)，利用酯化酶酯化雜醇油成酯，雜醇油被酯化為酯后，沸點(diǎn)升高，分子質(zhì)量變大。更大的分子質(zhì)量和更高沸點(diǎn)的酯類物質(zhì)在蒸餾時(shí)，從酒醅蒸餾出進(jìn)入酒體的量會(huì)大大降低。基因工程改造技術(shù)能夠得到酯化特定醇的酯化酶，能夠降低白酒中雜醇油的含量，提升白酒品質(zhì)；也可以運(yùn)用于酒頭或酒尾的處理，生產(chǎn)香味酯，將資源合理的利用。雜醇油形成的酯類具有一定果香味，因此，雜醇油酯化酶可以應(yīng)用于果香味香料的綠色化生產(chǎn)[16]。因此，通過構(gòu)建高效酯化雜醇油的酯化酶，在酒醅中添加酯化酶高效酯化雜醇油為相對(duì)應(yīng)的酯類，從而大幅度降低白酒中雜醇油的含量是一個(gè)新穎可行便捷的措施，形成的雜醇油的酯類還能豐富酒體中酯的種類，增加酒體口感飽滿度。

目前，釀酒酯化酶的報(bào)道關(guān)注于乙醇為底物的酯化酶[17-18]，例如生產(chǎn)乙酸乙酯、己酸乙酯的酯化酶、乳酸乙酯等酯化酶以及肉桂醇[19]、苯酚等為底物的酯化酶[20]，對(duì)釀酒酯化酶的研究主要集中于主要酯類風(fēng)味物質(zhì)酯化的酶。檢索PDB數(shù)據(jù)庫(kù)和酯化酶的相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)以雜醇油為底物的酯化酶和雜醇油酯化高活性酶的構(gòu)建鮮有報(bào)道。

本研究采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）擴(kuò)增酯化酶基因，易錯(cuò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（error-prone PCR）方法突變酯化酶基因，檢測(cè)酶活篩選出高效酯化雜醇油的酯化酶。雜醇油酯化酶的構(gòu)建不僅對(duì)提升白酒的保健品質(zhì)具有重要的意義，而且對(duì)綠色生產(chǎn)具有果香味的酯類具有重要的實(shí)際應(yīng)用意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

產(chǎn)酯化酶近平滑假絲酵母（Candida parapsilosis）：本實(shí)驗(yàn)室從深海沉積物中選育；大腸桿菌（Escherichiacoli）BL21、質(zhì)粒pET28a（+）：國(guó)家典型培養(yǎng)物保藏中心（national type culture collection，NTCC）-BioVector質(zhì)粒載體菌株細(xì)胞基因保藏中心。

1.1.2 化學(xué)試劑

乙酸正戊酯、乙酸正丙酯、乙酸異丁酯、乙酸異戊酯及乙醇（均為色譜純）：阿拉丁控股集團(tuán)有限公司；分子試劑盒：天根生化科技有限公司；EcoR I限制性內(nèi)切酶（10 U/mL）、Xho I限制性內(nèi)切酶（10 U/mL）：寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。D2500-01瓊脂糖凝膠回收試劑盒：北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L，調(diào)pH至7.0，用去離子水定容至1 L。在121℃條件下滅菌15 min。固體培養(yǎng)基中加入20 g/L瓊脂。

1.2 儀器與設(shè)備

ZHJH-C1214B超凈工作臺(tái)：上海智城分析儀器有限公司；FE20型pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器有限公司；AR1140電子分析天平：奧克斯國(guó)際貿(mào)易有限公司；PHX智能生化恒溫培養(yǎng)箱：寧波萊?？萍加邢薰?；C100 PCR儀、PowerPac電泳儀：美國(guó)Bio-Rad公司；7890A氣相色譜（gas chromatography，GC）儀：美國(guó)安捷倫公司；程序控制超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)HN-1000CS：上海汗諾儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 基因克隆

克隆Candida parapsilosis的酯化酶，編碼基因的堿基長(zhǎng)度均為1 398 bp，用RT-PCR方法克隆[21]。引物序列：lip1F-1（5"→3"）：CCGGAATTCATGCATTTTTGGTT CCTATCCA；lip1R-1（5"→3"）：TTGAATCTCATACATTTTCACATT CTCGAGCGG。下劃線部分為酶切位點(diǎn)。

1.3.2 質(zhì)粒構(gòu)建

將反轉(zhuǎn)錄獲取的PCR產(chǎn)物脂肪酶（lipase）及提取的空載質(zhì)粒pET28a（+）分別進(jìn)行雙酶切，再以T4 DNA連接酶于16℃條件下連接過夜。重組質(zhì)粒以化學(xué)轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入Escherichia coli DH5α，涂布卡那霉素抗性平板，37℃培養(yǎng)得到含目的基因的亞克隆菌株。單菌落進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，驗(yàn)證構(gòu)建的質(zhì)粒序列。

1.3.3 易錯(cuò)PCR

根據(jù)已知的基因序列，利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，引物序列：E-lip1F（5"→3"）：GGAATTC ATGCACTTTTGGTTCT；E-lip1R（5"→3"）：ATGCAGTTCCAAATTCTCGAGCGG。

使用含有初始酯化酶的質(zhì)粒作為易錯(cuò)PCR的模板。以即用型易錯(cuò)PCR試劑盒進(jìn)行易錯(cuò)PCR。獲得的目的條帶以膠回收試劑盒回收，儲(chǔ)存于-20℃?zhèn)溆谩Ｒ族e(cuò)PCR的PCR程序：94℃變性3min；94℃變性30s，62℃退火30 s，72℃延伸2 min，退火溫度每個(gè)循環(huán)下降0.5℃，循環(huán)11次。然后94℃變性30 s，56.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，循環(huán)19次。

利用瓊脂糖膠回收試劑盒回收純化擴(kuò)增產(chǎn)物，回收純化的易錯(cuò)PCR酯化酶產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

1.3.4 轉(zhuǎn)化和篩選

回收的易錯(cuò)PCR產(chǎn)物及空載質(zhì)粒pET28a（+）分別進(jìn)行EcoR I限制性內(nèi)切酶和Xho I限制性內(nèi)切酶雙酶切，酶切結(jié)束后純化，進(jìn)行T4 DNA酶連接。獲得的突變重組質(zhì)粒以電轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入Escherichia coli BL21，轉(zhuǎn)化后涂布卡那抗性LB平板，挑選單菌落。將挑取出的單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)6h，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-beta-D-thiogalactoside，IPTG）誘導(dǎo)培養(yǎng)20 h后進(jìn)行酶活檢測(cè)，檢測(cè)酯化雜醇油的酶活，活性高的為篩選的轉(zhuǎn)化子。

1.3.5 測(cè)序

提取酶活提高的轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，以pET28a（+）通用測(cè)序引物進(jìn)行PCR產(chǎn)物擴(kuò)增。產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，以DNAMAN軟件進(jìn)行序列的比對(duì)及翻譯，得到突變的編碼序列及氨基酸序列。

1.3.6 誘導(dǎo)表達(dá)和酯化酶酶液制備

挑取出的大腸桿菌（Escherichia coli）單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)6 h，加入IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)20 h。培養(yǎng)的菌液用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)120 W條件下超聲3 s，停10 s，超聲破碎2.0 min。破碎的菌液5 000 r/min離心10 min，上清液為酯化酶酶液，進(jìn)行3種醇的混合酯化以檢測(cè)酶活。

1.3.7 分析檢測(cè)

酯化酶酶活測(cè)定的酯化體系為：雜醇油含量（正丙醇、異丁醇、異戊醇）各1%；乙酸2%；酯化酶酶液50%；蒸餾水46%。先加水、雜醇油及乙酸，再加入酶液。且在加入粗酶液前，以200 g/L的NaOH溶液將體系pH調(diào)至3.5。粗酶液均做2組酯化體系，其中1組為試驗(yàn)組，1組為對(duì)照組。對(duì)照組為將酶液以等量的未誘導(dǎo)菌株酶液代替。酯化體系配制完畢后，放置于30℃、200 r/min恒溫?fù)u床中酯化1 d。酯化酶的定義為：24 h酯化合成1.0 mg/L酯所需的酶量為一個(gè)酶活單位（U/L）。

采用氣相色譜法測(cè)定酯化產(chǎn)物中酯含量[22-23]。以出峰時(shí)間定性，以峰面積定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 Candida parapsilosis酯化酶基因擴(kuò)增

重組質(zhì)粒構(gòu)建成功后，亞克隆于DH5α菌株中，以pET28a（+）質(zhì)粒測(cè)序通用引物進(jìn)行菌落原位PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)后測(cè)序，結(jié)果見圖1。由圖1可知，菌落原位PCR擴(kuò)增出的堿基大小約為1 400 bp，與預(yù)期大小一致。產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)的序列一致。

圖1 酯化酶大腸桿菌BL21原位菌落PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoresis of in situ PCR amplification product of Escherichia coli BL21

2.2 雜醇油酯化酶易錯(cuò)PCR

易錯(cuò)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖2a。由圖2a可知，通過梯度降度PCR（touch down-PCR，TD-PCR）程序，該易錯(cuò)PCR的特異性極好，且目的條帶的大小與預(yù)期的一致。易錯(cuò)PCR產(chǎn)物膠回收純化，純化的易錯(cuò)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖2b。由圖2b可知，純化后彌散帶消失。單一的目的條帶有利于高效酶切和高效與酶切的質(zhì)粒連接。

圖2 易錯(cuò)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(a)、易錯(cuò)PCR產(chǎn)物切膠純化片段及收獲片段(b)電泳圖Fig.2 Electrophoresis of error-prone PCR amplification products(a)and purified and harvested fragment of error-prone PCR product by cutting gel(b)

2.3 篩選轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生的酯化酶的酯化性能

以空載質(zhì)粒E.coli BL21酶液為空白對(duì)照，Candida parapsilosis酯化酶作為初始酯化酶。初始酯化酶在大腸桿菌（Escherichiacoli）BL21表達(dá)得的酯化酶活性為：乙酸正丙酯10.828U/L；乙酸異丁酯2.579 U/L；乙酸異戊酯3.82 U/L。

初始酯化酶經(jīng)過多次易錯(cuò)PCR，以及PCR產(chǎn)物酶切，連接質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化篩選，獲得1株雜醇油酯化能力顯著突變菌株L1-70，其酯化酶催化活性測(cè)定結(jié)果見表1。由表1可知，菌株L1-70對(duì)正丙醇、異丁醇及異戊醇均有酯化作用，酯化酶酶活分別是初始酯化酶酶活的2.28倍、2.42倍及2.29倍。已有報(bào)道的酯化酶的研究主要為以乙醇為底物的酶[17-19]，構(gòu)建的雜醇油酯化酶能高效酯化非乙醇的高級(jí)醇。酯化酶對(duì)雜醇油酯化能力的提高主要原因是氨基酸序列的改變導(dǎo)致的酯化酶三維結(jié)構(gòu)的改變[24]，三維結(jié)構(gòu)的改變可能導(dǎo)致了結(jié)合部位或催化部位的改變，從而更有利于雜醇油、乙酸和酶形成復(fù)合物，進(jìn)而形成乙酸正丙酯、乙酸異丁酯、乙酸異戊酯。

表1 初始酯化酶與構(gòu)建酯化酶的酶活對(duì)比Table 1 Comparison of the original esterase and the constructed esterase activities

2.4 高活性雜醇油酯化酶的氨基酸序列

對(duì)正向突變菌株L1-70測(cè)序，再以分析軟件進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果見圖3。由圖3可知，L1-70突變的堿基為3個(gè)，突變的氨基酸也為3個(gè)，分別為V146D：146位纈氨酸突變?yōu)樘於彼?；T198I：198位蘇氨酸突變?yōu)楫惲涟彼幔籈376K：376位谷氨酸突變?yōu)橘嚢彼帷Ｃ傅陌被嵬蛔兡軌蛱岣呙富?，可能的原因是氨基酸序列突變后，造成酶整體結(jié)構(gòu)或局部結(jié)構(gòu)的變化，而結(jié)構(gòu)變化的結(jié)果可能導(dǎo)致底物更容易進(jìn)入到酶的結(jié)合部位，從而更容易在結(jié)合部位結(jié)合，并在催化部位作用下相互縮合成酯。酶催化活性提高的原因也可能是氨基酸序列改變后，造成酶表面電荷的變化，表面電荷的變化更有利于酶催化合成酯。酶結(jié)構(gòu)的改變也可能賦予了酯化酶更好的熱穩(wěn)定性，因而提高了酶的活性[25]。

圖3 突變菌株L1-70與原始菌株酯化酶的氨基酸序列比對(duì)Fig.3 Amino acid sequence alignment of lipase of mutant strain L1-70 and original strain

3 結(jié)論

本研究通過RT-PCR擴(kuò)增出酯化酶基因，易錯(cuò)PCR構(gòu)建出高效酯化雜醇油的酯化酶。構(gòu)建酯化酶的乙酸正丙酯、乙酸異丁酯、乙酸異戌酯酶活分別是初始酯化酶酶活的2.28倍、2.42倍、2.29倍。構(gòu)建的高效雜醇油酯化酶在釀酒行業(yè)具有重要的實(shí)際應(yīng)用意義。解析酶的晶體結(jié)構(gòu)，分子對(duì)接研究雜醇油高效酯化酶的分子動(dòng)力學(xué)等是進(jìn)一步研究的方向。