響應(yīng)面法優(yōu)化椰漿蛋白發(fā)酵飲料發(fā)酵工藝

藺志穎，張博文*，李 佳

（西安源森生物科技有限公司，陜西 西安 710000）

椰漿是椰子榨汁后形成的產(chǎn)物，主要用作飲料或烹調(diào)的原料[1]。椰漿富含蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)、維生素等營養(yǎng)成分[2-4]，椰子中的脂肪46%為月桂酸，它是中鏈甘油三酯的主要來源，不會增加膽固醇水平、具有抗菌等生理功能[5]。鮮榨椰漿極易受到環(huán)境中微生物的污染，致使椰漿產(chǎn)品產(chǎn)氣、膨脹、脹裂罐，故目前市場的椰漿產(chǎn)品主要有冷凍椰漿和滅菌椰漿兩種[6-7]，在產(chǎn)品形式上較為單一。

乳酸菌作為一種常見的發(fā)酵菌種，應(yīng)用在食品加工中起到改善風(fēng)味，延長產(chǎn)品保質(zhì)期和增強保健的功能[8]。乳酸食品對人體健康具有調(diào)節(jié)腸道功能、促進(jìn)新陳代謝、增強免疫力等功效[9-11]。目前，被廣泛應(yīng)用于酸奶、發(fā)酵飲料、肉制品加工中。

近年來，全球植物蛋白市場增長迅猛，消費者對植物蛋白的需求將持續(xù)增長，植物性食品的全球需求量在2013年至2017年間增長了62%[12]。目前市場上大多數(shù)為植物蛋白飲料，而在發(fā)酵方面研究較少。國內(nèi)外近些年的研究主要是以奶粉及椰漿為原料，研究發(fā)酵椰奶的工藝及發(fā)酵過程中營養(yǎng)成分的變化[13]。SHANA R等[14]以椰奶和牛奶混合發(fā)酵，研制出感官及性狀較好的印度傳統(tǒng)椰漿酸奶；GARDIOLA A B等[15]研究了不同乳酸菌發(fā)酵對椰漿蛋白中氨基酸含量的變化，結(jié)果表明，乳酸酸發(fā)酵提高了椰子蛋白濃縮物的賴氨酸和蛋氨酸水平。

本研究旨在以椰漿乳原料，通過乳酸菌發(fā)酵研制植物基蛋白發(fā)酵飲料，并采用單因素及響應(yīng)面試驗優(yōu)化其發(fā)酵工藝條件，在提高椰漿的利用率的同時，豐富蛋白發(fā)酵飲料的種類，提升椰漿乳的營養(yǎng)價值，并為今后椰漿發(fā)酵蛋白飲料產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供工藝指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

椰漿粉：海南南派實業(yè)有限公司；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、雙歧桿菌（Bifidobacterium）BB-12、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜熱鏈球菌（Strep-tococcus thermophilus）菌粉：江蘇微康生物科技有限公司；白砂糖（食品級）：市售；MRS肉湯培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；氫氧化鈉、酚酞（均為分析純）：天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DUP-9160B智能電熱恒溫培養(yǎng)箱：上?，槴\實驗設(shè)備有限公司；BHC-1300IIA/B2無菌操作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；YXQ-LS-70A立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊試驗有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；PHS-3C雷磁pH計：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；SLS-60高壓均質(zhì)機：上海申鹿均質(zhì)機有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 椰漿蛋白發(fā)酵飲料工藝流程

1.3.2 操作要點

椰漿粉按照料水比1∶4（g∶mL）加常溫蒸餾水溶解，加入適量白砂糖及0.05%的穩(wěn)定劑，將加入配料的原料預(yù)熱60℃，采用高壓均質(zhì)機在15 MPa條件下進(jìn)行均質(zhì)，于90℃條件下殺菌15 min，冷卻至45℃后，無菌條件下接種1.5‰乳酸菌菌粉（植物乳桿菌∶雙歧桿菌BB-12∶保加利亞乳桿菌∶嗜熱鏈球菌=1∶1∶1∶1），在溫度為43 ℃條件下[16]發(fā)酵16 h，發(fā)酵結(jié)束后在4℃條件下后熟12 h。

1.3.3 椰漿蛋白發(fā)酵飲料工藝優(yōu)化單因素試驗

以發(fā)酵溫度43℃、接種量（植物乳桿菌∶雙歧桿菌BB-12∶保加利亞乳桿菌∶嗜熱鏈球菌=1∶1∶1∶1）1.5‰、發(fā)酵時間16 h和白砂糖添加量4%為基礎(chǔ)發(fā)酵條件，對接種量（0.5‰、1.0‰、1.5‰、2.0‰、2.5‰）、發(fā)酵時間（8 h、12 h、16 h、20 h、24 h）和白砂糖添加量（2%、3%、4%、5%、6%）進(jìn)行單因素試驗，考察接種量、發(fā)酵時間及白砂糖添加量對椰漿蛋白發(fā)酵飲料酸度及感官品質(zhì)的影響。

1.3.4 響應(yīng)面試驗優(yōu)化椰漿蛋白發(fā)酵飲料發(fā)酵工藝

在單因素的基礎(chǔ)上，采用Box-Benhken試驗設(shè)計，設(shè)置接種量（A）、發(fā)酵時間（B）和白砂糖添加量（C）3因素為自變量，以單因素結(jié)果為中心點，設(shè)3個水平，以發(fā)酵產(chǎn)品感官評分（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行發(fā)酵工藝優(yōu)化，響應(yīng)面試驗因素與水平見表1。

表1 Box-Benhken試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Benhken experiments design

1.3.5 分析檢測

（1）總酸

按照GB 541334—2010《乳和乳制品酸度的測定》測定發(fā)酵蛋白飲料總酸。

（2）蛋白質(zhì)

按照GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》測定發(fā)酵蛋白飲料蛋白質(zhì)含量。

（3）感官評價

選擇10人組成感官評價小組，對椰漿蛋白發(fā)酵飲料的色澤、氣味、組織形態(tài)及口感進(jìn)行評價，滿分10分，感官評價標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 椰漿蛋白發(fā)酵飲料感官評價標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of coconut milk protein fermented beverage

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用Design Expert8.0.5進(jìn)行分析處理，采用Origin 8.0軟件繪圖處理。每組試驗3次平行，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 椰漿蛋白發(fā)酵飲料工藝優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 接種量對椰漿蛋白發(fā)酵飲料的酸度和感官評價的影響

不同接種量對椰漿蛋白發(fā)酵飲料的酸度和感官評價的影響結(jié)果見圖1。由圖1可知，接種量為0.5‰時，發(fā)酵成熟的樣品酸度僅為47.8°T左右。隨著接種量在0.5‰～2.5‰范圍內(nèi)的增加，椰漿蛋白發(fā)酵飲料酸度呈持續(xù)上升的趨勢。在接種量為1.5‰時，酸度達(dá)61.3°T；當(dāng)接種量為2.5‰時，酸度達(dá)70.0°T。隨著接種量在0.5‰～2.5‰范圍內(nèi)的增加，感官評分呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在接種量為1.5‰時，感官評分最高，達(dá)9.0分，酸度適宜。而低接種量條件下，由于菌種產(chǎn)酸量較低，產(chǎn)品酸味不明顯[17]；接種量為2.5‰時，由于產(chǎn)酸量的增加，導(dǎo)致產(chǎn)品酸味過于明顯，掩蓋了本身的椰奶風(fēng)味，使得在感官上接受度降低[18]，綜合感官評分僅為7.1分。綜合接種量對產(chǎn)品酸度及感官評分的影響，選擇接種量為1.5‰。

圖1 接種量對椰漿蛋白發(fā)酵飲料酸度及感官評價的影響Fig.1 Effects of inoculum on acidity and sensory evaluation of coconut milk protein fermented beverage

2.1.2 發(fā)酵時間對椰漿蛋白發(fā)酵飲料的酸度和感官評價的影響

不同發(fā)酵時間對椰漿蛋白發(fā)酵飲料的酸度和感官評價的影響結(jié)果見圖2。由圖2可知，發(fā)酵時間對酸度影響較大，隨著發(fā)酵時間在8～24 h范圍內(nèi)的延長，菌種持續(xù)產(chǎn)酸，使得產(chǎn)品酸度呈上升趨勢。發(fā)酵8 h時，酸度僅為30.1°T；而發(fā)酵24h后，酸度達(dá)67.2°T，約為發(fā)酵8 h產(chǎn)品酸度的2倍。隨著發(fā)酵時間在8～24 h范圍內(nèi)的延長，感官評分呈先上升后下降的趨勢。發(fā)酵時間＜12 h之前，由于乳酸積累較少，使得產(chǎn)品發(fā)酵酸味不明顯，導(dǎo)致評分較低。而隨著發(fā)酵的進(jìn)行，乳酸積累，產(chǎn)品發(fā)酵酸味提升，甜酸適宜，在發(fā)酵20 h時，感官評分最高，達(dá)到8.3分。隨著發(fā)酵時間的進(jìn)一步延長，酸度積累過高導(dǎo)致風(fēng)味過酸，且發(fā)酵時間過長導(dǎo)致乳清析出，并導(dǎo)致評分呈現(xiàn)下降趨勢[19-20]。

圖2 發(fā)酵時間對椰漿蛋白發(fā)酵飲料酸度及感官評價的影響Fig.2 Effects of fermentation time on acidity and sensory evaluation of coconut milk protein fermented beverage

綜合發(fā)酵時間對產(chǎn)品酸度及感官評分的影響，選擇發(fā)酵時間為20 h。

2.1.3 白砂糖添加量對椰漿蛋白發(fā)酵飲料的酸度和感官評價的影響

不同白砂糖添加量對椰漿蛋白發(fā)酵飲料的酸度和感官評價的影響結(jié)果見圖3。由圖3可知，白砂糖添加量對椰漿蛋白發(fā)酵飲料的酸度影響較小，發(fā)酵成熟后酸度含量差異不明顯，成品酸度均在63°T左右。隨著白砂糖添加量在2%～6%范圍內(nèi)的增加，感官評分呈先上升后下降趨勢，白砂糖添加量較少時，發(fā)酵飲料酸味較明顯，且風(fēng)味上醋酸味明顯，感官評分僅為7.1分；白砂糖添加量為4%時，感官評分最高為8.9分；白砂糖添加量＞4%之后，會影響菌種的生長，導(dǎo)致產(chǎn)品在組織形態(tài)上表現(xiàn)出少量乳清析出的狀態(tài)，且口感過甜無法接受[21]。

圖3 白砂糖添加量對椰漿蛋白發(fā)酵飲料酸度及感官評價的影響Fig.3 Effects of sugar addition on acidity and sensory evaluation of coconut milk protein fermented beverage

綜合白砂糖添加量對產(chǎn)品酸度及感官評分的影響，選擇白砂糖添加量為4%。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化椰漿蛋白發(fā)酵飲料工藝

2.2.1 回歸方程建立與方差分析

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以接種量（A）、發(fā)酵時間（B）及白砂糖添加量（C）為自變量，感官評分（Y）為因變量進(jìn)行響應(yīng)面試驗，Box-Benhken試驗設(shè)計及結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

表3 Box-Benhken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Design and results of Box-Benhken experiments

續(xù)表

采用Design Expert 8.0.5軟件對表4數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸方程擬合，得到感官評分（Y）對接種量（A）、發(fā)酵時間（B）及白砂糖添加量（C）的二次多項回歸方程：

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

由表4可知，模型極顯著（P=0.000 2＜0.01），失擬項不顯著（P=0.123 4＞0.05）。回歸模型的決定系數(shù)R2=0.97，說明該模型能夠很好地描述試驗結(jié)果。變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）為89%，說明模型的準(zhǔn)確度及可靠性較高[22]。從表4中P值和回歸方程中各因素的一次項系數(shù)的絕對值大小可知，影響椰漿蛋白發(fā)酵飲料感官評價因素主次順序為白砂糖添加量＞接種量＞發(fā)酵時間[23]。一次項C及交互項BC對產(chǎn)品感官評分的影響達(dá)到顯著水平（P＜0.05），二次項A2、B2及C2對產(chǎn)品感官評分的影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。

2.2.2 各因素響應(yīng)面交互作用分析

采用Design Expert8.0.5軟件對影響椰漿蛋白發(fā)酵飲料的3個因素進(jìn)行交互分析，結(jié)果見圖4。

圖4 接種量、發(fā)酵時間和白砂糖添加量對椰漿蛋白發(fā)酵飲料感官評價影響的響應(yīng)面及等高線Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of interaction between inoculum，fermentation time and sugar addition on sensory evaluation of coconut milk protein fermented beverage

由圖4可知，等高線的形狀反映出交互效應(yīng)的強弱大小，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形則與之相反[24]。接種量固定不變，椰漿蛋白發(fā)酵飲料的感官評價隨發(fā)酵時間增加，呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢；發(fā)酵時間不變，感官評價隨乳酸菌接種量的增加先急劇增大后明顯減小。乳酸菌接種量固定不變，感官評價隨白砂糖添加量的增加，呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢；白砂糖添加量不變，椰漿蛋白發(fā)酵飲料的感官評價隨接種量的增加，增大并在后面呈下降趨勢。固定發(fā)酵時間，感官評分隨白砂糖添加量的增加急劇增大后略有下降，白砂糖添加量不變，感官評分隨發(fā)酵時間的增加，變化不明顯。

2.2.3 最優(yōu)發(fā)酵條件的確定及驗證

根據(jù)多元二次回歸方程，得到最優(yōu)發(fā)酵條件為乳酸菌接種量1.00‰，白砂糖添加量3.95%，發(fā)酵時間20.5 h，得到的產(chǎn)品感官評分理論值為9.39分。為了便于實際操作，將發(fā)酵工藝條件修改為接種量1.00‰，白砂糖添加量4.0%，發(fā)酵時間20 h，根據(jù)此條件進(jìn)行驗證試驗，得到的產(chǎn)品感官評分實際值達(dá)9.37分，酸度63°T，蛋白含量1.1 g/100 mL。其中感官評分與理論值差別不大，說明該模型能夠較好地模擬和預(yù)測試驗結(jié)果。

3 結(jié)論

通過單因素試驗對接種量、發(fā)酵時間和白砂糖添加量進(jìn)行優(yōu)化，利用響應(yīng)面優(yōu)化椰漿蛋白發(fā)酵飲料工藝參數(shù)。最優(yōu)發(fā)酵工藝條件為將乳酸菌按植物乳桿菌∶雙歧桿菌BB-12∶保加利亞乳桿菌∶嗜熱鏈球菌=1∶1∶1∶1的比例接種于添加了4.0%白砂糖的椰漿中，接種量為1.00‰，43℃條件下發(fā)酵20 h。在此發(fā)酵條件下，椰漿蛋白發(fā)酵飲料感官評分達(dá)9.37分，酸度63 °T，蛋白含量1.1 g/100 mL，符合國家農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 433—2014《綠色食品植物蛋白飲料》要求，色澤乳白，具有椰奶香味及發(fā)酵特有的風(fēng)味，是一款老少咸宜的植物基蛋白發(fā)酵飲料。