王凌琴，李浩然，閆苗苗，鄭煜黌，陳 明，劉紅娜*

（西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030）

奶啤又稱“奶香檳”，是以鮮牛奶作為原料，利用二次生物發(fā)酵技術(shù)釀制的一種高附加值、低醇（0.5%vol～2.5%vol）、含二氧化碳的高級乳制飲品[1-3]。奶啤口感酸甜，有機地將酸奶和啤酒的香氣糅合在了一起，形成了奶啤特有的香氣[4]。同時具有維持腸道內(nèi)益生菌群多樣性[5]，調(diào)整腸道運動[6]改善便秘[7]、提高人體免疫力[8]、低酒精度、泡沫豐富、適度的二氧化碳、酸甜可口、營養(yǎng)全面的特點[9]。

隨著我國乳品工業(yè)的快速發(fā)展，奶啤的開發(fā)研究也不斷深化。奶啤在口感、風(fēng)味、保健、營養(yǎng)方面獲得了廣大消費者的認(rèn)同，市場前景廣闊[10]。但是目前奶啤仍存在一些問題，國內(nèi)奶啤生產(chǎn)商大多采用市售的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）進(jìn)行奶啤發(fā)酵，造成產(chǎn)品的口味雷同，品種單一，酵母餿味較重[11]；生產(chǎn)過程中由于需要添加大量酒花、麥芽等原料，造成生產(chǎn)工藝復(fù)雜，成本偏高，不能很好的適應(yīng)市場的要求[12]。為解決上述問題，許多專家學(xué)者對奶啤的工藝進(jìn)行了多方面的試驗，研究主要集中在配方[13-16]、發(fā)酵菌種[17-19]等方面的改善。目前，生產(chǎn)奶啤使用的乳酸菌主要是嗜熱鏈球菌（Streptococcusthermophilus）、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus），鮮少使用干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）作為奶啤的發(fā)酵劑。干酪乳桿菌發(fā)酵乳飲料能避免沉淀的產(chǎn)生，保持酒體泡沫豐富[20]，增強奶香和醇香風(fēng)味，更好地改善口感。

本試驗以奶啤感官評定、酒精度、酸度為評價指標(biāo)，以鮮牛奶、麥芽和酒花為主要原料，通過從益生菌飲料養(yǎng)樂多中分離純化的干酪乳桿菌與啤酒酵母進(jìn)行二次發(fā)酵研制新型奶啤，通過單因素及正交試驗，對酵母菌接種量、啤酒原漿與原發(fā)酵乳的體積比、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間等工藝參數(shù)進(jìn)行研究，確定其最佳工藝條件，并對其質(zhì)量進(jìn)行分析，旨在為奶啤工業(yè)化生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮牛奶（水分86.5%、脂肪3.5%、蛋白質(zhì)3.2%、灰分1.3%、乳糖4.5%）：西北民族大學(xué)養(yǎng)殖場；脫脂奶粉：新西蘭恒天然集團；麥芽汁及酒花：大連杰菲食品有限公司；蔗糖：市售；干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）：本實驗室從養(yǎng)樂多中分離得到；啤酒酵母M54：英國Imake公司；蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、吐溫-80、瓊脂、硫酸鎂、葡萄糖、檸檬酸二胺、鄰苯二甲酸氫鉀、乳糖、乙酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸錳、碳酸鈣、氫氧化鈉、體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。實驗所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

JA2003N型電子天平：上海精密儀器有限公司；TGL16M型離心機：長沙市易達(dá)科貿(mào)公司；MC-3032S高壓蒸汽滅菌鍋：Midorigaoka公司；PB-10酸度計：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；DHP-9272恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DHG-9241A型電熱恒溫干燥箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；酒精計：河北省河間市黎民居儀表廠。

1.3 方法

1.3.1 奶啤加工工藝流程[13]

鮮牛奶→預(yù)處理→離心脫脂→加糖→殺菌→均質(zhì)→冷卻→接種→發(fā)酵→冷卻后熟→原發(fā)酵乳液→后發(fā)酵（二次發(fā)酵）→過濾→殺菌→成品（奶?。?/p>

1.3.2 操作要點

原料預(yù)處理：新鮮牛奶用100目紗布過濾，以除去雜質(zhì)。

離心脫脂：將過濾后的鮮奶放入離心機中以4500r/min的轉(zhuǎn)速離心20 min，進(jìn)行乳脂分離，得到脫脂牛奶。

加糖、殺菌、冷卻：在脫脂牛奶中加入8%的蔗糖，并攪拌均勻，在65℃、15 min條件下殺菌，并冷卻至45℃。

均質(zhì)：將殺菌后的脫脂牛奶在15～20MPa壓力下均質(zhì)，使產(chǎn)品口感細(xì)膩，提高穩(wěn)定性[21]。

生產(chǎn)發(fā)酵劑的制備[22]：將干酪乳桿菌接入滅菌的12%脫脂乳粉培養(yǎng)基中，在37℃恒溫培養(yǎng)至凝固，即為母發(fā)酵劑，再進(jìn)行擴大培養(yǎng)，直至凝固時間均在8 h，即制得生產(chǎn)發(fā)酵劑，冷藏備用。

接種、發(fā)酵[22]：脫脂處理后的牛奶中接入5%的生產(chǎn)發(fā)酵劑，在37℃條件下發(fā)酵18 h。

冷卻后熟[23]：將發(fā)酵好的酸乳放入4℃條件下進(jìn)行后熟發(fā)酵12 h，使發(fā)酵乳形成良好風(fēng)味，得到原發(fā)酵乳液。

啤酒酵母活化[13]：取8°P煮沸麥芽汁50 mL，加等量的無菌水，迅速冷卻至18～20℃，加入2 g啤酒酵母，進(jìn)行保溫活化。在活化過程中搖床轉(zhuǎn)速應(yīng)控制在200 r/min，使得麥芽汁和酵母均勻接觸，活化2 h后備用。

啤酒原漿的制備[24]：將麥芽汁（含酒花）進(jìn)行高壓滅菌（121℃，20 min），取300 mL冷卻后的麥芽汁接入一定量的活化酵母液。發(fā)酵溫度為20℃，發(fā)酵48h后，殘?zhí)墙抵?°Bx，降溫至10℃排渣，即得到啤酒原漿。

二次發(fā)酵：將啤酒原漿與原發(fā)酵乳液按照一定比例加入混合后進(jìn)行二次發(fā)酵（后發(fā)酵），發(fā)酵溫度28℃，發(fā)酵時間16 h，酒精度為2.0%vol～2.5%vol時后發(fā)酵完成，然后降溫至0℃。

過濾、殺菌：貯酒4 d后進(jìn)行過濾（8層紗布），再以70℃、15 min條件進(jìn)行后殺菌，即得奶啤成品。

1.3.3 奶啤發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

活化酵母接種量分別為3%、4%、5%、6%、7%，蔗糖添加量分別為6%、7%、8%、9%、10%，將啤酒原漿與原發(fā)酵乳按9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、1∶1體積比混合，二次發(fā)酵溫度24 ℃、26 ℃、28 ℃、30℃、32℃，發(fā)酵時間8 h、12 h、16 h、20 h、24 h的條件下進(jìn)行二次發(fā)酵。殺菌后取樣測定各發(fā)酵液酒精度、酸度，并進(jìn)行感官評定，考察不同酵母接種量、蔗糖添加量、啤酒原漿與原發(fā)酵乳體積比、二次發(fā)酵溫度及二次發(fā)酵時間對奶啤品質(zhì)的影響。

1.3.4 奶啤發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗

以奶啤酒精度、滴定酸度和感官評分為評價指標(biāo)，以酵母接種量（A）、啤酒原漿與原發(fā)酵乳的體積比（B）、二次發(fā)酵溫度（C）和二次發(fā)酵時間（D）為主要影響因素，進(jìn)行4因素3水平L9（34）正交試驗設(shè)計，因素與水平見表1。

表1 奶啤工藝條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for process conditions optimization of milk beer

1.3.5 感官評定

采用感官鑒定評分法[25]選評價員20人，按照酸甜比、氣味、酒味、口感及組織狀態(tài)、綜合風(fēng)味在奶啤感官中的重要程度，確定相應(yīng)評分比例，總分100分，奶啤的感官評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 奶啤的感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of milk beer

續(xù)表

1.3.6 理化指標(biāo)測定

酒精含量、滴定酸度測定參考文獻(xiàn)[26]中的方法進(jìn)行；蛋白質(zhì)測定參考NY/T 799—2004《發(fā)酵型含乳飲料》[27]；可溶性固形物測定參考GB/T 23546—2009《奶酒》[28]。

1.3.7 統(tǒng)計分析方法

試驗數(shù)據(jù)采用Micorosoft Excel 2010和SPSS Statistics 17.0進(jìn)行分析處理。同時用Duncan"s法進(jìn)行顯著性分析和標(biāo)準(zhǔn)偏差（standard deviation，SD）的計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同單因素對奶啤品質(zhì)的影響

2.1.1 酵母接種量對奶啤品質(zhì)的影響

酵母菌接種量對奶啤滴定酸度、酒精度及感官品質(zhì)的影響結(jié)果分別見圖1和表3。

圖1 酵母接種量對奶啤酒精度和滴定酸度的影響Fig.1 Effect of yeast inoculum on alcohol content and titration acidity of milk beer

由圖1可知，隨著酵母接種量在3%～7%范圍內(nèi)的增大，酒精度和滴定酸度呈增大趨勢；5%接種量發(fā)酵的奶啤酒精度、滴定酸度分別為1.6%vol、76.9°T；接種量＞5%之后，奶啤酒精度、滴定酸度偏高。結(jié)果表明，接種量5%的奶啤酒精度、滴定酸度均較為適宜。

表3 酵母接種量對奶啤感官品質(zhì)的影響Table 3 Effect of yeast inoculum on sensory quality of milk beer

由表3可知，接種量＜5%之前，酸感較大，香味較差，味寡淡；接種量＞5%之后，酵母自溶數(shù)量會增多，使奶啤產(chǎn)生酵母味或其他異味[30]；5%接種量奶啤香味協(xié)調(diào)，飽滿，口感柔和，酸甜適中，感官評分達(dá)到最大值，為79分。

因此，綜合考慮，酵母接種量為5%時為宜。

2.1.2 啤酒原漿與原發(fā)酵乳體積比對奶啤品質(zhì)的影響

啤酒原漿和原發(fā)酵乳的體積比對奶啤滴定酸度、酒精度及感官品質(zhì)的影響結(jié)果分別見圖2和表4。

圖2 啤酒原漿與原發(fā)酵乳的體積比對奶啤酒精度和滴定酸度的影響Fig.2 Effect of volume ratio of beer raw pulp to raw fermented milk on alcohol content and titration acidity of milk beer

由圖2可知，隨著啤酒原漿與原發(fā)酵乳液體積比的減小，酒精度呈下降趨勢，滴定酸度呈增大趨勢。啤酒原漿與原發(fā)酵乳的體積比為9∶1～7∶3時，酒精度過高，滴定酸度過低；啤酒原漿與原發(fā)酵乳的體積比為7∶3時，酒精度和滴定酸度分別為2.2%vol、72.8°T；啤酒原漿與原發(fā)酵乳的體積比為7∶3～1∶1時，酒精度過低，僅為1.5%vol，而滴定酸度達(dá)到82°T。結(jié)果表明，啤酒原漿與原發(fā)酵乳的體積比為7∶3時，酒精酸度和滴定酸度均較為適宜。

由表4可知，啤酒原漿與原發(fā)酵乳的體積比為9∶1～7∶3時，奶啤均表現(xiàn)為酒味重，乳香淡，香味不協(xié)調(diào)并伴有酵母味；啤酒原漿與原發(fā)酵乳的體積比在7∶3時，奶啤口感好，感官評分最高，為76分，且風(fēng)味醇厚、酸甜適中。啤酒原漿與原發(fā)酵乳的體積比為7∶3～1∶1時，奶啤均表現(xiàn)為酒味較淡，奶香較濃，偏酸且有明顯絮片。

因此，綜合考慮，啤酒原漿與原發(fā)酵乳的體積比7∶3為宜。

表4 啤酒原漿與原發(fā)酵乳的體積比對奶啤感官品質(zhì)的影響Table 4 Effect of volume ratio of raw beer slurry to raw fermented milk on sensory quality of milk beer

2.1.3 二次發(fā)酵溫度對奶啤品質(zhì)的影響

二次發(fā)酵溫度對奶啤滴定酸度、酒精度及感官品質(zhì)的影響結(jié)果分別見圖3和表5。

圖3 二次發(fā)酵溫度對奶啤酒精度和滴定酸度的影響Fig.3 Effect of secondary fermentation temperature on alcohol content and titration acidity of milk beer

由圖3可知，隨著發(fā)酵溫度在24～32℃范圍內(nèi)升高，奶啤的酒精度和滴定酸度均呈增大趨勢。發(fā)酵溫度低于28℃之前，奶啤酒精度和滴定酸度偏低；發(fā)酵溫度為28℃時，奶啤酒精度和滴定酸度分別為2.1%vol、71.7°T；發(fā)酵溫度高于28℃之后，奶啤酒精度和滴定酸度均偏高。結(jié)果表明，發(fā)酵溫度28℃時，奶啤酒精度和滴定酸度均較為適宜。

表5 二次發(fā)酵溫度對奶啤感官品質(zhì)的影響Table 5 Effect of secondary fermentation temperature on sensory quality of milk beer

由表5可知，發(fā)酵溫度低于28℃之前，奶啤口感均較為細(xì)膩、香氣較為適宜，味偏甜；發(fā)酵溫度為28℃時，殺口感適中，口感細(xì)膩、風(fēng)味協(xié)調(diào)、柔和，酸甜適中感官評分最高，為78分。發(fā)酵溫度高于28℃之后，奶啤酒味均較重，口感粗糙且風(fēng)味較差。

因此，綜合考慮，二次發(fā)酵溫度28℃為宜。

2.1.4 二次發(fā)酵時間對奶啤品質(zhì)的影響

二次發(fā)酵時間對奶啤滴定酸度、酒精度及感官品質(zhì)的影響結(jié)果分別見圖4和表6。

圖4 二次發(fā)酵時間對奶啤發(fā)酵酒精度和滴定酸度的影響Fig.4 Effect of secondary fermentation time on alcohol content and titration acidity of milk beer

由圖4可知，隨著發(fā)酵時間在8～24 h范圍內(nèi)的增加，奶啤酒精度和滴定酸度均呈增大趨勢。發(fā)酵時間＜16 h之前，奶啤酒精度和滴定酸度偏低；發(fā)酵時間為16 h時，奶啤酒精度和滴定酸度分別為2.4%vol、71.7°T；發(fā)酵時間＞16 h之后，奶啤酒精度和滴定酸度均偏高。結(jié)果表明，發(fā)酵時間為16h時，奶啤酒精度和滴定酸度均較為適宜。

表6 二次發(fā)酵時間對奶啤感官品質(zhì)的影響Table 6 Effect of secondary fermentation time on sensory quality of milk beer

由表6可知，發(fā)酵時間＜16 h之前，酵母發(fā)酵程度低，酒味淡，酸味不足；發(fā)酵時間為16 h時，所得的奶啤有較好的風(fēng)味，酒香和奶香飽滿柔和，感官評分最高，為80分；發(fā)酵時間＞16 h之后，酵母發(fā)酵程度高，酒味濃，酵母味濃，風(fēng)味不協(xié)調(diào)且味偏酸。

因此，綜合考慮，二發(fā)酵時間16 h為宜。

2.1.5 蔗糖添加量對奶啤品質(zhì)的影響

不同蔗糖的添加量對奶啤滴定酸度、酒精度及感官品質(zhì)的影響結(jié)果分別見圖5和表7。

圖5 蔗糖添加量對奶啤發(fā)酵酒精度和滴定酸度的影響Fig.5 Effect of sugar addition on alcohol content and titration acidity of milk beer

由圖5可知，隨著蔗糖添加量在6%～10%范圍內(nèi)增加，奶啤酒精度和滴定酸度基本呈增大趨勢。蔗糖添加量＜8%之前，奶啤酒精度和滴定酸度均偏低；蔗糖添加量8%時，奶啤酒精度和滴定酸度為2.1%vol、76.6°T；蔗糖添加量＞8%之后，奶啤酒精度和滴定酸度均偏高。結(jié)果表明，蔗糖添加量為8%時，奶啤酒精度和滴定酸度均較為適宜。

表7 蔗糖添加量對奶啤感官品質(zhì)的影響Table 7 Effect of sugar addition on sensory quality of milk beer

由表7可知，蔗糖添加量＜8%之前，奶啤均表現(xiàn)為香氣單淡薄，味偏酸；蔗糖添加量為8%時，奶啤酒香、乳香協(xié)調(diào)，口感細(xì)膩，酸甜適中，感官評分最高，為80分；蔗糖添加量＞8%之后，奶啤香味濃郁，味偏甜。

因此，綜合考慮，蔗糖添加量8%為宜。

2.2 奶啤發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗

以奶啤酒精度、滴定酸度和感官評分為評價指標(biāo)，以酵母接種量（A）、啤酒原漿與原發(fā)酵乳的體積比（B）、二次發(fā)酵溫度（C）和二次發(fā)酵時間（D）為主要影響因素，進(jìn)行4因素3水平L9（34）正交試驗設(shè)計，結(jié)果與分析見表8，方差分析結(jié)果見表9～表11。

由表9可知，以奶啤酒精度為評價指標(biāo)，對結(jié)果影響大小順序為B＞A＞D＞C，即啤酒原漿與原發(fā)酵乳的體積比＞酵母接種量＞二次發(fā)酵時間＞二次發(fā)酵溫度；酵母接種量、啤酒原漿與原發(fā)酵乳的體積比、二次發(fā)酵時間、二次發(fā)酵溫度差異均極顯著（P＜0.01），所以選擇A2B2C2D2作為奶啤發(fā)酵工藝的最優(yōu)組合。由表10可知，以酸度為評價指標(biāo)，對結(jié)果影響大小順序為B＞C＞D＞A，即啤酒原漿與原發(fā)酵乳體積比是奶啤酸度產(chǎn)生的主要因素，二次發(fā)酵溫度、二次發(fā)酵時間、酵母接種量對奶啤酸度的影響依次減小，接種量未對奶啤酸度產(chǎn)生顯著性影響。由表11可知，以感官評分為評價指標(biāo)，啤酒原漿與原發(fā)酵乳的體積比、二次發(fā)酵時間、二次發(fā)酵溫度差異均極顯著（P＜0.01），以A2B2C2D2最佳奶啤發(fā)酵條件組合。

表8 奶啤工藝條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 8 Results and analysis of orthogonal tests for process conditions optimization of milk beer

表9 以酒精度為評價指標(biāo)的正交試驗結(jié)果方差分析Table 9 Variance analysis of orthogonal tests results using alcohol content as evaluation index

表10 以滴定酸度為評價指標(biāo)的正交試驗結(jié)果方差分析Table 10 Variance analysis of orthogonal tests results using titration acidity as evaluation index

表11 以感官評分為評價指標(biāo)的正交試驗結(jié)果方差分析Table 11 Variance analysis of orthogonal tests results using sensory scores as evaluation index

結(jié)果表明，啤酒原漿與原發(fā)酵乳的體積比是影響奶啤發(fā)酵質(zhì)量和風(fēng)味的主要因素，奶啤以A2B2C2D2為最佳生產(chǎn)工藝條件組合，即酵母接種量5%，啤酒原漿與原發(fā)酵乳體積比7∶3，二次發(fā)酵溫度28℃，二次發(fā)酵時間16 h。在此優(yōu)化工藝條件下，酒精度為2.176%vol，酸度為81.356°T，蛋白質(zhì)含量為0.974%，可溶性固形物含量為13.4%，感官評分為89分。

3 結(jié)論

本試驗以鮮牛奶、麥芽和酒花為主要原料，從益生菌飲料養(yǎng)樂多中分離純化的干酪乳桿菌與啤酒酵母進(jìn)行二次發(fā)酵制成新型含乳飲料。通過單因素及正交試驗確定奶啤最佳生產(chǎn)工藝條件為：酵母接種量5%，啤酒原漿與原發(fā)酵乳的體積比7∶3，二次發(fā)酵溫度28℃，二次發(fā)酵時間16 h。在最佳工藝條件下制得的奶啤各項指標(biāo)分別為：酒精度2.176%vol，酸度81.356 °T，蛋白質(zhì)含量0.974%，可溶性固形物含量13.4%，感官評分為89分，酒香和乳香和諧，風(fēng)味飽滿，殺口感較適中，口感細(xì)膩、清爽，酸甜適中。