李小娟 李杰 周瑚

摘要本研究以稻曲病菌Ustilaginoidea virens黃色（非休眠）厚垣孢子、黑色（休眠）厚垣孢子、厚垣孢子萌發(fā)后產(chǎn)生的分生孢子（非休眠）3種孢子為材料，采用DNA甲基化敏感擴增多態(tài)性技術(shù)對供試材料基因組DNA進行甲基化分析，探究稻曲病菌休眠與非休眠厚垣孢子DNA甲基化的水平和模式。結(jié)果顯示，3種形態(tài)孢子的基因組DNA甲基化水平差異明顯，分生孢子基因組DNA中CCGG序列的總甲基化率為20.56%，黑色休眠厚垣孢子為25.63%，黃色非休眠厚垣孢子為33.52%。黃色和黑色的厚垣孢子主要是全甲基化模式，其全甲基化率高于半甲基化率，其中黃色厚垣孢子全甲基化率高達17.68%;分生孢子則是以半甲基化模式為主。結(jié)果對揭示稻曲病菌厚垣孢子休眠的分子機制，探究真核生物孢子的分子休眠機制有普遍意義。

關(guān)鍵詞稻曲病菌;厚垣孢子;分生孢子;DNA甲基化;甲基化敏感擴增多態(tài)性

中圖分類號：S 435.111

文獻標識碼：A

DOI：10.16688/j.zwbh.2017475

稻曲病是由稻綠核菌Ustilaginoidea virens （Cooke） Takahashi[有性態(tài)為Villosiclava virens （Nakata） E.Tanaka & C.Tanaka，異名Claviceps oryzaesativae Hashioka] 侵染引起的水稻穗部病害[1]。該病在亞洲、美洲和非洲的30多個國家及我國各稻區(qū)都有不同程度發(fā)生。一般穗發(fā)病率為4%～6%，嚴重達50%以上。它不僅使秕谷率、青米率、碎米率增加;而且當(dāng)?shù)竟戎泻?.5%病粒時能引起人畜中毒癥狀[17]。該病在我國無論是從發(fā)生面積，還是從引起的產(chǎn)量損失上看，都已成為水稻尤其是雜交稻最重要的病害之一[2， 4]。

在稻曲病發(fā)展過程中，稻曲球中的厚垣孢子在發(fā)育過程中存在顏色轉(zhuǎn)變，即從最初乳白色至黃色再到墨綠色（亦稱之黑色），黃色厚垣孢子的萌發(fā)率可高達80%以上。隨著厚垣孢子顏色變深，萌發(fā)率下降，當(dāng)變成黑色厚垣孢子就很難萌發(fā)或不能萌發(fā)[89]。這種由非休眠（黃色）至休眠（黑色）狀態(tài)的轉(zhuǎn)變對厚垣孢子度過不良環(huán)境和宿主缺乏期 （在植物病理學(xué)上的越冬或越夏） 有重要的生物學(xué)意義。厚垣孢子在稻曲病的侵染循環(huán)中起重要作用，是稻曲病的主要初侵染源[812]。

DNA甲基化是一種常見的表觀遺傳修飾。它是指由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTase）介導(dǎo)，在胞嘧啶的第5位碳原子上加上1個甲基基團，使之變成5甲基胞嘧啶（5mC）的化學(xué)修飾過程。在各種疾病的致病機制中，甲基化模式異常這一因素所起的作用各不相同。在真核生物中通常DNA的甲基化會抑制基因表達。DNA的甲基化狀態(tài)對染色體的結(jié)構(gòu)維持、X染色體失活、基因印記及胚胎發(fā)育、正常細胞功能的維持，組織特異性基因的表達和轉(zhuǎn)座子沉默，乃至疾病的發(fā)生十分重要[1314]。

關(guān)于真菌DNA甲基化研究，早在1983年Tamame等[15]利用5氮雜胞苷（5azacytidine）對Aspergillus niger和A.nidulans的菌絲進行誘變，研究其野生型和誘變型菌絲DNA甲基化，結(jié)果顯示，它們在DNA甲基化方面沒有差異。隨后，1984年Antequera等[16]對涵蓋5個科的20個種（包含壺菌、卵菌、接合菌、子囊菌、擔(dān)子菌和半知菌）進行了DNA甲基化檢測，其中18個種DNA甲基化率≤0.1%，而Sporotrichum dimorphosporum和 Phycomyces blakesleeanus的DNA甲基化率則分別約為0.2%和0.5%。研究表明，真菌中存在DNMTase和甲基化區(qū)域[1719]。對模型真菌子囊菌粗糙脈孢菌Neurospora crassa的研究顯示，真菌DNA甲基化是一種特定的基因組防御，因經(jīng)過重復(fù)誘導(dǎo)點突變沒有發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)基因、沉默轉(zhuǎn)座因子和重復(fù)的DNA序列[2021]。在稻瘟病菌Magnaporthe oryzae中存在DNA甲基化，反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子MAGGY對反轉(zhuǎn)錄的限制作用與DNA甲基化沒有相關(guān)性[22]。不同的M.oryzae單孢其甲基化也有差異，缺失MoDMT1的突變體菌株與正常菌株的生長無差異[23]，但DNA甲基化在全基因組分布和對真菌的生活周期的意義是未知的。Jeon等[24]分析了M.oryzae的DNA甲基化，表明DNA甲基化有助于真菌的生長發(fā)育和基因組防御。

本研究以稻曲病的黃色、黑色厚垣孢子和厚垣孢子萌發(fā)后產(chǎn)生的分生孢子為材料，采用甲基化敏感擴增多態(tài)（methylation sensitive amplification polymorphism，MSAP）技術(shù)對供試材料的基因組DNA進行甲基化分析，旨在探究稻曲病菌休眠與非休眠厚垣孢子DNA甲基化的水平和模式，這有利于揭示稻曲病菌厚垣孢子休眠分子機制，對探究真核生物分子休眠機制具有一定的理論價值。

1材料與方法

1.1供試病菌

從高感稻曲病水稻品種‘紅蓮優(yōu)6號采集病粒稻曲球，分離稻曲病菌的單孢，用燕麥培養(yǎng)基（燕麥片30 g，瓊脂20 g，水加至1 000 mL）培養(yǎng)。并用PS培養(yǎng)液（馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，水1 000 mL）在水平搖床上26℃黑暗條件下130 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)獲得分生孢子。在無菌環(huán)境下將分生孢子懸浮液與搗碎的菌絲片段混勻，孢子濃度調(diào)至4×105個/mL并接種到水稻品種‘紅蓮優(yōu)6號上，發(fā)病后收集黃色、黑色的稻曲病菌厚垣孢子。將獲得的孢子保存于-80℃冰箱備用。

1.2供試試劑

基因組DNA提取試劑盒，OMG公司。EcoRⅠ、MspⅠ、Hpa Ⅱ、10×Buffer T等，紐英倫生物技術(shù)（北京）有限公司。基因組DNA接頭的連接試劑（T4 DNA Ligase，基因組DNA的預(yù)擴增和選擇性擴增試劑）等，北京全式金生物技術(shù)有限公司;電泳及銀染試劑為國產(chǎn);EcoRⅠ接頭、HpaⅡ-MspⅠ接頭、擴增引物等，生工生物工程（上海）股份有限公司。引物及接頭序列見表1。

1.3基因組DNA的提取

采用基因組DNA提取試劑盒分別提取稻曲病菌的分生孢子、黃色和黑色厚垣孢子基因組DNA，具體操作步驟參照試劑盒上的說明。并用核酸分析儀測定260 nm、280 nm時的吸光度，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量。

1.4基因組DNA的甲基化MSAP體系建立

1.4.1基因組DNA的雙酶切

分別使用限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ/Hpa Ⅱ和EcoR Ⅰ/Msp Ⅰ對 DNA 進行雙酶切。將提取的DNA （500 ng） 5.0 μL，EcoRⅠ（20 U/μL）0.5 μL，MspⅠ（或HpaⅡ）（20 U/μL）0.5 μL，10×Buffer T 2.5 μL，加水至25 μL，混勻后于低溫恒溫水浴槽37℃酶切保溫12 h，65℃溫育20 min，4℃保存。

1.4.2基因組DNA接頭的準備與連接

將EcoRⅠ接頭引物分別配成15 μmol/L 的保存液，混合稀釋成5 μmol/L;HpaⅡMspⅠ接頭引物分別配成100 μmol/L的保存液，混合配成50 μmol/L?；旌暇鶆蚝笾糜赑CR儀：65℃ 10 min;37℃ 10 min;25℃ 10 min，然后自然冷卻至室溫。將酶切產(chǎn)物8.5 μL，T4 DNA Ligase 1.0 μL，5×T4 DNA Ligase Buffer 4.0 μL，EcoR Ⅰadapter （5 μmol/L） 2.0 μL，Hpa ⅡMsp Ⅰadapter （50 μmol/L）2.0 μL，補水至20 μL，混勻后于低溫恒溫水浴槽16℃培養(yǎng)過夜，70℃滅活10 min，-20℃保存。

1.4.3基因組DNA的預(yù)擴增

預(yù)擴增總體積25 μL，包括連接產(chǎn)物2.0 μL，10×Trans Tap HiFi Buffer 2.5 μL，Trans Tap HiFi DNA Polymerase 0.5 μL，GC Enhancer 0.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL，10 μmol/L預(yù)擴增上下游引物各1.0 μL。擴增程序為：94℃ 30 s，56℃ 1 min，72℃ 1 min，30個循環(huán);72℃ 10 min。

1.4.4基因組DNA的選擇性擴增

預(yù)擴增產(chǎn)物20倍稀釋液5.0 μL，10×Trans Tap HiFi Buffer 2.5 μL，Trans Tap HiFi DNA Polymerase 0.5 μL，GC Enhancer 0.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL，10 μmol/L選擇性上下游引物各15 μL，總體積25 μL。擴增程序為：94℃ 30 s，65℃（每個循環(huán)降低0.7℃）30 min，72℃ 1 min，13個循環(huán);94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，23個循環(huán);72℃ 10 min。

1.4.56%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

將選擇性擴增產(chǎn)物進行6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。采用美國BIORAD 公司的PowerPac HV電泳儀，恒定電壓1 800 V進行預(yù)電泳30 min，使凝膠預(yù)熱。然后上樣，1 200 V電泳2.0～2.5 h，待二甲苯青移動至整個凝膠的2/3處時，停止電泳，取出凝膠，銀染顯色。

1.5數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計顯影后的聚丙烯酰胺凝膠電泳條帶，將清晰條帶顯示記為“1”，無條帶顯示處記為“0”，記錄所有適宜選擴增引物組合的MSAP圖譜，組成二次元矩陣， 進行甲基化多態(tài)性統(tǒng)計[25]。

2結(jié)果與分析

2.1基因組DNA的選擇性擴增

甲基化敏感擴增多態(tài)性（MSAP）中使用的內(nèi)切酶MspⅠ和HpaⅡ是一組同裂酶，都識別并切割5′CCGG3′序列，但在5′CCGG3′存在甲基化時，兩種酶對該序列不同甲基化狀態(tài)的敏感度不同。MspⅠ只能切割外部胞嘧啶沒有發(fā)生甲基化的5′CCGG3′序列，一旦外部胞嘧啶發(fā)生甲基化，將不能切割此位點。HpaⅡ?qū)Π爰谆▎捂溂谆┟舾?，對全甲基化（雙鏈甲基化）不敏感，只切割半甲基化的5′CCGG3′序列。

因此，聚丙烯酰胺凝膠電泳獲得的條帶可分為4種類型：Ⅰ型，兩條泳道均有帶，表示無甲基化或單鏈內(nèi)部發(fā)生甲基化;Ⅱ型，MspⅠ酶切產(chǎn)物擴增泳道有帶，HpaⅡ酶切產(chǎn)物擴增泳道無帶，表示發(fā)生雙鏈內(nèi)部甲基化;Ⅲ型，HpaⅡ酶切產(chǎn)物擴增泳道有帶，MspⅠ酶切產(chǎn)物擴增泳道無帶，表示發(fā)生單鏈外部甲基化;Ⅳ型，不存在CCGG位點，或內(nèi)側(cè)和外側(cè)胞嘧啶同時甲基化（圖1）。據(jù)報道[2627]，第四種甲基化類型的頻率很低，因此我們得到的甲基化水平可能只比實際的低一些。

2.2基因組DNA甲基化水平和模式

EcoR Ⅰ選擇性擴增引物分別與Msp Ⅰ、Hpa Ⅱ選擇性擴增引物配對，從120對MSAP選擇性擴增引物中篩選出28對擴增圖譜清晰、甲基化多態(tài)性豐富、條帶重復(fù)性好的選擇性擴增引物組合。采用2.1的帶型統(tǒng)計方法記錄PAGE膠上的擴增條帶，結(jié)果如表2所示。

根據(jù)對稻曲病菌的分生孢子、黑色和黃色厚垣孢子基因組DNA進行MSAP分析，可以看出分生孢子基因組DNA中CCGG序列的甲基化率為20.56%，黑色厚垣孢子為25.63%，黃色厚垣孢子為33.52%。其中分生孢子DNA的甲基化率最低，黃色厚垣孢子DNA的甲基化率最高。

在分生孢子、黑色和黃色厚垣孢子DNA的擴增條帶中，全甲基化條帶數(shù)分別為135、116、154條，全甲基化率分別為8.73%、13.96%、17.68%，分生孢子全甲基化率低于半甲基化率，黑色和黃色厚垣孢子的全甲基化率均高于半甲基化率。從統(tǒng)計結(jié)果看出DNA甲基化在稻曲病菌休眠與非休眠厚垣孢子中發(fā)生普遍，在稻曲病菌分生孢子和厚垣孢子之間，基因組DNA甲基化水平差異明顯，黃色和黑色的厚垣孢子主要是全甲基化模式，分生孢子則是以半甲基化模式為主。

3討論

MSAP （甲基化敏感擴增多態(tài)性） 技術(shù)是檢測基因組DNA甲基化的重要方法之一，它是在AFLP技術(shù)的基礎(chǔ)上，根據(jù)MspⅠ和HpaⅡ?qū)谆舾行缘牟煌瑏韰^(qū)分基因組DNA全甲基化和半甲基化狀態(tài)，同時可以測出其總甲基化水平[28]。

稻曲病菌引起水稻穗粒發(fā)病，在穗粒上形成稻曲球，稻曲球中的孢子座產(chǎn)生粉狀厚垣孢子，厚垣孢子在發(fā)育過程中其顏色會發(fā)生變化，由乳白色逐漸變成黃色，最終成為墨綠色（黑色），即厚垣孢子由非休眠狀態(tài)轉(zhuǎn)化成休眠狀態(tài)，這種現(xiàn)象屬于表觀遺傳特征。厚垣孢子在非休眠和休眠的轉(zhuǎn)換中，其表觀遺傳上有明顯差異，這種差異與DNA甲基化相關(guān)。本研究采用MSAP技術(shù)，以稻曲病菌的分生孢子及兩種顏色的厚垣孢子為材料，初次對稻曲病菌分生孢子、休眠與非休眠厚垣孢子的基因組DNA甲基化水平和模式進行研究，結(jié)果顯示，稻曲病菌分生孢子、黑色和黃色厚垣孢子DNA甲基化水平差異明顯，休眠的黑色厚垣孢子的甲基化要低于非休眠的黃色厚垣孢子。這個結(jié)論與種子萌發(fā)甲基化水平變化是相似的，黃韞宇等[29]用NaCl處理黃瓜種子，發(fā)現(xiàn)黃瓜種子在萌發(fā)過程中甲基化水平是不斷變化的，前期甲基化水平略高，中后期甲基化水平降低，發(fā)芽末期甲基化水平更低，與Mishra等[30]報道的比較一致， Candida albicans 是人類真菌性病原物，其DNA甲基化調(diào)控影響的基因通常與形態(tài)轉(zhuǎn)化，如酵母態(tài)與菌絲態(tài)形態(tài)轉(zhuǎn)換、白色細胞與非透明細胞的轉(zhuǎn)化，以及鐵離子代謝相關(guān)的基因有關(guān)。C. albicans在無性生長期間，被壓制轉(zhuǎn)錄甲基化位點中C轉(zhuǎn)換成T 的頻率提高，一個進化上穩(wěn)定的抑制突變的模式可能會因為環(huán)境或寄主變化而發(fā)生遺傳改變。稻曲病菌的3種不同發(fā)育時期的孢子的DNA甲基化調(diào)控的基因可能影響其萌發(fā)，利用MSAP方法獲得稻曲病菌3種孢子的甲基化差異性位點的DNA片段，通過克隆測序可獲得相應(yīng)的基因的重要信息，從而可找到甲基化差異基因的表達與休眠的相關(guān)性。另外，通過分析甲基化位點，發(fā)現(xiàn)全甲基化，即雙鏈甲基化是稻曲病菌休眠與非休眠基因組DNA甲基化的主要模式，分生孢子DNA則表現(xiàn)為全甲基化率低于半甲基化率，以半甲基化為主要模式;黑色和黃色厚垣孢子的全甲基化率均高于半甲基化率。此結(jié)論與種子萌發(fā)中，大量基因上調(diào)表達相一致，且種子萌發(fā)過程中同時還發(fā)現(xiàn)少量的甲基化事件，說明部分功能基因處于關(guān)閉或正在關(guān)閉的調(diào)控狀態(tài)[3134]。稻曲病菌由可萌發(fā)的黃色厚垣孢子到不可萌發(fā)的黑色厚垣孢子，由厚垣孢子到萌發(fā)后的分生孢子之間的胞嘧啶甲基化率降低、甲基化模式改變，其分子機理有待進一步研究和驗證。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）