黃偉華 顏梅新

摘要 [目的]對(duì)廣西賀州市荸薺種植區(qū)感染稈枯病的荸薺樣本進(jìn)行病原分離鑒定及分析病原菌的侵染過程，為荸薺稈枯病的有效防治提供參考。[方法]以常規(guī)組織分離法對(duì)發(fā)病明顯的荸薺莖稈組織進(jìn)行分離，采用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定。通過制備分生孢子懸浮液接種于載玻片上培養(yǎng)，測定分生孢子萌發(fā)情況。利用病菌孢子懸浮液對(duì)荸薺莖稈進(jìn)行離體接種，檢測病菌的侵染過程。[結(jié)果]分離獲得1株病原分離物（Ceh），經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定該病原為荸薺柱盤孢菌（Cylindrosporium eleocharidis Lentz）。病菌分生孢子接種于載玻片后4 h開始萌發(fā)，8 h后大量萌發(fā)，12 h后形成大量附著孢，菌絲24 h后形成。病菌接種荸薺莖稈4 h后，分生孢子開始萌發(fā)并產(chǎn)生芽管;8 ～12 h芽管伸長，形成附著孢侵入荸薺莖稈表皮組織;24 h至7 d菌絲形成;接種8 d后，病菌在莖稈表面形成分生孢子盤。[結(jié)論]引起廣西賀州市荸薺種植區(qū)荸薺稈枯病病原為荸薺柱盤孢菌（Cylindrosporium eleocharidis Lentz）。荸薺稈枯病菌分生孢子萌發(fā)和侵染過程可用于病原菌和寄主互作機(jī)理研究。

關(guān)鍵詞 荸薺;稈枯病;Cylindrosporium eleocharidis;孢子萌發(fā);侵染過程

中圖分類號(hào) S436.45 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2020）03-0143-03

Abstract [Objective] Pathogen causing stem blight of Chinese water chestnut in Hezhou production zone in Guangxi was identified and infection process of casual organism was analyzed to provide scientific references for protection of Chinese water chestnut planting. [Method] Isolation of pathogen was carried out from the diseased tissues of stem of Chinese water chestnut， and identification of isolate was performed by morphological characteristics. Conidia suspension was prepared to inoculate on slides to test conidia germination and to inoculate on stem of Chinese water chestnut in vitro to analyze infection process of pathogen， respectively. [Result] One isolate strain named Ceh was obtained and identified as Cylindrosporium eleocharidis Lentz with its morphological characteristics. The conidia started to germinate after 4 h incubation and reached the peak of germination at 8 h incubation， whereas a large number of appressoria were formed after 12 h incubation. Hyphae development was observed after 24 h incubation. The conidia began to germinate after 4 h inoculation and produced germ tubes on stem. The germinal tubes could invade any tissues on the epidermis of the stem and form appressoria after 8 h to 12 h inoculation. Hyphae was formed to infected the host cells within 7 days and acervuli were developed on the stem surface after 8 days inoculation.[Conclusion] Stem blight of Chinese water chestnut was regard as causing by Cylindrosporium eleocharidis in Hezhou Chinese water chestnut growing area in Guangxi. Analysis of conidia germination and infection process of casual organism could be used for the study interaction between pathogen and host.

Key words Chinese water chestnut;Stem blight;Cylindrosporium eleocharidis;Conidia germination;Infection process

荸薺（Eleocharis dulcis）為莎草科（Cyperaceae）荸薺屬（Eleocharis）多年生草本植物，原產(chǎn)于我國和印度，在我國有2 000多年的栽培歷史。目前，荸薺主要栽培于我國長江流域及其以南各省，廣西則以桂林、賀州等地區(qū)廣泛種植;美國、菲律賓、越南、澳大利亞、日本等國亦有栽培[1-2]。荸薺球莖營養(yǎng)豐富，富含碳水化合物，可作為水果、蔬菜食用，亦具有藥用價(jià)值 [3-4]。然而荸薺在栽培過程中常受病害侵?jǐn)_，其中以稈枯?。ㄋ追Q“荸薺瘟”）發(fā)生最為嚴(yán)重。該病病原為荸薺柱盤孢菌（Cylindrosporium eleocharidis Lentz），屬半知菌類黑盤孢目柱盤孢屬。該病主要危害葉鞘、葉狀莖、花器等部位，嚴(yán)重影響荸薺的產(chǎn)量和品質(zhì)[5-7]。近年來筆者在廣西賀州荸薺產(chǎn)區(qū)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，每年9—10 月是該地區(qū)荸薺稈枯病流行的季節(jié)，荸薺稈枯病已成為賀州荸薺產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要障礙之一。當(dāng)前關(guān)于荸薺稈枯病的研究較少，荸薺稈枯病于1962年在美國首次報(bào)道[8]。我國則于1985年在江蘇省報(bào)道荸薺稈枯病的發(fā)生[9]。隨后，廣西報(bào)道了荸薺稈枯病的發(fā)生與危害[10] 。通過對(duì)該病流行情況的分析，發(fā)現(xiàn)荸薺稈枯病的發(fā)生和流行與氣溫、濕度、降雨量、露水等環(huán)境因素密切相關(guān)，賴傳雅等[5]建立了預(yù)測模型（D=5.554 7-0.031X1+0049X2+0.523 3X3-0.348 7X4）。近年來，潘麗等[7]報(bào)道湖北省荸薺遭到稈枯病的危害，并對(duì)該病病原及生物學(xué)特性進(jìn)行了研究。

賀州作為荸薺的主產(chǎn)區(qū)之一，未見關(guān)于荸薺稈枯病病原鑒定的報(bào)道。因此，為明確廣西賀州荸薺稈枯病病原分類地位和病原菌的侵染過程，筆者對(duì)賀州市荸薺種植區(qū)感染稈枯病的荸薺進(jìn)行病原分離鑒定及分析病原菌的侵染過程，以期為有效防治荸薺稈枯病和研究病原菌與寄主互作提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

荸薺稈枯病樣本于2016 年8月采集于廣西賀州市荸薺栽培區(qū)。

1.2 方法

1.2.1 荸薺稈枯病病原菌分離。

病原菌分離采用常規(guī)的組織分離法[11]。從病健交界處切取5 mm×5 mm的小塊，經(jīng)表面消毒（ 75%乙醇10 s，0.1%升汞1 min，無菌水沖洗2～3 次）后移入馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)5 d，待菌絲在平板上長出后，挑取菌落邊緣單菌絲的尖端移入不加抗生素的PDA 培養(yǎng)基上進(jìn)行純化，將純化后的菌株移至 PDA 斜面上，放入4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病原菌的致病性測定。

致病力測定參照趙玳琳等[12]的方法，稍作修改。選取健康、大小一致的荸薺莖稈，經(jīng)75%乙醇表面消毒后剪取莖稈約20 cm長，放置于鋪有濕潤吸水紙的塘瓷盤中，荸薺莖稈兩端采用濕潤的吸水紙覆蓋保濕。用直徑6 mm的打孔器在PDA平板上培養(yǎng)7 d的病菌菌落邊緣打孔，提取菌絲塊接種至針刺過的莖稈上，無菌培養(yǎng)基塊接種設(shè)為對(duì)照，蓋上蓋子，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每個(gè)處理各5根莖稈，每根莖稈設(shè)2個(gè)接種點(diǎn)。7 d 后觀察發(fā)病情況。對(duì)接種發(fā)病的荸薺莖稈組織進(jìn)行病原菌再分離，觀察分離物是否與接種菌株一致。

1.2.3 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定。

將分離純化獲得的菌株在PDA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)5 d后，切取菌落邊緣的菌絲塊移至PDA培養(yǎng)基中央，放置生化培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)15 d，觀察菌落形態(tài)，通過光學(xué)顯微鏡（carl zeiss）觀察菌株的菌絲、分生孢子、分生孢子盤等形態(tài)特征。病原菌的鑒定根據(jù)病害癥狀、病菌菌落形態(tài)、分生孢子、分生孢子梗及分生孢子盤形態(tài)，參照魏景超[13]對(duì)柱盤孢屬和Lentz[8]、李清銑等[9]、賴傳雅等[10]、潘麗等[7]對(duì)荸薺柱盤孢菌的形態(tài)特征描述進(jìn)行病原鑒定。

1.2.4 病原菌分生孢子萌發(fā)。

病菌在PDA平板上培養(yǎng)15 d后，吸取5 mL無菌水滴在PDA平板上的菌落表面，用無菌接種環(huán)刮取菌絲，采用2層擦鏡紙過濾菌絲獲得分生孢子懸浮液，用血球計(jì)數(shù)板將分生孢子懸浮液濃度調(diào)至107 個(gè)/mL，然后吸取分生孢子懸浮液滴至載玻片上，蓋上蓋玻片，將其放入鋪有吸水紙的9 cm培養(yǎng)皿中，蓋上皿蓋子，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)，接種后分別于4、8、12和24 h在光學(xué)顯微鏡下觀察分生孢子萌發(fā)情況。

1.2.5 病原菌侵染過程。

病菌孢子懸浮液配制同“1.2.4”。選取健康的荸薺莖稈，經(jīng)75%乙醇表面消毒后剪取莖稈約20 cm長，放置于鋪有濕潤吸水紙的塘瓷盤中，荸薺莖稈兩端采用濕潤的吸水紙覆蓋保濕。將上述配好的濃度為107 個(gè)/mL 孢子懸浮液接種至荸薺莖稈表面上，無菌水接種設(shè)為對(duì)照，蓋上皿蓋子，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)，接種后分別于4 h、8 h、12 h、24 h、2～8 d剪取接種部位，制成玻片在光學(xué)顯微鏡下觀察病菌侵染情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀

荸薺稈枯病主要危害莖稈，初為暗綠色不規(guī)則水漬狀斑，后擴(kuò)展形成棱形或橢圓形至不規(guī)則暗綠色斑，病莖變軟凹陷，其上產(chǎn)生小黑點(diǎn)，之后愈合形成較大的病斑，重者整株枯死、倒伏（圖1A）。

2.2 病原菌的形態(tài)特征

從表現(xiàn)明顯癥狀的荸薺莖稈組織分離純化獲得1菌株，命名為Ceh。在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，菌落中間為墨綠色，氣生菌絲絨毛狀，菌落邊緣整齊。15 d后開始產(chǎn)孢，分生孢子無色，線形，無分隔，中間稍寬，基部稍鈍圓，直，向一側(cè)或不規(guī)則彎曲，分生孢子大小為36.0～107.32 μm×3.34～8.86 μm（圖1D）;分生孢子梗無色或淺褐色，叢生，瓶形、梨形或窄卵形，無分隔，大小為6.78～28.25 μm×3.25～9.25 μm。經(jīng)致病性試驗(yàn)，所引起的癥狀與原癥狀相似（圖1B），從接種發(fā)病的組織處再分離獲得的分離物與田間發(fā)病組織分離的病原菌形態(tài)一致。根據(jù)病菌的培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征，參照魏景超[13]的分類方法和Lentz[8]、李清銑等[9]、賴傳雅等[10]、潘麗等[7]對(duì)荸薺柱盤孢菌的特征描述，將菌株Ceh鑒定為荸薺柱盤孢菌（Cylindrosporium eleocharidis Lentz）。

2.3 荸薺稈枯病菌孢子萌發(fā)

荸薺稈枯病菌分生孢子懸浮液接種至蓋玻片上4 h后開始萌發(fā)，分生孢子兩端形成1個(gè)或2個(gè)芽管，無附著孢產(chǎn)生（圖2A）;接種8 h后分生孢子大量萌發(fā)，芽管伸長，產(chǎn)生圓形或橢圓形附著孢（圖2B）;接種12 h產(chǎn)生大量附著孢，顏色為深褐色或黑色（圖2C）;24 h后菌絲形成（圖2D）。

2.4 荸薺稈枯病菌侵染寄主的過程

荸薺稈枯病菌分生孢子在接種至荸薺莖稈表面4 h后分生孢子開始萌發(fā)，芽管形成（圖3A）;接種8～12 h芽管伸長，侵入荸薺莖稈表皮組織，然后在莖稈表面形成深褐色附著孢（圖3B，箭頭所示）;24 h（l d）～7 d后，病菌菌絲形成，侵入寄主組織細(xì)胞并在細(xì)胞間蔓延（圖3C、D，箭頭所示）;接種8 d后分生孢子盤和大分生孢子出現(xiàn)（圖3E）;接種20 d后，菌絲和分生孢子消融，分生孢子盤與寄主組織形成病殘?bào)w（圖3F）。

3 討論

荸薺稈枯病是我國荸薺最重要的病害之一，嚴(yán)重影響荸薺的產(chǎn)量和品質(zhì)[7-10]。近年來，有報(bào)道稱Phoma bellidis也可導(dǎo)致荸薺莖稈枯萎，其所致癥狀與C.eleocharidis引起的癥狀稍有不同，該病在湖北零星發(fā)生，是一種新病害[14]。參照魏景超[13]的分類方法和Lentz[8]、李清銑等[9]、賴傳雅等[10]、潘麗等[7]對(duì)荸薺柱盤孢菌的特征描述，確定了賀州地區(qū)荸薺稈枯病病原菌為荸薺柱盤孢菌（Cylindrosporium eleocharidis Lentz）。該研究分離獲得菌株Ceh的分生孢子梗和分生孢子的大小與賴傳雅等[10]分離的菌株接近，可能是因?yàn)檫@兩者均來自廣西荸薺種植區(qū)。另外，筆者試圖通過其DNA序列分析（數(shù)據(jù)未顯示）對(duì)荸薺稈枯病菌進(jìn)行鑒定。然而，ITS序列分析表明，該菌序列與GenBank中炭疽菌屬分離物核苷酸序列相似性為94%～96%，但兩者在形態(tài)特征上存在明顯差異，可能是因?yàn)樵谑澜绶秶鷥?nèi)荸薺稈枯病菌的研究較少。

C.eleocharidis接種載玻片4 h后，分生孢子開始萌發(fā)，8 h后達(dá)到萌發(fā)高峰，12 h后形成大量的附著孢。在真菌膠孢炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）[15]中也獲得類似的結(jié)果。C.eleocharidis分生孢子接種荸薺莖稈4 h后開始萌發(fā)，在莖稈表面上產(chǎn)生芽管。接種8～12 h后，芽管可從荸薺莖稈表皮任何組織侵入，形成附著孢。7 d內(nèi)形成菌絲，侵染宿主細(xì)胞，接種8 d后在莖面上形成分生孢子盤。這些研究結(jié)果與對(duì)稻瘟病（magnaporthe oryzae）[16]和膠孢炭疽病菌（Colletrichum gloeosporioides）[17]孢子萌發(fā)和侵染過程相似。

近幾年來，隨著荸養(yǎng)種植面積的擴(kuò)大和連作，荸薺種莖的頻繁調(diào)運(yùn)，荸薺稈枯病日趨嚴(yán)重。由于該病的致病機(jī)理尚不清楚，對(duì)現(xiàn)有技術(shù)仍遠(yuǎn)不能達(dá)到有效地遏制該病蔓延和傳播的要求。因此，從不同角度、以不同方法去研究和發(fā)展新的控制該病的技術(shù)十分必要，未來的研究工作將建立荸薺稈枯病菌遺傳轉(zhuǎn)化體系，研究該病原菌的致病機(jī)理，為該病害新的防治技術(shù)提供靶標(biāo)基因。

4 結(jié)論

引起廣西賀州市荸薺種植區(qū)荸薺稈枯病病原為荸薺柱盤孢菌（Cylindrosporium eleocharidis Lentz）。荸薺稈枯病菌分生孢子萌發(fā)和侵染過程的研究可用于病原菌和寄主互作機(jī)理研究，為荸薺稈枯病菌的防治提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] 顏梅新，袁高慶，陳世偉，等.荸薺貯藏期真菌性病害種類調(diào)查鑒定初報(bào)[J].廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué)，2003，22（2）：96-99.

[2] 李峰，柯衛(wèi)東，劉義滿.荸薺研究進(jìn)展[J].長江蔬菜，2006（8）：39-43.

[3] PARKER M L，WALDRON K W.Texture of Chinese water chestnut：Involvement of cell wall phenolics[J].Journal of the science of food & agriculture，1995，68（3）：337-346.

[4] GRASSBY T，JAY A J，MERALI Z，et al.Compositional analysis of Chinese water chestnut（Eleocharis dulcis）cellwall material from parenchyma，epidermis，and subepidermal tissues[J].Journal of agricultural and food chemistry，2013，61（40）：9680-9688.

[5] 賴傳雅，梁鈞.環(huán)境因素對(duì)荸薺稈枯病流行動(dòng)態(tài)的影響[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2000，13（3）：54-57.

[6] 顏梅新，袁高慶，賴傳雅，等.荸薺稈枯病的發(fā)生及其防治研究[J].廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，37（3）：273-276.

[7] 潘麗，朱志賢，呂茹婧，等.荸薺稈枯病菌生物學(xué)特性研究[J].長江蔬菜，2011（16）：75-79.

[8] LENTZ P L.New records of fungi on Chinese waterchestnut[J].American midland naturalist，1962，67（1）：184-193.

[9] 李清銑，王連榮.江蘇荸薺稈枯病的發(fā)生、危害及病原菌鑒定[J].江蘇農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，1985，6（4）：37-39.

[10] 賴傳雅，梁鈞，白志良，等.荸薺稈枯病病原菌研究[J].廣西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1996，15（2）：93-97.

[11] 方中達(dá).植病研究方法[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998.

[12] 趙玳琳，陳威，黃俊斌，等.荸薺莖點(diǎn)霉稈枯病菌侵染過程的超微觀察[J].植物病理學(xué)報(bào)，2016，46（6）：841-845.

[13] 魏景超.真菌鑒定手冊(cè)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1979.

[14] LV R J，ZHENG L，ZHU Z X，et al.First report of stem blight of Eleocharis dulcis caused by Phoma bellidis in China[J].Plant disease，2011，95（9）：1190.

[15] 黃麟，楊濟(jì)云，方玉蘭，等.杉木炭疽菌遺傳轉(zhuǎn)化及附著胞發(fā)育過程的細(xì)胞核行為觀察[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2017，41（6）：68-72.

[16] 許有嬪，廖海澄，陳金華，等.利用綠色熒光蛋白GFP研究稻瘟病菌與水稻的互作[J].植物保護(hù)，2017，43（6）：53-61.

[17] 張曉林，張俊娥，賀璞慧中，等.膠孢炭疽菌侵染楊樹葉片的組織病理學(xué)研究[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2018，40（3）：101-109.