3-蒈烯對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌活性及機(jī)理初探

劉雪 何英蘭 胡月英 陳衛(wèi)軍 陳海明

摘? 要? 為了開(kāi)發(fā)一種新的食品防腐保鮮劑，本文初步研究了3-蒈烯對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌活性及機(jī)理。通過(guò)肉湯稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC），評(píng)價(jià)了3-蒈烯的抑菌活性，考察了3-蒈烯對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞膜通透性、膜電位及呼吸鏈脫氫酶等的影響。結(jié)果表明：3-蒈烯對(duì)銅綠假單胞菌的MIC為20 mL/L，MBC為40 mL/L。3-蒈烯可以抑制銅綠假單胞菌的生長(zhǎng)，破壞細(xì)胞的正常形態(tài)，提高細(xì)胞膜的通透性，造成蛋白質(zhì)、電解質(zhì)的外泄。3-蒈烯能夠降低銅綠假單胞菌菌體的膜電位，干擾細(xì)胞正常代謝活動(dòng)，還能抑制細(xì)胞內(nèi)呼吸鏈脫氫酶的活性。綜上所述，3-蒈烯通過(guò)破壞銅綠假單胞菌細(xì)胞膜，抑制細(xì)菌正常生長(zhǎng)，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞死亡。

關(guān)鍵詞? 3-蒈烯;銅綠假單胞菌;抑菌活性;抑菌機(jī)理;細(xì)胞膜

中圖分類號(hào)? TS205.9? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A

近年來(lái)，隨著社會(huì)的發(fā)展和生活水平的提高，食品安全開(kāi)始受到人們廣泛的關(guān)注。食源性疾病是中國(guó)食品安全的頭號(hào)問(wèn)題，也是世界重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題，致病微生物的污染是造成食源性疾病的主要原因[1-2]。銅綠假單胞菌，又名綠膿桿菌，食源性致病菌之一，革蘭氏陰性屬，主要存在于肉制品和飲用水中，能產(chǎn)生外毒素、腸毒素等，容易造成食品腐敗污染，危害人們身體健康，很多城市已經(jīng)對(duì)其開(kāi)展監(jiān)測(cè)[3]。

目前，為了減少食源性疾病的發(fā)生，延長(zhǎng)食品貨架期，防腐劑被廣泛使用。精油作為一種植物源天然防腐劑，可以從多種芳香植物中提取，主要由萜類、倍半萜類化合物等組成[4]。已有大量報(bào)道證明，精油具有良好的抑菌活性，但是具體是哪種成分主要發(fā)揮作用，還鮮有研究[5-6]。

3-蒈烯是許多植物精油的主要揮發(fā)性成分，包括松節(jié)油、胡椒油、當(dāng)歸油等。分子式為C10H16，是一種單萜烯，呈無(wú)色液體狀態(tài)[7]。由于3-蒈烯本身的松木樣香氣，在食用香精中有廣泛應(yīng)用，《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760-2014）中規(guī)定3-蒈烯為允許使用的食品用合成香料[8]。此外，3-蒈烯可用于農(nóng)藥、藥物和化妝品，還是增塑劑等化學(xué)品中重要的原料之一[7]。吳桂蘋(píng)等[9]通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）測(cè)得白胡椒精油中3-蒈烯的含量在21.94%～24.64%之間。Lomarat等[10]研究表明δ-3-蒈烯是黑胡椒油的主要成分（30.75%）。Zhang等[11]研究發(fā)現(xiàn)黑胡椒精油對(duì)肉中的致病菌——大腸桿菌具有明顯的抑制效果。

目前，有關(guān)3-蒈烯對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌機(jī)理的探討鮮有報(bào)道。本研究主要通過(guò)測(cè)定3-蒈烯的最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）確定抑菌活性，通過(guò)銅綠假單胞菌掃描電鏡觀察和生長(zhǎng)曲線、電導(dǎo)率、蛋白泄漏等指標(biāo)的測(cè)定， 初步分析3-蒈烯的抑菌機(jī)理，為3-蒈烯應(yīng)用于食品的防腐保鮮提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

銅綠假單胞菌（ATCC 9027），廣東省微生物菌種保藏中心。

（+）-3-蒈烯（>90.0%），日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社（TCI）;無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（PBS，濃度為0.1、0.01 mol/L，pH 7.4）、2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）、牛肉膏、蛋白胨，北京索萊寶科技有限公司;羅丹明123，上海源葉生物科技有限公司;堿性磷酸酶（AKP）測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所。

無(wú)菌超凈工作臺(tái)，蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司;高壓滅菌鍋，致微（廈門(mén)）儀器有限公司;SPX型生化培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠;SHA-2型恒溫振蕩器，常州澳華儀器有限公司;TGL-16M型高速冷凍離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司; 5804R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司;S-3000型掃描式電子顯微鏡，日本日立（Hitachi）工機(jī)有限公司;DDS-307型電導(dǎo)率儀，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;TU1810型分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;F-280型熒光分光光度計(jì)，天津港東科技發(fā)展股份有限公司。

1.2? 方法

1.2.1? 菌種活化? 將銅綠假單胞菌在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h進(jìn)行傳代恢復(fù)活性，培養(yǎng)后的細(xì)菌用無(wú)菌生理鹽水（0.9% NaCl）將其從斜面上洗脫下來(lái)，采用麥?zhǔn)媳葷岱ò丫鷳乙旱臐舛冗M(jìn)行稀釋。

1.2.2? 最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌劑濃度（MBC）的測(cè)定? 參照Huang等 [12]的方法做適當(dāng)調(diào)整，將3-蒈烯溶于70 %乙醇中，稀釋成800、400、200、100、50、25 mL/L的抑制液，在平板中先加入1 mL抑制液，再倒入降溫至50 ℃左右的營(yíng)養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基19 mL，混合均勻，使其終濃度為40、20、10、5、2.5、1.25 mL/L。待培養(yǎng)基凝固之后，在每個(gè)平板中加入200 μL濃度為107～108 CFU/mL的供試菌懸液，用涂布棒涂布均勻。空白對(duì)照和陰性對(duì)照分別為無(wú)菌水和70%乙醇，平板倒置培養(yǎng)，于24 h后進(jìn)行觀察，3-蒈烯的最小抑菌濃度（MIC）為完全不長(zhǎng)菌的最小稀釋濃度。然后，將濃度大于或等于MIC的平板在37 ℃下再培養(yǎng)24 h。仍然沒(méi)有可見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)的濃度定義為最小殺菌劑濃度（MBC）[13]。

1.2.3? 細(xì)菌生長(zhǎng)的測(cè)定? 采用干重法[14]，按照1 %（V/V）的接種量將稀釋至106～107 CFU/mL的銅綠假單胞菌菌懸液接種到液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)12 h后，加入3-蒈烯使其終濃度為MIC、MBC，取樣間隔為1 h，取出的菌液在 8000 r/min離心10 min，棄上層液體，下層菌體用無(wú)菌水重懸洗滌，將菌體置于80 ℃下烘干至恒重，測(cè)得菌體干重。對(duì)照組為無(wú)菌水。

1.2.4? 掃描電鏡（SEM）觀察? 為了觀察銅綠假單胞菌的形態(tài)變化，參照Tang等[15]的方法對(duì)供試菌進(jìn)行SEM觀察。銅綠假單胞菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，分別加入3-蒈烯使其終濃度為MIC、MBC，空白對(duì)照和陰性對(duì)照分別為無(wú)菌水和70 %乙醇，在培養(yǎng)4 h和8 h后將菌懸液取出，6000 r/min離心10 min收集菌體。菌體先用0.1 mol/L的PBS緩沖液洗滌3次，再依次用20%、40%、60%、80%的乙醇溶液進(jìn)行梯度脫水，最后用無(wú)水乙醇進(jìn)行洗脫。樣品置于20 ℃預(yù)凍，再于真空冷凍干燥器中干燥12 h。取出干燥完全的菌體、上樣、通過(guò)陰極噴涂將菌體金覆蓋，在掃描電子顯微鏡上觀察銅綠假單胞菌的細(xì)胞形態(tài)。

1.2.5? 菌液電導(dǎo)率的測(cè)定? 參照張新虎等[16]的方法并做一些改動(dòng)，銅綠假單胞菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，用無(wú)菌PBS緩沖液 （0.1 mol/L）洗滌3次并重懸，分別加入3-蒈烯使其終濃度為MIC、MBC，70 %乙醇作為對(duì)照組，電導(dǎo)率測(cè)量時(shí)間間隔為15 min，連續(xù)3 h。

1.2.6? 蛋白質(zhì)泄漏的測(cè)定? 采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定。銅綠假單胞菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，在菌懸液加入MIC、MBC濃度的3-蒈烯溶液，無(wú)菌水作為空白對(duì)照組。分別在加入3-蒈烯的第0、2、4、6、8、10、12 h取出菌懸液，將菌懸液置于離心機(jī)中4000 r/min離心10 min。在上清液中加入5 mL配置好的考馬斯亮藍(lán)試劑，混勻靜置5 min后在595 nm下測(cè)量其吸光度。

1.2.7? 堿性磷酸酶的測(cè)定? 參照肖香[17]等的方法并做一些改動(dòng)，銅綠假單胞菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，在菌懸液中加入MIC、MBC濃度的3-蒈烯溶液，無(wú)菌水作為空白對(duì)照組。分別在加入抑菌物質(zhì)的0、2、4、6、8 h取出菌懸液，4000 r/min 離心 10 min，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定上清液中堿性磷酸酶（AKP）的含量。

1.2.8? 膜電位的測(cè)定? 采用羅丹明123熒光染色法[18]。銅綠假單胞菌在液體培養(yǎng)基培養(yǎng) 24 h，將菌液濃度調(diào)整為106～107 CFU/mL。加入3-蒈烯使其終濃度為MIC、MBC，無(wú)菌水作為空白對(duì)照組，于37 ℃、150 r/min 振蕩培養(yǎng) 3 h后，離心棄上清，再用PBS（0.01 mol/L ）洗滌。羅丹明123溶解在PBS緩沖液（0.01 mol/L）中得到濃度為1 mg/mL的母液，加入菌液中使其終濃度為2 ?g/mL，在黑暗中孵育30 min。將菌液用PBS緩沖液（0.01 mol/L）充分洗凈，重懸。使用熒光分光光度計(jì)在480和530 nm的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)處使用熒光分光光度計(jì)測(cè)定平均熒光強(qiáng)度，狹縫寬度設(shè)置為10 nm， 數(shù)據(jù)用平均熒光強(qiáng)度（MFI）表示。

1.2.9? 呼吸鏈脫氫酶的測(cè)定? 參照陶文卿[19]的方法并做一些改動(dòng)，銅綠假單胞菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)末期，取1 mL菌懸液加入試管中，然后依次加入 Tris-HCl緩沖液（0.05 mol/L，pH 8.6）2 mL、0.1 mol/L葡萄糖溶液2 mL和1 mg/mL的TTC溶液2 mL并搖勻。加入3-蒈烯使其終濃度為MIC、MBC，無(wú)菌水作為空白對(duì)照組，將試管置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育5 h后，在各試管中滴加2滴濃H2SO4終止反應(yīng)，然后分別加入5 mL正丁醇萃取，使產(chǎn)物完全進(jìn)入上層，靜置分層后取上層液體4000 r/min離心10 min，以正丁醇作為參照在490 nm處測(cè)量其吸光度。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用DPS軟件的單因素方差分析進(jìn)行差異顯著性分析（p<0.05），并使用 Origin 9.0軟件繪圖。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 最小抑菌濃度和最小殺菌濃度

3-蒈烯對(duì)銅綠假單胞菌具有抑菌作用，且抑菌作用較強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，最小抑菌濃度（MIC）為20 mL/L，最小殺菌濃度（MBC）為40 mL/L，為MIC的2倍?？瞻讓?duì)照和陰性對(duì)照組24 h后均觀察到有菌生長(zhǎng)，說(shuō)明無(wú)法抑制銅綠假單胞菌。

2.2? 3-蒈烯對(duì)銅綠假單胞菌生長(zhǎng)的影響

在研究3-蒈烯抑菌活性的基礎(chǔ)上，測(cè)定了銅綠假單胞菌的生長(zhǎng)曲線。由圖1可知，3-蒈烯對(duì)銅綠假單胞菌生長(zhǎng)的影響。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組細(xì)菌持續(xù)生長(zhǎng)、增殖，細(xì)菌的干重總體呈上升趨勢(shì)，從（0.470.02）mg/mL增長(zhǎng)至（1.120.01）mg/mL。當(dāng)加入終濃度為MIC和MBC的3-蒈烯后，銅綠假單胞菌的生長(zhǎng)曲線發(fā)生顯著變化，菌體干重在前2 h內(nèi)發(fā)生明顯下降，之后下降速度趨緩。生長(zhǎng)曲線可以部分反映細(xì)菌在一定的生長(zhǎng)環(huán)境中生長(zhǎng)繁殖的規(guī)律。結(jié)果表明，3-蒈烯對(duì)銅綠假單胞菌的生長(zhǎng)存在較好的抑制效果，能夠減緩甚至完全阻止細(xì)胞增殖。

2.3? 3-蒈烯對(duì)銅綠假單胞菌形態(tài)的影響

3-蒈烯對(duì)銅綠假單胞菌的形態(tài)影響如圖2所示。由圖2A1、圖2A2可知，空白對(duì)照組的銅綠假單胞菌菌體細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，表面光滑，大小分布均勻。根據(jù)圖2B1和圖2B2，經(jīng)乙醇處理4 h和8 h后，銅綠假單胞菌的形態(tài)沒(méi)有明顯變化，表明乙醇對(duì)細(xì)菌形態(tài)沒(méi)有影響。相比之下，使用3-蒈烯處理的銅綠假單胞菌發(fā)生明顯的形態(tài)學(xué)損傷。如圖2C1、圖2D1，在加入濃度為MIC和MBC的3-蒈烯培養(yǎng)4 h后，部分細(xì)胞變短、斷裂，細(xì)胞發(fā)生堆疊、粘附現(xiàn)象。3-蒈烯處理8 h后，細(xì)胞發(fā)生明顯變化，其形態(tài)受到嚴(yán)重破壞。大部分細(xì)胞發(fā)生彎曲、凹陷、畸形，細(xì)胞破裂（圖2C2、圖2D2）。此外，添加MBC的3-蒈烯的細(xì)菌損傷更嚴(yán)重，更多的細(xì)胞發(fā)生堆積和粘附，失去其原有形態(tài)。該結(jié)果與蛋白質(zhì)泄漏的測(cè)試結(jié)果一致。

掃描電鏡結(jié)果可以直接反映細(xì)胞膜的形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)變化[20]。有研究表明，精油可以影響細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，主要是其中的抑菌成分能夠穿透細(xì)胞壁并破壞細(xì)胞膜[21]。在本研究中，銅綠假單胞菌的形態(tài)學(xué)改變可能是由于3-蒈烯對(duì)細(xì)胞膜完整性和通透性的影響，這將導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞膜的不穩(wěn)定以及細(xì)胞膜和壁的分離，隨后造成細(xì)胞內(nèi)部物質(zhì)如蛋白的外泄。本研究結(jié)果表明，3-蒈烯改變了銅綠假單胞菌的正常形態(tài)，破壞了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，抑制了細(xì)菌生長(zhǎng)，最終造成細(xì)菌死亡。

2.4? 3-蒈烯對(duì)銅綠假單胞菌電導(dǎo)率的影響

3-蒈烯對(duì)銅綠假單胞菌電導(dǎo)率的影響如圖3所示，未添加抑菌物質(zhì)的對(duì)照組先上升，后期保持平穩(wěn)并略有增加，這是因?yàn)榧?xì)菌的正常裂解和死亡。用3-蒈烯（MIC和MBC）處理后，電導(dǎo)率均高于對(duì)照組，在前100 min電導(dǎo)率快速增加，總體呈上升趨勢(shì)，MIC組的電導(dǎo)率從（1514.008.19）?s/cm 上升到（1629.506.36）?s/cm，MBC組的電導(dǎo)率從（1520.6716.80）?s/cm 上升到（1706.007.21）?s/cm。而且，MBC組的電導(dǎo)率顯著高于MIC組。

細(xì)胞膜是細(xì)菌的保護(hù)屏障也是滲透屏障，用于小離子如K+，Na+和Mg2+的通過(guò)[22]。維持離子穩(wěn)態(tài)在很多方面有重要作用，如溶質(zhì)運(yùn)輸、代謝調(diào)控等。當(dāng)細(xì)菌處在含有抑菌物質(zhì)的環(huán)境中，細(xì)胞膜被破壞，帶電離子泄漏到膜外，膜外環(huán)境的電導(dǎo)率增加，細(xì)胞膜通透性改變，對(duì)細(xì)胞代謝產(chǎn)生有害影響并導(dǎo)致細(xì)胞死亡[23]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明3-蒈烯能夠影響細(xì)胞膜的完整性，增加膜通透性并導(dǎo)致膜損傷。李婷等[24]的研究也證明姜厚樸水提物處理后可以提高大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的滲透性。

2.5? 3-蒈烯對(duì)銅綠假單胞菌蛋白釋放的影響

3-蒈烯對(duì)銅綠假單胞菌蛋白質(zhì)釋放的影響如圖4所示。用MBC和MIC濃度處理的銅綠假單胞菌上清液中的蛋白質(zhì)濃度均顯著高于對(duì)照組（p<0.05）。從0 h到12 h，對(duì)照組的蛋白濃度從（0.0480.001）mg/mL變?yōu)椋?.0730.002）mg/mL，略有提高，MIC組的蛋白質(zhì)濃度從（0.052 0.003）mg/mL 大幅增加至（0.232 0.022）mg/mL，MBC組的蛋白濃度從（0.044 0.003）mg/mL大幅增加至（0.1970.019）mg/mL。在6 h，MBC組的蛋白濃度達(dá)到最大，為MIC組的1.18倍。

蛋白質(zhì)作為一種大分子物質(zhì)，存在于細(xì)胞內(nèi)部，是細(xì)胞關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)組件。蛋白質(zhì)的泄漏可以反映細(xì)胞膜完整性的損傷情況[25]。本研究結(jié)果顯示3-蒈烯破壞了銅綠假單胞菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，引起蛋白泄漏，對(duì)細(xì)胞膜完整性造成了不可逆的損傷，和掃描電鏡結(jié)果相呼應(yīng)。

2.6? 3-蒈烯對(duì)銅綠假單胞菌胞外堿性磷酸酶含量的影響

3-蒈烯對(duì)銅綠假單胞菌胞外堿性磷酸酶含量的影響如圖5所示。細(xì)胞壁位于細(xì)胞表面，具有保護(hù)細(xì)胞、保持細(xì)胞形狀、選擇性運(yùn)輸大分子物質(zhì)的功能。堿性磷酸酶（AKP）是一種非特異性磷酸單酯酶，作為胞內(nèi)酶存在于細(xì)胞壁和細(xì)胞膜之間，在正常情況下不會(huì)向外滲透。當(dāng)細(xì)胞壁被破壞，細(xì)胞壁完整性受損后，堿性磷酸酶會(huì)大量外泄到胞外環(huán)境中[26]。因此，細(xì)胞壁完整性的變化情況可以通過(guò)測(cè)定胞外堿性磷酸酶含量的變化來(lái)反映。

由圖5可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組和處理組的堿性磷酸酶含量都有小幅度增加，但都保持在較低水平。在2 h，MBC組和MIC組的堿性磷酸酶含量顯著高于對(duì)照組（p<0.05）。4 h之后，3組的堿性磷酸酶含量接近。結(jié)果表明，3-蒈烯對(duì)銅綠假單胞菌細(xì)胞壁的完整性影響較小，細(xì)胞壁破壞不嚴(yán)重。這與肖香等的研究結(jié)果類似，發(fā)現(xiàn)大蒜提取物-茶多酚復(fù)合物對(duì)3種腐敗菌的細(xì)胞壁完整性影響較弱[17]。

2.7? 3-蒈烯對(duì)銅綠假單胞菌膜電位的影響

圖6表明，3-蒈烯對(duì)銅綠假單胞菌膜電位（MP）有顯著影響。未添加3-蒈烯的對(duì)照組的平均熒光強(qiáng)度是（522.1513.03）AU，添加3-蒈烯至終濃度為MIC和MBC后，熒光強(qiáng)度分別急劇下降至（319.4110.10）AU和（211.7717.72）AU，跟對(duì)照組比較，分別減少了38.19%和59.44%， 差異極顯著（p<0.01）。而且，MBC組和MIC組相比平均熒光強(qiáng)度也發(fā)生了顯著降低，降幅為34.38%。說(shuō)明隨著3-蒈烯濃度增加，平均熒光強(qiáng)度呈下降趨勢(shì)。

膜電位是指細(xì)胞膜內(nèi)部和外部之間的電位差。維持正常的膜電位對(duì)于ATP的產(chǎn)生和保持細(xì)胞功能有重要意義[27]。羅丹明123作為染料，可以通過(guò)跨膜電位進(jìn)入細(xì)胞基質(zhì)，膜電位的大小可以通過(guò)其熒光強(qiáng)度表示。正常情況下，膜內(nèi)的電壓通常低于膜外，膜電位的降低意味著細(xì)胞膜的去極化，去極化會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞代謝異常，影響ATP的產(chǎn)生。3-蒈烯的加入導(dǎo)致膜電位降低，引起細(xì)胞膜去極化，導(dǎo)致細(xì)胞代謝活性異常和細(xì)菌死亡。

2.8? 3-蒈烯對(duì)銅綠假單胞菌呼吸鏈脫氫酶活性的影響

3-蒈烯對(duì)銅綠假單胞菌呼吸鏈脫氫酶活性的影響如圖7所示，對(duì)照組在490 nm處的吸光值為0.3970.029。隨著3-蒈烯濃度的提高，銅綠假單胞菌在490 nm處的吸光值顯著下降。當(dāng)添加MIC和MBC的3-蒈烯時(shí)，吸光值分別下降至0.0920.006和0.0580.003，分別比對(duì)照組下降76.46%和85.32%。而且，MIC組的吸光值與MBC組相比下降了37.63%。表明490 nm處的吸光值隨著3-蒈烯濃度的增加而降低。

呼吸鏈身為細(xì)胞的能量來(lái)源，對(duì)于真核生物，存在于線粒體中，對(duì)于原核生物如細(xì)菌，存在于細(xì)胞膜中。2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）作為一種小分子無(wú)色物質(zhì)，能夠透過(guò)細(xì)胞膜，被呼吸鏈脫氫酶作用還原成紅色的三苯甲酰（TF），該物質(zhì)在490 nm處有最大吸收峰[28]。因此，可通過(guò)觀察490 nm處吸光度的變化來(lái)研究銅綠假單胞菌呼吸鏈脫氫酶的活性。結(jié)果表明，3-蒈烯能夠抑制銅綠假單胞菌呼吸鏈脫氫酶的活性，該抑制作用隨著3-蒈烯濃度的提高更加明顯。這說(shuō)明，3-蒈烯可以通過(guò)破壞呼吸鏈的方式抑制銅綠假單胞菌的生長(zhǎng)，進(jìn)而殺死細(xì)菌。

3? 討論

本文初步探究了3-蒈烯對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌活性及機(jī)理，表明3-蒈烯對(duì)銅綠假單胞菌有較好的抗菌活性，MIC和MBC分別為20和40 mL/L。張聞?chuàng)P等[29]研究發(fā)現(xiàn)大葉桉葉揮發(fā)油的主要成分為3-蒈烯，該揮發(fā)油對(duì)常見(jiàn)致病菌包括沙門(mén)氏菌、綠膿桿菌和痢疾桿菌有良好的抑制作用。生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)表明，加入3-蒈烯后，銅綠假單胞菌的生長(zhǎng)受到了抑制。由掃描電鏡圖片可知，銅綠假單胞菌原有的正常細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變。蛋白質(zhì)和電解質(zhì)的外泄表明3-蒈烯可能會(huì)損壞原有的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，破壞細(xì)胞膜的完整性，增加細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)向外泄漏。王芳等[30]報(bào)道，肉桂精油可以造成成團(tuán)泛菌和腐生葡萄球菌細(xì)胞內(nèi)容物的泄漏，破壞細(xì)胞膜完整性。加入3-蒈烯后，細(xì)菌的膜電位（MP）降低，可能使細(xì)胞發(fā)生去極化現(xiàn)象，引發(fā)不規(guī)則的代謝活動(dòng)。與本研究結(jié)果類似，有研究發(fā)現(xiàn)黑胡椒精油可以導(dǎo)致大腸桿菌的細(xì)胞膜發(fā)生去極化現(xiàn)象[11]。此外，呼吸鏈脫氫酶活性下降，說(shuō)明3-蒈烯可能對(duì)呼吸鏈造成損傷。這些變化最終導(dǎo)致細(xì)胞走向死亡。

本研究為進(jìn)一步探索3-蒈烯對(duì)銅綠假單胞菌的抗菌機(jī)理奠定了基礎(chǔ)，也為開(kāi)發(fā)3-蒈烯為食品防腐保鮮劑提供了可能。

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