清熱生肌膏治療大鼠深ＩＩ度燙傷試驗研究

王發(fā)斌 趙曉翔 王波 鄧強 黃韻蓓 李嘉蘭 劉瑞

摘要：研究清熱生肌膏對大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面的保護作用及作用機制。將SD大鼠100只隨機分成模型組、燒傷膏組、清熱生肌膏高劑量組、清熱生機膏低劑量組。模型組及治療組采用燙傷儀持續(xù)燙傷大鼠股部8 s制成深Ⅱ度燙傷模型，傷后立即給藥，每天1次，連續(xù)21 d，不同的時間點取材，測定創(chuàng)面的創(chuàng)面愈合率、組織含水量、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、羥脯氨酸（Hyp）、血清白細胞介素-1（IL-1）、腫瘤壞死因子-β（TNF-β）含量。結(jié)果表明，清熱生肌膏對大鼠深Ⅱ度燒傷具有良好的保護作用，其作用機制和增加創(chuàng)面VEGF、Hyp水平，降低血清IL-1、TNF-β含量有關(guān)。

關(guān)鍵詞：清熱生肌膏;深I(lǐng)I度燙傷;血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）;羥脯氨酸（Hyp）;血清白細胞介素-1（IL-1）;腫瘤壞死因子-β（TNF-β）

中圖分類號：R285.5? ? ? ? ?文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）01-0091-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.01.022? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Experimental Study on the Treatment of Deep II Degree Scald

in Rats by Qingre Shengjigao

WANG Fa-bin1，ZHAO Xiao-xiang2a，WANG Bo2b，DENG Qiang2a，HUANG Yun-bei2a，LI Jia-lan2a，LIU Rui2a

（1.Guiyang No.5 Vocational School，Guiyang 550018，China;2a.School of Chemistry and Life Sciences;2b.Teaching Laboratory Management Center，Guizhou Education University，Guiyang 550018，China）

Abstract： The protective effect and mechanism of Qingre Shengjigao on deep second degree scald wound in rats were studied. 100 SD rats were randomly divided into model group， burn cream group， high dose group of Qingre Shengjigao， and low dose group of Qingre Shengjigao. In the model group and the treatment group， the model of deep scald in the femoral part of the scald rat was made by the scald instrument， and the model of deep second degree scald was made by 8 s. Immediately giving medicine after injury， 1 times a day for 21 days， and taking samples at different times， the wound healing rate， water content， vascular endothelial growth factor（VEGF）content， hydroxyproline（Hyp）content， interleukin-1（IL-1） content， tumor necrosis factor beta（TNF-β）content were determined. The results showed that， Qingre Shengjigao has a good protective effect on deep two degree burn in rats， and its mechanism is related to the increase of VEGF and Hyp levels and the decrease of serum IL-1 and TNF- β levels.

Key words： Qingre Shengjigao; deep second degree scald; vascular endothelial growth factor（VEGF） ; hydroxyproline（Hyp）; interleukin-1（IL-1）; tumor necrosis factor beta（TNF-β）

燒燙傷一般是指由于熱力如蒸氣、火焰、熾熱金屬、沸水和高溫氣體等所致體表組織損害。燒燙傷程度分為Ⅰ度、淺Ⅱ度、深Ⅱ度、Ⅲ度[1]。西藥在燒燙傷治療過程中運用廣泛，療效也十分顯著，但存在一些明顯的不良反應(yīng)[2]。中藥治療輕、中度燒燙傷的效果良好，中藥制劑不僅劑型豐富[3]，還具有藥源豐富、配制簡單、無不良反應(yīng)、價格低廉、療效顯著等特點[4]。中醫(yī)對燒燙傷采用清熱解毒、益氣理脾、養(yǎng)陰生津、脫里排膿、活血化瘀原則。清熱生肌膏是由黃連、黃柏、黃芩、三七和冰片等中藥組成的復(fù)方中藥制劑，本試驗觀察清熱生肌膏對大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面的保護作用及作用機制，以期為清熱生肌膏的進一步開發(fā)提供依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 試驗動物? 普通SD大鼠100只，雌雄各半，體重300～500 g，普通級，購于重慶唯康公司。單只分籠，自由進食、飲水，室溫飼養(yǎng)。

1.1.2? 藥品與試劑? 水合氯醛（AR）、九水合硫化鈉（AR）、75%的乙醇、購自貴陽市醫(yī)藥公司，濕潤燒傷膏購自汕頭市美寶制藥有限公司，批號1312403A。高濃度清熱燒傷膏（含生藥2 g/mL）、低濃度清熱生肌膏（含生藥1 g/mL）自制。

血管內(nèi)皮生長因子試劑盒、羥脯氨酸試劑盒、白細胞介素-1試劑盒、腫瘤壞死因子-β試劑盒均購自上海心語生物科技有限公司。

1.1.3? 試驗儀器? YLS-5Q臺式恒溫恒壓燙傷儀（濟南益延科技發(fā)展有限公司）;電熱干燥箱（嘉興市遠航環(huán)保教育儀器有限公司）;CP-6800電推剪（深圳科德士電器有限公司）;HEIDOLPH DI-AX900 型勻漿機（德國）;Sigma 3-18 型臺式高速冷凍離心機（德國）。

1.2? 試驗方法

1.2.1? 深Ⅱ度燒傷模型的建立及給藥? 將100只大鼠隨機分為4個組，進行一周的適應(yīng)性飼養(yǎng)，大鼠單籠飼喂，編號。隨機分為模型組、高劑量組、低劑量組和燒傷膏組。大鼠稱重，10%水合氯醛按0.3 mL/100 g的劑量腹腔注射進行麻醉[5]。剃大鼠股骨上端兩側(cè)的毛涂10%硫化鈉，3 min后擦拭，去除毛根。將燙傷儀接通電源，溫度調(diào)到80 ℃，致傷壓力為燙傷棒自重500 g，燙頭面積為4 cm2，燙傷時間設(shè)為8 s，調(diào)整好動物的體位及燙傷部位皮膚平整度，燙傷棒垂直與皮膚表面接觸，燙傷儀倒數(shù)計時器自動開始計時，計時結(jié)束時，迅速將燙傷棒撤離皮膚表面，為深Ⅱ度燒傷[6]。燙傷后涂藥，每個創(chuàng)面約0.1 g，每天給藥一次。

1.2.2? 創(chuàng)面組織指標(biāo)檢測

1）創(chuàng)面愈合率。分別在燙傷后第1天、第3天、第7天、第14天、第21天5個時相點，從每組大鼠中各取5只，用透明方格紙描繪出創(chuàng)傷面積，以傷后第1天面積作為燙傷面積，以數(shù)方格的方法得出創(chuàng)傷面積，創(chuàng)面愈合率=（燙傷面積-各時相點面積）/燙傷面積×100%。

2）組織含水量。分別在燙傷后第1天、第3天、第7天、第14天、第21天5個時相點，從每組大鼠中各取5只，麻醉，創(chuàng)面剪下，濾紙吸干血跡，電子天平稱量濕重，于80 ℃烘干48 h。組織含水量=（烘干前質(zhì)量-烘干后質(zhì)量）/烘干前質(zhì)量×100%。

3）血管內(nèi)皮生長因子、羥脯氨酸測定。取創(chuàng)面全層皮膚100 g左右，濾紙吸去血跡，加入生理鹽水研磨，在4 ℃以下10 000 r/min離心15 min，取上清液-20 ℃以下保存。分別于第1天、第3天、第7天、第14天、第21天5個時相點從每組大鼠中各取5只采取大鼠樣本，按試劑盒使用說明書檢測。

4）白介素-1、腫瘤壞死因子β含量。大鼠麻醉，大鼠心臟取血，靜置2 h，3 000 r/min離心20 min，取上層清液，-70 ℃超低溫保存。分別在第1天、第3天、第7天、第14天、第21天取血液，每次5只大鼠，按試劑盒使用說明書檢測。

1.3? 數(shù)據(jù)分析

試驗結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，SPSS 21.0進行單因素方差分析，P<0.05為差異顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 清熱生肌膏對大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面愈合率的影響

清熱生肌膏對大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面愈合率的影響見表1。以燙傷后第1天的創(chuàng)面為燙傷面積，從表1可以看出，第3天時，用藥組創(chuàng)面愈合率呈上升趨勢，隨著用藥時間的延長，第7天、14天和第21天，與模型組相比，差異明顯。清熱生肌膏高劑量組在燙傷后的第7天和第14天時與模型組相比有極顯著差異，表明清熱生肌膏對大鼠深Ⅱ度燙傷后的愈合率有明顯的促進作用。

2.2? 清熱生肌膏對大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面組織含水量的影響

清熱生肌膏對大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面組織含水量的影響見表2。從表2可以看出，大鼠在燙傷后的第1天，用藥組與模型組相比，創(chuàng)面組織含水量偏小，但并不太明顯。第3天時，清熱生肌膏高劑量組和濕潤燒傷膏組的創(chuàng)面組織含水量顯著下降。第7天、第14天和第21天，各用藥組創(chuàng)面組織含水量與模型組相比差異顯著或極顯著（P<0.05或P<0.01）。

2.3? 清熱生肌膏對大鼠深Ⅱ度組織創(chuàng)面血管內(nèi)皮生長因子的影響

清熱生肌膏對大鼠深Ⅱ度組織創(chuàng)面血管內(nèi)皮生長因子的影響見表3。從表3可以看出，大鼠在燙傷后的第1天，用藥組與模型組相比，血管內(nèi)皮生長因子含量提高，但差異不顯著。第3天、第7天、第14天和第21天，清熱生肌膏高劑量組和濕潤燒傷膏組血管內(nèi)皮生長因子增加，與模型組相比差異極顯著（P<0.01）。清熱生肌膏高低劑量組血管內(nèi)皮生長因子含量與模型組相比差異不顯著。

2.4? 清熱生肌膏對大鼠深Ⅱ度組織創(chuàng)面羥脯氨酸含量的影響

清熱生肌膏對大鼠深Ⅱ度組織創(chuàng)面羥脯氨酸含量的影響見表4。從表4可以看出，大鼠在燙傷后的第1天，用藥組與模型組相比，羥脯氨酸含量升高，但差異不顯著。第3天、第7天、第14天和第21天，清熱生肌膏高劑量組和濕潤燒傷膏組的羥脯氨酸含量增加，且與模型組相比差異極顯著（P<0.01）。清熱生肌膏低劑量組創(chuàng)面羥脯氨酸含量與模型組相比有增加趨勢，但差異不顯著。

2.5? 清熱生肌膏對大鼠深Ⅱ度燙白介素-1含量的影響

清熱生肌膏對大鼠深Ⅱ度燙傷白介素-1含量的影響見表5。從表5可以看出，燙傷第1天，用藥組與模型組相比，白介素-1含量降低，差異顯著（P<0.05或P<0.01）。第3天、第7天、第14天和第21天，清熱生肌膏高劑量組和濕潤燒傷膏組的白介素-1含量降低，與模型組相比差異極顯著（P<0.01）。清熱生肌膏低劑量組白介素-1的含量與模型組相比有降低趨勢，但差異不顯著。

2.6? 清熱生肌膏對大鼠深Ⅱ度燙傷腫瘤壞死因子-β含量的影響

清熱生肌膏對大鼠深Ⅱ度燙傷腫瘤壞死因子-β含量的影響見表6。從表6可以看出，燙傷后的第1天、第3、第7天、第14天和第21，清熱生肌膏高劑量組和燒傷膏組與模型組相比，腫瘤壞死因子-β含量下降，差異極顯著（P<0.01）。清熱生肌膏低劑量組腫瘤壞死因子-β含量第14天和第21天與模型組差異極顯著（P<0.01）。

3? 小結(jié)與討論

臨床上深Ⅱ度燙傷作為常見的燒傷類型，采用大鼠深Ⅱ度燙傷模型為研究對象來探討其作用機制。燙傷動物模型以小鼠、大鼠為主，動物燒傷模型面積和深度不容易控制，動物燒燙傷模型一般以燙傷為宜。燙傷方法有沸水直接燙傷、蒸汽燙傷、火焰燒傷、儀器燙傷、其他方法燙傷等。儀器燙傷具有燙傷溫度、壓力及作用時間可以精確控制及重復(fù)性好等優(yōu)點，本試驗采用儀器燙傷法，以大鼠為試驗動物模型。

創(chuàng)面愈合是一個比較復(fù)雜的生物學(xué)過程，大致可將其分為炎癥反應(yīng)期（2～4 d）和增殖修復(fù)期（3～20 d）。炎癥反應(yīng)期是創(chuàng)面愈合的起始階段，也是創(chuàng)面修復(fù)的必要途徑，而炎癥反應(yīng)時間過長則會影響創(chuàng)面的修復(fù)，形成“難愈創(chuàng)面”[6]。當(dāng)皮膚被燙傷后，因為炎癥反應(yīng)和微循環(huán)通透性的增加，會導(dǎo)致體液滲出和組織水腫，使皮膚的含水量明顯增加，因此，通過測定創(chuàng)面組織含水量便能間接反映炎癥反應(yīng)的程度。淤滯帶微循環(huán)障礙的轉(zhuǎn)歸決定著燒傷局部損傷程度，如果微循環(huán)淤滯加重，血栓形成增多，造成局部組織缺血缺氧，影響細胞代謝，加重組織損害，使創(chuàng)面加深;如果微循環(huán)改善，阻止血栓形成，則可局部損傷減輕，范圍縮小，故減輕燙傷后局部組織水腫，對促進創(chuàng)面早期愈合有重要意義[7]。選擇5個時相點探討清熱生肌膏的治療作用，試驗結(jié)果顯示，清熱生肌膏高劑量組第3天開始到第21天能顯著降低組織含水量，降低水腫程度，縮短水腫時間。從創(chuàng)面愈合率的指標(biāo)觀察來看，燙傷后的第7天到第21天，藥物組的創(chuàng)面愈合率明顯提高，表明清熱生肌膏對創(chuàng)面具有良好的保護作用。

血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是一種血管再生的重要調(diào)控因子，它能夠刺激血管內(nèi)皮細胞遷移、增殖，該因子同時是一種局部的、內(nèi)生性調(diào)節(jié)劑，其作用可維護血管的完整性及血管的正常生理狀態(tài)[8]。VEGF是加速新生血管形成的重要細胞因子，也是作用最強、特異性最高的一種因子[9，10]，在創(chuàng)傷修復(fù)和組織重建中起著重要作用。清熱生肌膏高劑量組在第3天、第7天、第14天和第21天顯著提高血管內(nèi)皮生長因子水平。表明在創(chuàng)面修復(fù)過程中，清熱生肌膏燙傷膏可提高血管內(nèi)皮生長因子含量，加強恢復(fù)血管的完整性及血管的生理狀態(tài)，從而促進創(chuàng)面的愈合。

膠原是肉芽組織中細胞間質(zhì)的主要成分，構(gòu)成膠原的α-肽鏈，富含羥脯氨酸，羥脯氨酸的含量反映膠原在創(chuàng)面中的含量，從而評估創(chuàng)面愈合情況[11]，從燙傷組織羥脯氨酸含量來看，第3天、第7天、第14天和第21天，清熱生肌膏高劑量組和濕潤燒傷膏組的羥脯氨酸含量增加，與對照相比差異極顯著。在創(chuàng)面修復(fù)過程中，清熱生肌膏燙傷膏可提高羥脯氨酸含量，增加膠原合成，從而促進創(chuàng)面的愈合。

燙傷后白介素-1、TNF-α等在全身炎癥反應(yīng)中起著主導(dǎo)作用，機體所產(chǎn)生高濃度的TNF-α、IL-1、IL-6等炎癥介質(zhì)，一方面與炎癥細胞相互作用，加重局部炎癥反應(yīng);另一方面，高濃度的 TNF可激活細胞因子級聯(lián)反應(yīng)，進一步誘發(fā)炎癥介質(zhì)的釋放[12]炎癥介質(zhì)的大量釋放必然會導(dǎo)致劇烈的全身炎癥反應(yīng)，使機體進入“膿毒癥狀態(tài)”，在這種狀態(tài)下，引發(fā)炎癥反應(yīng)失控，從而發(fā)展到不可逆轉(zhuǎn)的多器官功能障礙綜合征階段。因此，檢測 TNF-α、IL-1等炎癥介質(zhì)的水平變化有助于評估創(chuàng)面愈合情況。腫瘤壞死因子分為兩種，既TNF-α和TNF-β，二者具有很相似的生物學(xué)性質(zhì)，在燙傷研究中，對TNF-β檢測較少。在燙傷后的第1天，用藥組與模型組相比白介素-1含量明顯降低。第3天、第7天、第14天和第21天，清熱生肌膏高劑量組白介素-1含量降低。大鼠在燙傷后第1天、第3天、第7天、第14天和第21天，清熱生肌膏高劑量組腫瘤壞死因子-β含量顯著下降，表明清熱生肌膏能減少血清中TNF-β、IL-1等炎癥介質(zhì)的合成和釋放，控制炎癥反應(yīng)，減輕對創(chuàng)面的損傷。

清熱生肌膏主要由黃連、黃芩、冰片、地榆、沒藥、三七等組成，具有清熱解毒、活血化瘀、生肌等功效。清熱生肌膏對大鼠深Ⅱ度燙傷具有較好的治療效果，能不同程度提高燙傷后的創(chuàng)面愈合率，降低組織含水量，減輕燙傷后的炎癥反應(yīng)，對創(chuàng)面修復(fù)有較好的保護作用。其機制與增加燒傷創(chuàng)面組織VEGF合成和釋放、促進創(chuàng)面微血管生成、降低燙傷大鼠血清TNF-β、IL-1水平等有關(guān)。

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