藍(lán)莓Vco-miR_n10的克隆及對干旱的響應(yīng)分析

單炳輝，謝 鑫，李 季，柴普今，李鶴鵬，張琳賀，翟璐璐

（吉林大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062）

【研究意義】MicroRNA（miRNA）是一類參與動植物轉(zhuǎn)錄后表達(dá)與調(diào)控的非編碼單鏈小分子RNA，一般由內(nèi)源基因編碼，長度為18～24個核苷酸，通過堿基互補(bǔ)配對原則降解或抑制靶標(biāo)mRNA，從而對生物體內(nèi)的各項生命過程起到重要的調(diào)控作用［1］。最早的miRNA（lin-14）是1993年由LEE等在秀麗線蟲（Caenorhabditis elegans）中發(fā)現(xiàn)的，隨后幾年中并未有研究報道植物中也有miRNA的存在，直至2002年在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了miR171，這也是首次發(fā)現(xiàn)的植物miRNA［2-3］。隨著科研技術(shù)的不斷完善，越來越多的植物miRNA被鑒定到。截至目前，miRBase（Release 22.1，2018年8月）數(shù)據(jù)庫已釋放植物成熟miRNAs 10 414條，共涵蓋了大豆（756條）、苜蓿（756條）、水稻（325條）、擬南芥（428條）、馬鈴薯（343條）、蘋果（322條）、葡萄（183條）、番茄（147條）等在內(nèi)的82個植物物種。越來越多研究表明，在植物生命過程中，這些miRNA作為有效調(diào)控因子影響著包括營養(yǎng)器官［4-6］和生殖器官［7-9］發(fā)育、植物激素調(diào)控［10］、營養(yǎng)平衡［11-12］、脅迫響應(yīng)［13-14］和miRNA生物合成途徑自控［15］等大量生理和生長發(fā)育過程。植物生長過程中難免會受到非生物脅迫的影響，引發(fā)一系列生理生化反應(yīng)，可能會降低植物抗逆性、影響品質(zhì)、減少產(chǎn)量等［15-18］。因此，揭示植物對非生物脅迫的應(yīng)答反應(yīng)機(jī)制顯得尤為重要?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】大量研究表明，植物中一些miRNA會在低溫寒冷、鹽堿、干旱等非生物脅迫條件下被誘導(dǎo)，其表達(dá)量發(fā)生變化后進(jìn)一步調(diào)控靶標(biāo)基因及其下游基因的表達(dá)，從而發(fā)揮相應(yīng)的功能。例如，擬南芥中，miR393、miR397b和miR402的表達(dá)量會在低溫、干旱、鹽堿和ABA處理后上升［19］。此外，擬南芥中miR397在高鹽條件下表達(dá)量增加，其靶標(biāo)基因LACs和CKB3的表達(dá)量降低，該基因過表達(dá)后轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽能力高于野生型擬南芥［20］。Zhang等［21］研究表明，低溫脅迫誘導(dǎo)miR319表達(dá)量下降，反而提高了植株抗低溫的能力。眾所周知，干旱是全球面臨的主要農(nóng)業(yè)氣象災(zāi)害之一，其發(fā)生頻率高、持續(xù)時間長、影響范圍廣、后延破壞力大，嚴(yán)重影響著我國很多地區(qū)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，不僅不利于植株的正常生命活動，而且會降低產(chǎn)品性狀，造成較大的經(jīng)濟(jì)損失［22］，因此，提高植物對干旱脅迫的耐受能力具有重要意義。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)了大量干旱響應(yīng)基因，然而這些基因是如何在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平上協(xié)調(diào)從而發(fā)揮功能的仍不是十分清晰，而植物miRNA的功能研究對揭示上述問題提供了大量線索。前人研究表明，干旱脅迫條件下，擬南芥中miR394過表達(dá)植株相比于野生型植株對干旱的抵抗能力更強(qiáng)［23］。而miR169則會促進(jìn)植物葉片水分的散失，從而加速植株枯萎［24］。有研究報道，馬鈴薯在干旱條件下，miR171會激活SCR基因從而表達(dá)SCL蛋白，激活赤霉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，增強(qiáng)抗旱能力［25］。此外，擬南芥中miR156、miR167、miR393、miR396 和 miR408［26］， 丹 參中 miR156、miR157、miR166、miR168［27］以 及水稻中miR169、miR393、miR395的表達(dá)量在干旱條件下均有提高［28］。對這些表達(dá)量變化的miRNAs，它們是否參與植物對干旱脅迫的應(yīng)答反應(yīng)？還有哪些miRNA能夠調(diào)控植物對干旱環(huán)境的耐受能力，又是如何進(jìn)行調(diào)控的？這些問題還需要進(jìn)一步深入研究?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】藍(lán)莓（Vaccinium corymbosum L.）為杜鵑花科越橘屬多年生常綠或落葉灌木，其果實呈深藍(lán)色，表皮被白霜，富含花青苷。藍(lán)莓因其為淺根系植物，主根不發(fā)達(dá)，且根系纖細(xì)，在栽培中不能吸收深層土壤的水分，故對土壤水分要求較高，容易受到干旱影響。本研究基于前期高通量測序的結(jié)果，從小RNA數(shù)據(jù)庫中篩選到Vco-miR_n10，該新型miRNA在藍(lán)莓果實成熟過程中表達(dá)量發(fā)生了變化，在藍(lán)果期表達(dá)量最高，而在果實生長過程中藍(lán)莓對水分的需求量逐漸增大，此過程中干旱脅迫會嚴(yán)重影響果實品質(zhì)，我們推測該miRNA可能在藍(lán)莓果實發(fā)育尤其是果實成熟期發(fā)揮重要的調(diào)控作用。【擬解決的關(guān)鍵問題】為了探究VcomiR_n10的基本功能，本研究對藍(lán)莓Vco-miR_n10進(jìn)行了序列驗證，以確定其是否為miRNA，隨后克隆并將其轉(zhuǎn)化至擬南芥中，以探究其作用機(jī)理，同時，我們利用300 mmol/L甘露醇進(jìn)行處理，分析Vco-miR_n10對干旱脅迫的響應(yīng)情況，以期為進(jìn)一步研究藍(lán)莓Vco-miR_n10的調(diào)控功能及提高藍(lán)莓耐旱能力提供重要信息與研究思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

將Col-1野生型及轉(zhuǎn)基因擬南芥種子在4 ℃黑暗環(huán)境下春化3 d，播于蛭石與草炭以1∶3比例混合的濕潤基質(zhì)中，隨后于22 ℃、16 h/8 h（光照/黑暗）條件下培養(yǎng)。

1.2 試驗方法

1.2.1 藍(lán)莓花器官RNA的提取與cDNA的獲得 采用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（離心柱型）對所采集藍(lán)莓花組織進(jìn)行總RNA的提取，詳細(xì)步驟參考試劑盒說明書。反轉(zhuǎn)錄詳細(xì)步驟參照PrimeScript ? RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）（TaKaRa Bio.，Code No. RR047A）試劑盒說明書。

1.2.2 藍(lán)莓Vco-miR_n10成熟體及前體序列數(shù)據(jù)來源 序列信息來源于本課題組藍(lán)莓不同發(fā)育時期果實小RNA高通量測序的結(jié)果（原始數(shù)據(jù)已上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫SRX2658700和SRX2676839中）［29］，并利用在線軟件The mfold Web Server（http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold）對該新型藍(lán)莓miRNA進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測，進(jìn)一步驗證其確為miRNA。

1.2.3 藍(lán)莓Vco-miR_n10基因克隆 設(shè)計帶有Gateway接頭的引物Vco-miR_n10-F（5’-ggggac aagtttgtacaaaaaagcaggcttcGGATTGTTTGACGACGAG AGAGAG-3’）和 Vco-miR_n10-R（5’-ggggacca ctttgtacaagaaagctgggtcACATAGCCCATTTCCACTCA ACC-3’），以藍(lán)莓花組織混合cDNA為模板，利用高保真酶PrimeStar（TaKaRa）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，程序如下：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s；55℃復(fù)性30 s；72 ℃延伸30 s，35次循環(huán)；72 ℃延伸7 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物的特異性。將獲得的與預(yù)期產(chǎn)物大小一致的單一、明亮的條帶進(jìn)行回收，詳細(xì)步驟參照天根公司的普通瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒（離心柱型）說明書。

1.2.4 表達(dá)載體構(gòu)建 利用Gateway技術(shù)將pre-Vco-miR_n10重組到pDONR207入門載體中，然后轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽性單菌落培養(yǎng)于37 ℃環(huán)境中，提取質(zhì)粒并進(jìn)行測序驗證。隨后，將陽性質(zhì)粒構(gòu)建到表達(dá)載體pEarleyGate101上，并將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101中。

1.2.5 擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因陽性苗的篩選利用蘸花侵染法對長勢良好且花蕾較多的擬南芥進(jìn)行侵染，隨后黑暗培養(yǎng)16～24 h。T0代種子經(jīng)次氯酸鈉消毒后播種于蛭石與草炭以1∶3比例混合的基質(zhì)中。生長期間噴施0.2 mg/mL草胺磷進(jìn)行篩選，10 d后，將生長狀況良好、仍保持綠色的轉(zhuǎn)基因植株定植到新的基質(zhì)中；收集T1代擬南芥葉片，采用CTAB法提取基因組DNA，經(jīng)過PCR檢測上述篩選出的陽性植株是否存在pre-Vco-miR_n10目的基因，以確定幼苗為陽性轉(zhuǎn)基因植株，繁殖并篩選轉(zhuǎn)基因擬南芥至T3代純合體。

1.2.6 Vco-miR_n10 轉(zhuǎn)基因擬南芥的干旱脅迫 用甘露醇模擬干旱脅迫處理，將WT種子、35Spro::pre-Vco-miR_n10-24和35Spro::pre-VcomiR_n10-52轉(zhuǎn)基因種子消毒后均勻地播種于分別含有0、300 mmol/L甘露醇的MS培養(yǎng)基上，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天定時統(tǒng)計發(fā)芽數(shù)和綠苗數(shù)，連續(xù)統(tǒng)計14 d，分別計算發(fā)芽率和綠苗率。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)莓pre-Vco-miR_n10的克隆

以藍(lán)莓花組織cDNA為模板，利用Gateway技術(shù)對藍(lán)莓pre-Vco-miR_n10基因序列進(jìn)行克隆，克隆片段大小為224 bp，PCR結(jié)果與預(yù)期一致（圖1A），利用Gateway系統(tǒng)中PDONR207和pEarleyGate101依次進(jìn)行BP和LR反應(yīng)后，進(jìn)行菌落PCR檢測，結(jié)果如圖1B所示。其中條帶1、條帶3和條帶4的大小與目的基因一致，條帶2的片段長度略小，應(yīng)為假陽性克隆。隨機(jī)選取條帶1、條帶3菌液送去進(jìn)一步測序，結(jié)果顯示均為單峰且峰值較高（圖1C），表明測序結(jié)果可信度很高，測序結(jié)果與預(yù)期藍(lán)莓pre-Vco-miR_n10基因序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示二者幾乎一致，錯配率較低（圖2），且Vco-miR_n10的成熟體序列完全一致。將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中，收取侵染后野生型擬南芥種子，再次播種后，通過草胺磷篩選獲得陽性植株（圖3），T1代種子繼續(xù)篩選，進(jìn)一步繁殖后獲取T3代種子用于干旱脅迫分析。

圖1 藍(lán)莓Vco-miR_n10的克隆、菌落PCR及測序峰Fig. 1 Cloning, colony PCR and sequencing of blueberry Vco-miR_n10

圖2 藍(lán)莓Vco-miR_n10測序結(jié)果比對Fig. 2 Comparison of sequencing result of blueberry Vco-miR_n10

圖3 擬南芥陽性轉(zhuǎn)基因株系的鑒定Fig. 3 Identification of positive transgenic lines of Arabidopsis thaliana

2.2 藍(lán)莓pre-Vco-miR_n10的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用mfold軟件對藍(lán)莓pre-Vco-miR_n10的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)其可以形成一個比較典型的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，且成熟的miRNA序列位于莖環(huán)結(jié)構(gòu)的一條臂上、miRNA*落到對應(yīng)的另一條臂上，兩者間僅存在2個錯配，同時具有較低的折疊自由能MFE（-75.58），詳見圖4。

圖4 藍(lán)莓pre-Vco-miR_n10的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖Fig. 4 Secondary structure diagram of blueberry pre-Vco-miR_n10

2.3 藍(lán)莓Vco-miR_n10的功能分析

為了更好地了解藍(lán)莓Vco-miR_n10基因在擬南芥中發(fā)揮的功能，我們將篩選得到的種子在加入甘露醇的MS固體培養(yǎng)基中進(jìn)行預(yù)試驗，根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，我們挑選了其中最顯著的2個株系（Vco-miR_n10-24和 Vco-miR_n10-52） 及 1個甘露醇濃度（300 mmol/L），對這2個株系在此條件下的生長狀況進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，生長在含有0 mmol/L甘露醇MS培養(yǎng)基中的野生型擬南芥和轉(zhuǎn)基因擬南芥沒有差別，0 mmol/L甘露醇下的擬南芥長勢明顯優(yōu)于300 mmol/L甘露醇下的擬南芥（圖5）。在藍(lán)莓Vco-miR_n10基因的作用下，擬南芥對干旱條件的抵抗能力明顯降低（圖5）。300 mmol/L甘露醇下的野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥均從播種后第4天開始萌發(fā)、第5天萌發(fā)速率提高，且從第5天晚上起野生型擬南芥發(fā)芽率顯著高于轉(zhuǎn)基因株系發(fā)芽率，直至第9天發(fā)芽率基本趨于穩(wěn)定。野生型擬南芥的發(fā)芽率高達(dá)67.72%，相同條件下轉(zhuǎn)基因株系Vco-miR_n10-24的發(fā)芽率為33.53%，比野生型擬南芥低34.19%。同樣，轉(zhuǎn)基因株系Vco-miR_n10-52的發(fā)芽率為37.69%，比野生型擬南芥低30.03%（圖6）；此外，在300 mmol/L甘露醇MS固體培養(yǎng)基中，野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥從第7天開始綠苗，以一個比較穩(wěn)定的速率持續(xù)增長，從第10天開始野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥開始出現(xiàn)顯著差異，到第14天綠苗率達(dá)到最大，之后不再變化。轉(zhuǎn)基因株系Vco-miR_n10-24和Vco-miR_n10-52的綠苗率分別達(dá)到33.53%和37.69%，同樣處理下野生型擬南芥的綠苗率為66.33%，比轉(zhuǎn)基因株系綠苗率分別高出32.80%和28.64%（圖7）。上述結(jié)果表明藍(lán)莓Vco-miR_n10基因在擬南芥中的過表達(dá)會降低擬南芥植株對干旱的抵抗能力。

圖5 0 、300 mmol/L甘露醇條件下野生型擬南芥和轉(zhuǎn)基因株系間發(fā)芽率比較Fig. 5 Comparison of germination rate between wild type Arabidopsis thaliana and transgenic lines treated with 0, 300 mmol/L mannitol

圖6 300 mmol/L甘露醇處理下野生型擬南芥和轉(zhuǎn)基因株系的發(fā)芽率Fig. 6 Germination rate of wild type Arabidopsis thaliana and transgenic lines treated with 300 mmol/L mannitol

圖7 300 mmol/L甘露醇處理下野生型擬南芥和轉(zhuǎn)基因株系的綠苗率Fig. 7 Cotyledon greening rate of wild type Arabidopsis thaliana and transgenic lines treated with 300 mmol/L mannitol

3 討論

隨著高通量測序技術(shù)與生物信息學(xué)不斷的結(jié)合與發(fā)展，越來越多的miRNA在不同植物中被預(yù)測與鑒定。近年來，國內(nèi)外研究表明成熟miRNAs作為有效調(diào)控因子在轉(zhuǎn)錄后水平可通過引導(dǎo)靶基因mRNA降解、介導(dǎo)翻譯抑制以及DNA甲基化等途徑調(diào)控靶標(biāo)基因的表達(dá)，從而參與植物的各項生命過程。目前關(guān)于藍(lán)莓miRNA的研究報道還很少，本研究中的研究對象Vco-miR_n10是通過藍(lán)莓果實高通量測序獲得的一個新型miRNA，關(guān)于其調(diào)控功能目前尚未見任何報道。為了解Vco-miR_n10的基本功能，第一個關(guān)鍵問題是鑒定該序列是否為真正的miRNA。本研究從兩個方面來驗證：首先，其前體序列可以形成一個“莖-環(huán)”的二級結(jié)構(gòu)，且其成熟的microRNA序列在“莖”的其中一條臂（3′臂或5′臂）上，這與植物miRNA的生物合成機(jī)制相一致［30-31］；其次，DCL1和HYL1進(jìn)一步切割pre-miRNA形成miRNA/miRNA*復(fù)合體，隨后于細(xì)胞質(zhì)中分離為不同長度的miRNA成熟體［32］，且該miRNA均為典型的18～24 nt切割產(chǎn)物，而本研究中的Vco-miR_n10成熟體序列大小符合這個標(biāo)準(zhǔn)，即長度約為20個核苷酸，由此表明本研究所克隆的序列確實是miRNA。

在前期研究中，我們對Vco-miR_n10在5個藍(lán)莓果實發(fā)育關(guān)鍵時期（綠果初期、綠果末期、白果期、轉(zhuǎn)色期和藍(lán)果期）的表達(dá)模式進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示該新型miRNA在藍(lán)莓藍(lán)果期呈現(xiàn)了最高的表達(dá)量［29］，說明Vco-miR_n10極有可能在果實成熟過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。因此，我們利用課題組的藍(lán)莓轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)資源結(jié)合近緣物種越橘的相關(guān)基因組序列，分析并克隆了pre-Vco-miR_n10，并將其轉(zhuǎn)入野生型擬南芥，以期對藍(lán)莓Vco-miR_n10的功能進(jìn)行研究，除了對獲得的T3代轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行表型觀察，我們同時觀察擬南芥35S::pre-Vco-miR_n10在甘露醇處理條件下的發(fā)芽率和綠苗率變化，結(jié)果顯示Vco-miR_n10過表達(dá)的擬南芥抗干旱能力顯著變?nèi)?。同樣的，Li等［24］研究已表明miR169a和miR169c在植物中過表達(dá)會導(dǎo)致植物對干旱更敏感，這與本研究結(jié)果一致。與之相似的是，苜蓿缺水時，miR169在根中的表達(dá)量下降［33］；在擬南芥中，miR169則會通過調(diào)控NFYA5來提高干旱脅迫的耐受能力［24］；玉米miR168通過靶標(biāo)基因MAPK在種子中表達(dá)，參與種子新陳代謝，進(jìn)而參與對干旱脅迫的調(diào)控［26］。然而，水稻miR169g、miR169n/o［26］， 苜 蓿 miR398、miR408［33］與 番茄miR169c［26］在干旱脅迫條件下，表達(dá)量均會升高。大豆中OSA-miR319和miR394的過表達(dá)會提高植株對干旱的抵抗能力［26,34-35］。此外，gma-miR172c在擬南芥中過表達(dá)會提高植株在甘露醇處理下的發(fā)芽率和綠苗率［15］。這些研究結(jié)果與本文相反，可能是因為不同miRNA的表達(dá)水平隨著脅迫處理過程而變化，而其靶標(biāo)基因的不同也會導(dǎo)致調(diào)控機(jī)制存在差異。本研究從抗干旱脅迫的角度闡釋了藍(lán)莓Vco-miR_n10的功能，為藍(lán)莓Vco-miR_n10的進(jìn)一步研究提供了重要信息和研究思路。

遺憾的是，在整個轉(zhuǎn)基因擬南芥植株生長期間，我們沒有觀察到轉(zhuǎn)基因植株明顯異于野生型植株的表型變化，這可能是因為Vco-miR_n10在擬南芥正常生長狀態(tài)下的形態(tài)發(fā)生過程中存在功能冗余，單一提高了該miRNA的表達(dá)量并不能引起任何外部形態(tài)上的顯著變化。后續(xù)還將進(jìn)一步挖掘藍(lán)莓Vco-miR_n10基因在植物包括藍(lán)莓中的靶標(biāo)基因及其下游基因，以期分析藍(lán)莓Vco-miR_n10基因在植物生長過程中及脅迫條件下的功能調(diào)控機(jī)制。

4 結(jié)論

本研究利用藍(lán)莓轉(zhuǎn)錄組、小RNA數(shù)據(jù)庫資源結(jié)合近緣物種越橘的相關(guān)基因組序列，篩選到藍(lán)莓新型miRNA（Vco-miR_n10），其具有較為典型的“莖-環(huán)”二級結(jié)構(gòu)且符合miRNA鑒定的標(biāo)準(zhǔn)。將克隆到的pre-Vco-miR_n10轉(zhuǎn)化到擬南芥中使其異位表達(dá)，并觀察不同生長環(huán)境條件（0 mmol/L和300 mmol/L甘露醇）下的表型變化。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型擬南芥相比，在利用300 mmol/L甘露醇進(jìn)行的模擬干旱條件下，發(fā)芽率和綠苗率呈現(xiàn)比較明顯的下降趨勢，即藍(lán)莓Vco-miR_n10在擬南芥中過表達(dá)降低了擬南芥對干旱脅迫的抵抗能力，使種子在干旱條件下的萌發(fā)能力和綠苗率均降低，這可能是由于該miRNA所調(diào)控的靶標(biāo)基因的表達(dá)量變化引起的，該結(jié)果對提高植物抗旱能力、提升植物品質(zhì)有著重要的理論指導(dǎo)意義。