張琪 董海常 劉建濤 卜培龍 李全營 秦長江

大腸癌是臨床常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，總體生存率較低［1］。據(jù)統(tǒng)計，中國大腸癌的發(fā)病率占所有惡性腫瘤的第4位，死亡率居第5位［2］，嚴重威脅著人類的健康。由于大腸癌起病隱匿，通常就診時已發(fā)展為進展期或晚期大腸癌。近年來，隨著對大腸癌的認識及診治水平的不斷提高，大腸癌的發(fā)病率和死亡率較前有所減低，但最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明大腸癌的新發(fā)病例及死亡率在全球仍居第3位［3-4］。

驅動蛋白家族成員20A（kinesin family member 20A，KIF20A）位于人5q31.2染色體上，主要通過與微管結合，水解ATP產(chǎn)生機械能，干擾細胞有絲分裂過程［5］，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。多項研究表明，KIF20A 在人類多種惡性腫瘤如惡性黑色素瘤［6］、乳腺癌［7-8］、鼻咽癌［9］、胰腺癌［10-12］、肝細胞癌［13］及肺癌［14-15］等異常表達，且與腫瘤的增殖、侵襲及預后密切相關。目前尚缺乏KIF20A在大腸癌中的研究報道。

本研究首先通過分析TCGA數(shù)據(jù)庫中KIF20A在大腸癌組織中的mRNA表達，然后采用免疫組織化學法進一步檢測KIF20A在大腸癌組織中的蛋白表達情況，并分析其表達與臨床病理參數(shù)及預后之間的相關性，探討其在大腸癌臨床診治過程中的價值，以期作為新的生物標志物，為大腸癌的早期診斷及預后評估提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2011年1月至2012年12月在河南大學淮河醫(yī)院105 例經(jīng)術后病理學檢測確診為大腸癌的石蠟組織樣本。所有樣本均采用美國癌癥聯(lián)合委員會（AJCC）確定組織學腫瘤分級和分期。其中男性65例，女性40 例；年齡≤60 歲46 例，＞60 歲59 例。納入標準：1）術前未進行新輔助治療，包括放療、化療、放化療；2）原發(fā)腫瘤為大腸癌，無合并其他惡性腫瘤或轉移腫瘤；3）臨床病例資料完整。排除標準：1）復發(fā)性結直腸癌或者合并有其他臟器的原發(fā)惡性腫瘤史；2）有肺部、肝臟等遠處轉移的患者。

1.2 方法

1.2.1 生物學分析 本研究從癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫（https：//genomecancer.ucsc.edu）下載所有可用的大腸癌mRNA 數(shù)據(jù)表達譜，包括380 例癌組織和50 例癌旁正常組織。使用Excel 2016和GraphPad 6.0軟件對數(shù)據(jù)進行Log2轉換和分析。

1.2.2 免疫組織化學法 石蠟包埋經(jīng)甲醛固定的大腸癌組織標本，組織切片機切成4 μm厚的連續(xù)切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精（依次100%、100%、95%、80%、70%）水化，pH 6.0的檸檬酸鈉進行抗原修復，一抗孵育（1:100，購自美國Abcam 公司）4℃過夜，加入生物素化二抗，室溫搖床孵育1h，使用辣根過氧化氫酶（DAB）顯色劑顯色，自來水沖洗，蘇木精復染，返藍，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，光學顯微鏡下觀察并拍照。

所有切片染色結果均由2 位病理科醫(yī)師隨機選取5 個高倍視野進行評分。染色強度按以下標準評分：0分：不染色；1分：弱染色（淡黃色）；2分：中染色（黃棕色）；3 分：強染色（棕褐色）。腫瘤細胞陽性率評分如下：0 分：無陽性腫瘤細胞；1 分：＜25%的陽性腫瘤細胞；2 分：25%～50%的陽性腫瘤細胞；3 分：50%～75%的陽性腫瘤細胞；4分：≥75%的陽性腫瘤細胞。通過將陽性腫瘤細胞的百分比和染色分數(shù)的乘積作為最終染色指數(shù)（SI）。根據(jù)此方法，SI≥4的切片定義為高表達，SI＜4為低表達，SI=0為陰性表達。

1.2.3 隨訪 隨訪主要通過復診、電話、微信等方式進行，以大腸癌確診時間為起點，腫瘤復發(fā)轉移、死亡或末次隨訪時間為觀察終止時間點，截止時間為2017年12月。

1.3 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 19.0 統(tǒng)計學軟件進行分析。采用χ2檢驗分析KIF20A表達水平與臨床病理參數(shù)及預后之間的相關性；用Kaplan-Meier檢驗繪制生存曲線；Log-Rank檢驗和Cox比例風險回歸模型分別進行相關性分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大腸癌與癌旁正常組織中KIF20A差異表達

對TCGA數(shù)據(jù)庫中KIF20A在大腸癌組織與癌旁正常組織中的表達水平進行分析，結果顯示，KIF20A在大腸癌組織中的mRNA 表達水平顯著高于癌旁正常組織，兩者比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001，圖1A）。在配對癌組織與癌旁正常組織中，KIF20A 在大腸癌組織中的mRNA 表達水平同樣顯著高于癌旁正常組織（P＜0.001，圖1B）。

圖1 大腸癌與癌旁正常組織中KIF20A差異表達

2.2 KIF20A 差異表達與患者臨床病理參數(shù)之間的相關性

大腸癌組織中KIF20A的蛋白表達水平與患者性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、腫瘤位置無顯著相關性（P＞0.05）。而與腫瘤浸潤深度（T分期）、淋巴結轉移（N分期）、遠處轉移（M分期）、TNM分期有顯著相關性（P＜0.05，表1）。

2.3 KIF20A 在大腸癌組織與癌旁正常組織中的蛋白表達水平

采用免疫組織化學法分析KIF20A在大腸癌組織和配對癌旁正常組織中的蛋白表達水平。105 例患者中，64%（67/105）大腸癌組織KIF20A 顯著高表達，36%（38/105）患者呈陰性或低表達（P＜0.05），差異具有統(tǒng)計學意義。KIF20A表達主要定位于細胞質和細胞膜，呈團片狀分布，染色強度深淺不一（圖2A，B）。

2.4 KIF20A差異表達與患者預后之間的相關性

與KIF20A低表達的患者相比，KIF20A高表達的患者總體生存時間顯著縮短（P＜0.001，圖2C）。KIF20A高表達患者較低表達患者的無復發(fā)生存時間也明顯縮短差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001，圖2D）。單因素分析結果顯示腫瘤大小、分化程度、T 分期、N分期、M 分期、TNM 分期、KIF20A 表達與預后均具有相關性（P＜0.05）；而患者性別、年齡、腫瘤位置與預后無相關性（P＞0.05）。Cox 比例風險回歸模型分析結果顯示KIF20A表達是影響大腸癌患者預后的獨立危險因素（P＜0.05，表2，3）。

表1 105例大腸癌患者臨床病理參數(shù)與KIF20A表達的相關性

表1 105例大腸癌患者臨床病理參數(shù)與KIF20A表達的相關性（續(xù)表1）

圖2 免疫組織化學法分析KIF20A在大腸癌組織與癌旁正常組織中的蛋白表達水平及其與預后的關系

表2 總體生存期的單因素和多因素Cox回歸分析

表2 總體生存期的單因素和多因素Cox回歸分析（續(xù)表2）

表3 無復發(fā)生存期的單因素和多因素Cox回歸分析

3 討論

驅動蛋白家族作為具有ATP 酶活性的微管馬達蛋白，是一類在生物物種進化過程中高度保守的多基因家族，于1985年在魷魚的神經(jīng)元軸突中首次被發(fā)現(xiàn)［16］。KIF20A（也稱RAB6KIFL，the Rab6-binding kinesin）作為驅動蛋白家族的一員，最先發(fā)現(xiàn)定位于高爾基體中，并通過與GDP-bound 形式的Rab6 相互作用在細胞動力學中發(fā)揮重要功能［17］。KIF20A通過與微管結合，水解ATP產(chǎn)生機械能，主要干擾細胞有絲分裂過程［5］。KIF20A的異常表達主要是通過干擾細胞有絲分裂過程中紡錘體的形成和染色體的分離，從而形成多倍體，最終導致腫瘤細胞增殖、侵襲及遠處轉移，影響患者的預后。

近年研究表明，KIF20A在胰腺癌組織中高表達，沉默KIF20A表達可顯著抑制胰腺癌的侵襲和遷移能力，提示KIF20A 可能具有某種癌基因特性［12］。本研究通過分析TCGA 數(shù)據(jù)庫中KIF20A 在大腸癌中的mRNA 表達水平，發(fā)現(xiàn)與癌旁正常組織相比，KIF20A在大腸癌組織中表達上調，差異具有統(tǒng)計學意義。進一步通過免疫組織化學法檢測105 例大腸癌患者組織中KIF20A的蛋白表達水平，結果表明KIF20A在大腸癌組織中高表達，在癌旁正常組織中低表達或陰性表達，提示KIF20A 可能在大腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著癌基因的角色，促進大腸癌進展。

越來越多的證據(jù)表明，KIF20A 在惡性腫瘤進展中發(fā)揮著關鍵作用。有研究報道敲除KIF20A能夠有效抑制胃癌細胞活性，誘導細胞有絲分裂（G2/M 期）阻滯，并增強抗癌藥物的敏感性，有助于改善患者預后［18］。Yamashita 等［6］證實KIF20A 高表達的惡性黑色素瘤患者無復發(fā)生存期縮短，提示是一種新型的黑色素相關抗原，表明KIF20A 是一種有助于黑色素瘤診斷和預測預后的重要指標。有研究顯示，KIF20A在乳腺癌中的過表達與盆腔淋巴結轉移陽性有關，被認為是乳腺癌的獨立預后指標［19］。但是其潛在的分子機制尚不清楚，KIF20A 與大腸癌的關系也尚不明確。

本研究進一步分析KIF20A表達與臨床病理參數(shù)及預后之間的相關性，發(fā)現(xiàn)KIF20A 蛋白表達水平與患者性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、腫瘤位置無相關性，而與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移及TNM 分期有顯著相關。提示KIF20A 蛋白陽性表達的患者通常腫瘤浸潤深度更深，TNM分期更晚，淋巴結轉移陽性及遠處轉移的可能性更大，這些結果表明KIF20A表達可能與大腸癌疾病進展有關。生存分析結果顯示KIF20A 高表達與患者不良預后相關，與Liu等［9］報道一致。Cox回歸分析進一步表明KIF20A是影響大腸癌患者預后的獨立危險因素，可能作為預測大腸癌不良預后的重要標志物。

綜上所述，本研究結果提示KIF20A 在大腸癌進展過程中發(fā)揮著重要作用，其高表達預示著大腸癌患者預后不良，可作為診斷大腸癌的生物標志物及預測預后的重要因子，為大腸癌患者的早期診斷及預后評估提供新的理論依據(jù)。但KIF20A在大腸癌發(fā)生發(fā)展中的具體分子機制仍需進一步研究。