姜 濤，雷芳紅，黃 蘊(yùn)，黃衛(wèi)國(guó)

(南華大學(xué)衡陽(yáng)醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所,腫瘤細(xì)胞與分子病理學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 衡陽(yáng) 421001)

頭頸部腫瘤(head and neck cancer，HNC)是世界上第六大常見癌癥，具有高發(fā)病率和死亡率，其最常見的誘發(fā)因素包括吸煙和酗酒。除手術(shù)切除，放射和標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞毒性化療干預(yù)之外的治療選擇很少。盡管治療方法在不斷改進(jìn)，但HNC的存活率并未顯著提高，仍只有50%左右。由于頭頸部的精細(xì)和復(fù)雜的解剖結(jié)構(gòu)，使根治性切除手術(shù)難以實(shí)現(xiàn)，迫使人們不斷找尋新的治療方法。與傳統(tǒng)的線性RNA相比，環(huán)狀RNA(Circular RNA，circRNA)不具有5′和3′末端，而是形成共價(jià)閉合的連續(xù)環(huán)。不易被核酸外切酶降解，半衰期長(zhǎng)達(dá)48h，比線性RNA更加穩(wěn)定，具有高度的保守性，組織特異性，在腫瘤診斷和治療靶點(diǎn)上存在潛在的價(jià)值[1]。

1 環(huán)狀RNA的形成

1971年，研究者首次在植物中發(fā)現(xiàn)環(huán)形植物類病毒，其基因組由閉合的單鏈RNA分子組成[2]。先前的觀點(diǎn)認(rèn)為，環(huán)狀RNA是錯(cuò)誤拼接的產(chǎn)物，并不具有生理功能。隨著高通量技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的環(huán)狀RNA分子被發(fā)現(xiàn)。目前發(fā)現(xiàn)的環(huán)狀RNA主要來(lái)源于基因外顯子，內(nèi)含子也很大程度參與了其形成。目前對(duì)環(huán)狀RNA的產(chǎn)生機(jī)制尚不明確，研究表明環(huán)狀RNA通過(guò)特殊的可變剪切產(chǎn)生，可變形式也多種多樣。外顯子環(huán)化形成的環(huán)狀RNA有兩種模型，一種是由基因外顯子共價(jià)結(jié)合構(gòu)成環(huán)化的“套索驅(qū)動(dòng)環(huán)化”；另一種是由雙內(nèi)含子互補(bǔ)配對(duì)形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)的 “內(nèi)含子配對(duì)驅(qū)動(dòng)環(huán)化”，再通過(guò)剪接體剪切剩余內(nèi)含子形成不同的環(huán)狀RNA分子[3]。另外，由RNA結(jié)合蛋白(RNA Binding Protein，RBP)和反式作用因子也可以促進(jìn)環(huán)狀RNA的形成。根據(jù)環(huán)狀RNA成環(huán)方式不同，環(huán)狀RNA可分為僅具內(nèi)含子的ciRNA;外顯子來(lái)源的circRNA;由外顯子和內(nèi)含子共同組成的ElciRNA。此外,前體tRNA可以被切割成環(huán)以形成tricRNA。另外發(fā)現(xiàn)在白血病早幼粒白血病/維甲酸受體(PML/RARα)基因的染色體易位中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)融合環(huán)狀RNA，體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其能促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤生長(zhǎng)[4]。

2 環(huán)狀RNA的生物學(xué)功能

近年，隨著研究的不斷增多，環(huán)狀RNA的各種生物學(xué)功能不斷被發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性環(huán)狀RNA通過(guò)不同的機(jī)制參與基因表達(dá)調(diào)控，發(fā)揮不同的功能。見圖1。

2.1 調(diào)控線性RNA的表達(dá)

環(huán)狀RNA的形成方式多種多樣，基因組同一位置可轉(zhuǎn)錄出mRNA和環(huán)狀RNA分子，同一基因位點(diǎn)又可以轉(zhuǎn)錄出不同的環(huán)狀RNA分子。環(huán)狀RNA可以通過(guò)非經(jīng)典剪切方式，與前體mRNA形成的經(jīng)典剪切方式相互競(jìng)爭(zhēng)，影響mRNA的表達(dá)。此外，通過(guò)內(nèi)含子序列間競(jìng)爭(zhēng)互補(bǔ)配對(duì)可以形成不同的環(huán)狀RNA分子，這些環(huán)狀RNA分子間存在競(jìng)爭(zhēng)性平衡關(guān)系可影響到mRNA的表達(dá)。

2.2 調(diào)控親本基因的轉(zhuǎn)錄

不同的環(huán)狀RNA分子通過(guò)不同的途徑調(diào)控其親本基因的轉(zhuǎn)錄。分布在細(xì)胞核中且僅具有內(nèi)含子的ciRNA可直接與DNA聚合酶II (pol II)結(jié)合促進(jìn)其親本基因的轉(zhuǎn)錄；保留內(nèi)含子和外顯子的ElciRNA首先與核糖體U1小核RNA(SnRNPs)結(jié)合形成復(fù)合物，進(jìn)一步與Pol II結(jié)合促進(jìn)親本基因的轉(zhuǎn)錄。在細(xì)胞質(zhì)中富集且僅具外顯子的circRNA，可以吸附miRNA間接來(lái)調(diào)控其親本基因的表達(dá)。

2.3 發(fā)揮內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)RNA(ceRNA)的作用

研究發(fā)現(xiàn)，一些高度富集的環(huán)狀RNA能起到ceRNA的作用。CDR1基因來(lái)源的環(huán)狀RNA CiRs-7具有70個(gè)miR-7結(jié)合位點(diǎn)，能夠大量吸附miR-7來(lái)影響哺乳動(dòng)物興奮性突觸傳遞功能[6]。此外，circRNA_036186 通過(guò)circRNA_036186/miR-193b-3p/14-3-3ζ信號(hào)軸發(fā)揮ceRNA作用來(lái)影響頭頸部腫瘤的發(fā)生發(fā)展。但是，大多數(shù)環(huán)狀RNA的表達(dá)水平很低，而且只有少數(shù)環(huán)狀RNA具有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)來(lái)結(jié)合一個(gè)特定的miRNA。并且環(huán)狀RNA的大部分功能還未知，作為miRNA海綿可能并不是環(huán)狀RNA的主要作用。

2.4 通過(guò)相關(guān)蛋白起作用

環(huán)狀RNA 可以與不同的RBP結(jié)合后可影響相關(guān)蛋白的功能。多功能蛋白甘露糖結(jié)合凝集素(mannose binding lectin，MBL)可以調(diào)控circMBL及其線性mRNA的產(chǎn)生，讓其達(dá)到一種平衡。此外，circFoxo3與ID-1，E2F1，F(xiàn)AK和HIFα多種蛋白結(jié)合共同作用影響其抗衰老作用。

2.5 翻譯蛋白質(zhì)

環(huán)狀RNA結(jié)構(gòu)的特殊性使其翻譯蛋白的方式不同于線性RNA分子。環(huán)狀RNA分子通過(guò)翻譯啟動(dòng)元件(Internal Ribosome Entry Site，IRES)和開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)翻譯蛋白質(zhì)。初步研究顯示，circ-ZNF609通過(guò)IRES可直接翻譯蛋白并參與肌肉的發(fā)生過(guò)程[7]。此外，基于核糖體印跡分析發(fā)現(xiàn)果蠅大腦中也存在大量可翻譯蛋白的環(huán)狀RNA。

2.6 通過(guò)融合環(huán)狀RNA發(fā)揮作用

基因的突變過(guò)程可以產(chǎn)生大量的融合基因，并普遍存在于癌癥基因組中。研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA也參與了這一過(guò)程，協(xié)同其他致癌因素如融合蛋白發(fā)生異常融合，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4]。

2.7 作為疾病診斷標(biāo)志物

環(huán)狀RNA的生物學(xué)特性，使得環(huán)狀RNA在外泌體、血漿、尿液、唾液中比mRNA、miRNA，長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)更穩(wěn)定。環(huán)狀RNA有望成為疾病診斷的生物標(biāo)志物(表1)。

表1 環(huán)狀RNA作為診斷標(biāo)志物

3 環(huán)狀RNA與頭頸部腫瘤

環(huán)狀RNA在消化，神經(jīng)和免疫系統(tǒng)疾病中起重要作用，并且在胚胎和外泌體以及腫瘤中高度富集。與正常細(xì)胞相比，環(huán)狀RNA在腫瘤細(xì)胞外泌體中大量富集，并且腫瘤患者血清外泌體環(huán)狀RNA的富集程度與腫瘤的大小有關(guān)[8]。表明環(huán)狀RNA在腫瘤診斷和治療中具有潛在作用(圖2)。

圖2 環(huán)狀RNA與頭頸部腫瘤

3.1 環(huán)狀RNA與口腔癌

在人口腔鱗狀細(xì)胞癌(Oral squamous cell carcinoma，OSCC)中，hsa_circ_0109291表達(dá)顯著增加，低表達(dá)可抑制OSCC細(xì)胞系的增殖和遷移。并且，環(huán)狀RNA可通過(guò)hsa_circ_0008309-miR-136-5P/hsa-miR-382-5P-ATXN1信號(hào)軸調(diào)節(jié)口腔癌的進(jìn)程[9]。此外，circRNA_100290在OSCC組織中上調(diào)，并與細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶6(cyclin dependent kinase 6，CDK6)共表達(dá)，通過(guò)海綿吸附miR-29b家族成員調(diào)節(jié)CDK6表達(dá)，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)敲除circRNA_100290能降低CDK6的表達(dá)并抑制OSCC細(xì)胞的增殖。此外，研究發(fā)現(xiàn)circSry擁有16個(gè)miR-138結(jié)合位點(diǎn)而發(fā)揮ceRNA的作用[10]，并且在口腔鱗狀細(xì)胞癌中，miR-138顯著下調(diào)，而miR-138能結(jié)合Yes相關(guān)蛋白1的mRNA的3′-非翻譯區(qū)(untranslated region，UTR)來(lái)抑制細(xì)胞增殖，從而調(diào)控口腔癌的發(fā)生發(fā)展。近期研究發(fā)現(xiàn)，circDOCK1通過(guò)調(diào)控miR-196a-5p的表達(dá)靶向調(diào)節(jié)BIRC3，從而抑制OSCC凋亡[11]。不僅如此，OSCC患者術(shù)后唾液中hsa_circ_0001874和hsa_circ_0001971的表達(dá)水平明顯降低。此外，hsa_circ_001242的表達(dá)水平與腫瘤大小和T分期呈負(fù)相關(guān)。因此，環(huán)狀RNA在口腔鱗癌中起著重要的作用。

3.2 環(huán)狀RNA與下咽癌

通過(guò)circRNA微陣列分析下咽鱗狀細(xì)胞癌(hypopharyngeal squamous cell carcinoma，HSCC)獲得2392個(gè)差異環(huán)狀RNA分子。其中，1303個(gè)circRNA在HSCC組織中上調(diào)，1088個(gè)circRNA下調(diào)。在HSCC組織中，hsa_circ_0058106，hsa_circ_0058107和hsa_circ_0024108的表達(dá)顯著增高。hsa_circ_0036722，hsa_circ_0002260和hsa_circ_0001189的表達(dá)顯著降低[12]。但針對(duì)這些circRNA在HSCC中的作用尚未進(jìn)行證實(shí)，仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。此外，也有研究通過(guò)分析HSCC中失調(diào)環(huán)狀RNA差異譜，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0008287和hsa_circ_0005027兩個(gè)環(huán)狀RNA，可通過(guò)circRNA-miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)調(diào)控miR-548C-3p的表達(dá)，通過(guò)調(diào)控miR-548C-3p的表達(dá)間接調(diào)控ErbB，Hippo信號(hào)傳導(dǎo)途徑進(jìn)而影響HSCC的預(yù)后[13]。

3.3 環(huán)狀RNA與喉頭癌

通過(guò)高通量測(cè)序篩選喉鱗狀細(xì)胞癌(Laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC)組織，獲得698個(gè)差異環(huán)狀RNA，其中302個(gè)表達(dá)上調(diào)和396個(gè)表達(dá)下調(diào)。其中，hsa_circRNA_100855在LSCC組織中顯著上調(diào)，并且hsa_circRNA_100855的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和晚期臨床分期有關(guān)。相反，hsa_circRNA_104912在LSCC組織中顯著下調(diào)，且與TMN分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。最新研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)檢測(cè)環(huán)狀RNA分子可以區(qū)分LSCC標(biāo)本和正常標(biāo)本[14]。綜上所述，環(huán)狀RNA可能在LSCC的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，并可能有助于該疾病的診斷和預(yù)后。

3.4 環(huán)狀RNA與鼻咽癌

研究發(fā)現(xiàn)，在鼻咽癌中[15]，miR-7可影響鼻咽癌細(xì)胞系CNE-1和CNE-2的放射敏感性，其表達(dá)水平越高，細(xì)胞對(duì)輻射的敏感性越強(qiáng)。ciRS-7發(fā)揮ceRNA作用，海綿吸附miR-7影響鼻咽癌的放療敏感性[10]。并且miR-7還通過(guò)抑制EGFR/PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)途徑抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖和集落形成。最新研究發(fā)現(xiàn)，在鼻咽癌患者血清和組織中，circRNA_0000285顯著增加，并影響鼻咽癌患者的放療敏感性[16]。另外，circSry通過(guò)海綿吸附miR-138影響細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)，從而影響鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展。研究報(bào)道，cir-ITCH是一種腫瘤抑制基因，在食管鱗狀細(xì)胞癌中顯著下調(diào)，充當(dāng)miR-17和miR-214海綿，提高ITCH水平；而ITCH的過(guò)表達(dá)可促進(jìn)泛素介導(dǎo)的蓬亂蛋白2(DVL2)降解并抑制癌基因c-Myc的表達(dá)，從而抑制Wnt /β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來(lái)影響鼻咽癌的進(jìn)程[17]。

3.5 環(huán)狀RNA與舌癌

在舌鱗癌細(xì)胞中(Tongue squamous cell，TSCC)[18]，ciRS-7可海綿吸附miR-7，促進(jìn)胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體(insulin-like growth factor 1，IGF1R)的表達(dá)，誘導(dǎo)由胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF1)誘導(dǎo)的Akt信號(hào)通路激活，促進(jìn)細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞凋亡的作用。circ-ITCH海綿吸附miR-214，促進(jìn)p53蛋白質(zhì)的表達(dá)，抑制Bcl-2/Bax相關(guān)蛋白質(zhì)的作用，達(dá)到抑癌的效果。此外，circSry通過(guò)吸附miR-138促進(jìn)GNAI2的表達(dá)，影響舌鱗狀細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移。通過(guò)高通量測(cè)序分析TSCC組織和鄰近組織發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA在一定程度上參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，并且與腫瘤相關(guān)的miRNA具有復(fù)雜的相關(guān)性。

4 環(huán)狀RNA研究策略

環(huán)狀RNA在疾病中作用機(jī)制的研究是時(shí)下的熱點(diǎn)。用于檢測(cè)環(huán)狀RNA表達(dá)及其功能研究的方法有很多?？梢酝ㄟ^(guò)RNA測(cè)序和微陣列篩選目標(biāo)環(huán)狀RNA，然后利用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)，液滴數(shù)字PCR，RNA印跡和熒光原位雜交進(jìn)行驗(yàn)證。通過(guò)過(guò)表達(dá)或敲除實(shí)驗(yàn)進(jìn)行環(huán)狀RNA功能研究。結(jié)合生物信息學(xué)，RNA免疫共沉淀和RNA質(zhì)譜進(jìn)行機(jī)制研究。目前，已經(jīng)開發(fā)了很多的數(shù)據(jù)庫(kù)和分析工具供研究者使用(表2)。CircInteractome具有環(huán)狀RNA引物和干擾RNA設(shè)計(jì)功能。ExoRBase用于分析血液外泌體中特異性環(huán)狀RNA分子。通過(guò)這些免費(fèi)工具，我們可以分析組織、血液、外泌體中環(huán)狀RNA的差異表達(dá)，預(yù)測(cè)與之結(jié)合的miRNA，研究環(huán)狀RNA分子具有的功能。

表2 環(huán)狀RNA數(shù)據(jù)庫(kù)

5 結(jié) 論

綜上所述，環(huán)狀RNA的穩(wěn)定性和特異性，在靶點(diǎn)的準(zhǔn)確性上優(yōu)于miRNA和lncRNA，在腫瘤診斷和治療中存在潛在的價(jià)值。如果能實(shí)現(xiàn)體內(nèi)控制內(nèi)源環(huán)狀RNA在特定組織和細(xì)胞中的表達(dá)，可能增加治療的療效，極大降低外源物質(zhì)所帶來(lái)的副作用，這將增加環(huán)狀RNA的價(jià)值，也將是未來(lái)基因治療的重大突破。盡管已經(jīng)初步提出了環(huán)狀RNA的形成模型，但是仍需要大量的實(shí)驗(yàn)來(lái)探索其生成機(jī)制，包括環(huán)狀RNA的產(chǎn)生、二級(jí)結(jié)構(gòu)，以及不同RNA之間的的相互關(guān)系。目前，腫瘤中環(huán)狀RNA的檢測(cè)主要依賴于組織樣本，而頭頸部腫瘤位置的特殊性以及復(fù)雜性使組織樣品獲得困難，增加了臨床研究難度。與組織相比，血液中的環(huán)狀RNA表達(dá)通常很高，細(xì)胞可以通過(guò)外泌體將環(huán)狀RNA分泌到血液中。因此，血液，尿液，唾液等更容易獲得的非侵入性臨床樣本將在未來(lái)頭頸部腫瘤環(huán)狀RNA研究中廣泛應(yīng)用。