溫腎活血方對RCS大鼠視網(wǎng)膜變性損傷的保護(hù)作用

向圣錦 李佳 竇仁慧 姜小涵 李柏村

視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa, RP) 是一組以進(jìn)行性感光細(xì)胞及色素上皮功能喪失為共同表現(xiàn)的遺傳性視網(wǎng)膜變性疾病, 臨床以夜盲、進(jìn)行性視野損害、眼底特征性改變和視網(wǎng)膜電圖異常或無波為其主要臨床特征，是最常見的遺傳性致盲眼病之一[1]，至今未發(fā)現(xiàn)確切有效治療RP的方法。中醫(yī)藥治療RP有著悠久的歷史，一些藥物臨床與實驗研究均被證實對本病有一定療效[2-3]?，F(xiàn)在中醫(yī)學(xué)逐漸總結(jié)和認(rèn)識到肝腎陰虛、脾腎陽虛、清陽不升和血瘀脈澀是RP的重要病機(jī)[4]。同時我們對歷代治療RP的方劑配伍和臨床用藥規(guī)律總結(jié)發(fā)現(xiàn)，自近代醫(yī)家以來，應(yīng)用溫補(bǔ)腎陽兼活血祛瘀法治療RP的報道亦越來越多[5]。臨證中，我們應(yīng)用溫腎活血方(熟附子、肉桂、枸杞子、菊花、紅參、丹參等)為主加減治療腎陽不足型RP，獲得不錯的臨床效果。為進(jìn)一步明確溫腎活血方治療本病的療效機(jī)理，本研究以皇家外科學(xué)院(royal college surgeons, RCS)大鼠為研究對象，觀察中藥溫腎活血方對RCS大鼠視網(wǎng)膜變性損傷的保護(hù)作用，以豐富中藥治療RP的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

RCS(rdy-/-,p-/-)大鼠購自蘇州昭衍新藥研究中心有限公司，質(zhì)量合格證號：NO.201910067，SPF級；正常SD大鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，質(zhì)量合格證號：NO.201614068)；經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)。RCS大鼠按照4雌2雄進(jìn)行交配得到純合子胎鼠RCS(rdy-/-,p-/-)24只(雌雄各半)；SD大鼠8只，雌雄各半，鼠齡2周齡。所有大鼠均飼養(yǎng)在湖北中醫(yī)藥大學(xué)實驗樓動物實驗中心，SPF級動物房飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料和無菌蒸餾水喂養(yǎng)，自由飲食，室內(nèi)通風(fēng)良好，室溫22～25℃；予以12h/12h的晝夜節(jié)律，光照時間6：00～18：00，每3～4 d更換一次墊料。

1.2 主要試劑及儀器

補(bǔ)腎活血方(熟附子、肉桂、枸杞子、菊花、紅參、丹參和炙甘草)。上述藥物按原方購買三九制藥有限公司濃縮中藥配方顆粒，按體表換算系數(shù)換算后配置成相應(yīng)濃度后，真空包裝，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩unel凋亡熒光染色試劑盒，普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司；CRM-440切片機(jī)，日本SAKURA公司；光學(xué)顯微鏡，日本Olympus公司，Axio Observe.Z1全自動倒置熒光光學(xué)顯微鏡。無水乙醇、異丙醇、氯仿(北京化學(xué)試劑公司)；水合氯醛(國藥集團(tuán)工業(yè)股份有限公司)。

1.3 分組及給藥

24只RCS大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為高濃度中藥組、低濃度中藥組和模型組，每組8支，雌雄各半；同時設(shè)8支SD大鼠為正常對照組(正常組)。自2周齡開始喂藥：(1)高劑量中藥組、低劑量中藥組予溫腎活血方中藥濃縮顆粒劑灌胃，高劑量中藥組灌胃濃度按中藥濃縮顆粒10.29g/Kg體重計算，低劑量中藥組灌胃濃度按中藥濃縮顆粒3.43g/Kg體重計算，初始灌胃量為0.5ml/次，每日兩次，1周后(出生3周)改為1.0mL，每日1 次。(2) 模型組和正常組：給予0.9%生理鹽水灌胃，方法及頻次同中藥組。3組均于開始治療后28天隨機(jī)選取6只大鼠處死，進(jìn)行相應(yīng)操作和各個實驗指標(biāo)測定。

1.4 視網(wǎng)膜組織病理學(xué)檢查

水合氯醛麻醉過量處死各組大鼠，快速取出右眼眼球置于4%多聚甲醛中固定48h，然后組織脫水、石蠟包埋，每組隨機(jī)選擇3只眼球沿冠狀面行4μm連續(xù)切片，蘇木精--伊紅染色(HE染色)后于100倍光學(xué)顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜各層形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化并拍照，選取視盤兩側(cè)各150μm外外核層細(xì)胞核計數(shù)，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.5 TUNEL法檢測感光細(xì)胞凋亡

取材時間和方法同上，制作視網(wǎng)膜石蠟包埋切片。按照TUNEL試劑盒說明進(jìn)行相關(guān)檢測。切片DAPI復(fù)染后熒光顯微鏡下觀察，自視盤向鋸齒緣方向連續(xù)取3個視野，500μm/視野，記錄每個視野中陽性細(xì)胞數(shù)及感光細(xì)胞總數(shù)，抽樣6張不同切片，計算平均值，統(tǒng)計感光細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞計數(shù)采用3Y-Pixel-PRO 分析軟件，感光細(xì)胞凋亡率(%) = 陽性細(xì)胞數(shù)/感光細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠視網(wǎng)膜組織病理學(xué)變化

治療后28天，正常組SD大鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)完整，外核層感光細(xì)胞排列緊密整齊，其外側(cè)依次可見感光細(xì)胞的內(nèi)節(jié)與外節(jié)。模型組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)核層及外核層均較正常組明顯變薄，細(xì)胞排列疏松，欠整齊；外層感光細(xì)胞數(shù)明顯減少，缺少外節(jié)，其余結(jié)構(gòu)基本正常。溫腎活血方高、低濃度組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)核層及外核層亦較正常組變薄，感光細(xì)胞數(shù)量減少；但與模型組比較視網(wǎng)膜更厚，感光細(xì)胞層數(shù)較后者為多，細(xì)胞排列也較為整齊(圖1)。細(xì)胞計數(shù)顯示，空白組、模型組、低劑量中藥組、高劑量中藥組每個高倍視野感光細(xì)胞數(shù)分別為(205±8)、(52±5)、(75±7)和(120±9)個。統(tǒng)計學(xué)分析顯示，模型組大鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞數(shù)目較空白組顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.00)，溫腎活血方低濃度中藥組和高濃度中藥組較模型組總體差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且高濃度中藥組明顯高于低劑量中藥組(P<0.05)。說明補(bǔ)腎活血方能延緩RCS大鼠視網(wǎng)膜變性，且高濃度中藥顯示出更好的治療效果。

2.2 各組大鼠TUNEL法檢測視網(wǎng)膜感光細(xì)胞凋亡情況

治療后28天，正常組大鼠在視網(wǎng)膜外核層(感光細(xì)胞層)偶見陽性細(xì)胞，但模型組和溫腎活血方不同濃度組大鼠視網(wǎng)膜外核層陽性染色細(xì)胞較正常組均明顯增多，出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象(圖2)。模型對照組感光細(xì)胞凋亡率為(52.43%±6.22%)，低濃度中藥組為(40.06%±6.64%)，高濃度中藥組(28.94%±6.56%)，三組間比較差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。兩兩組間比較，溫腎活血方高、低劑量組感光細(xì)胞凋亡率明顯低于模型對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。低濃度中藥組、高濃度中藥組間比較差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 各組大鼠視網(wǎng)膜組織HE染色

圖2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織TUNNEL染色

3 討論

RP屬于中醫(yī)學(xué)“高風(fēng)內(nèi)障”、“高風(fēng)雀目”、“陰風(fēng)障”范疇?！赌拷?jīng)大成·陰風(fēng)障》[7]記載本?。骸按蟮佬胁蝗?，可知世界窄，未晚草堂昏，幾疑天地黑”；《秘傳眼科龍木論·高風(fēng)雀目內(nèi)障》[6]中記載其癥狀為“惟見頂上物”。形象地說明了RP以夜盲和逐漸進(jìn)性視野縮窄為臨床特征?！峨s病源流犀燭?目病源流》[8]曰：“本病亦有生成如此,并由父母遺傳”。這是世界上關(guān)于該病具有遺產(chǎn)性的最早記載[4]。目前，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為本病的發(fā)生主要是由于先天稟賦不足所致?；蚰I陽不足，命門火衰；或肝腎虧損，精血不足；或脾胃虛弱，清陽不升而致[4]。因此，對于本病的治療大多從肝脾腎論治。該病目前沒有可以治療的辦法，大量臨床研究顯示，中藥、針灸以及針?biāo)幝?lián)合的中醫(yī)藥療法可以部分改善患者視功能，延緩病情進(jìn)展[2]。

歷代醫(yī)家多認(rèn)識到元陽(腎陽)不足在本病發(fā)病中具有重要作用。《目經(jīng)大成》[7]認(rèn)為該病的病機(jī)為元陽不足，陽不勝陰所致，曰“至晚不見，曉則復(fù)明，蓋元陽不足致病”；“人而陽不勝陰，則氣必下陷，陽氣下陷，則陰氣升騰，縱有火光月色，終不能睹”?！秾徱暚幒穂9]認(rèn)為該病“蓋元陽不足致病，或曰既陽不足”?！堆劭平痃R》[10]認(rèn)為該病是由于“陽光不足，腎陰虛損所致，乃陽微陰盛”所致。因此，先天稟賦不足，元陽不足，命門火衰；陰陽互根陽虛日久，必?fù)p及陰，陰陽俱衰，陰陽不濟(jì)，陽氣不能為用。同時，陽虛無以鼓動血行，目中脈絡(luò)瘀阻，氣滯血瘀。李傳課教授團(tuán)隊研究證實RP證候具有虛中夾瘀的特點[11]。因此稟賦不足，命門火衰，陽損及陰，陰陽不濟(jì)，終致目中脈絡(luò)瘀阻，氣血瘀滯是本病的重要病機(jī)[4,8]。現(xiàn)代臨床研究也證實[12]：RP的發(fā)生常合并有視網(wǎng)膜血管進(jìn)行性閉塞，脈絡(luò)膜血管變細(xì)。說明該病的發(fā)生和目中脈絡(luò)瘀阻，氣滯血瘀，目失所養(yǎng)密切相關(guān)。腎之陰陽俱損，五臟之精氣不能上承，視衣失其精血榮養(yǎng)，故神光呆滯，夜間昏盲，視界漸窄, 似以管窺物。因此，腎陽不足、并由此導(dǎo)致的目中脈絡(luò)淤阻，氣滯血瘀是本病的主要病機(jī)，治療當(dāng)溫腎助陽、補(bǔ)腎填精，兼以益氣活血。而溫腎助陽、補(bǔ)腎填精之重在于溫腎助陽。

溫腎活血方選用大熱之熟附子、肉桂溫補(bǔ)腎陽，枸杞、菊花滋補(bǔ)腎陰、益精明目，陰陽雙補(bǔ)，并可陰中求陽，共補(bǔ)腎中真精元陽，具體較好的補(bǔ)腎明目功效。方中配以紅參大補(bǔ)元氣，以助升陽，丹參活血化瘀通絡(luò)；炙甘草調(diào)和諸藥。諸藥合之，共奏溫補(bǔ)腎陽、益精明目，補(bǔ)氣活血之功，切中病機(jī)。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，紅參能抑制糖尿病大鼠神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡，具有神經(jīng)保護(hù)作用[13]。丹參具有改善微循環(huán)及血液流變性的作用，其所含的丹參素能增強(qiáng)視網(wǎng)膜血管及視神經(jīng)纖維的耐缺氧能力，改善缺血缺氧損傷所致的線粒體氧化磷酸化功能障礙，使細(xì)胞凋亡和壞死的百分率明顯降低[14]。

RCS大鼠是一種較成熟的視網(wǎng)膜退化性病變動物，因視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞吞噬光感受器細(xì)胞外節(jié)盤膜能力缺陷，導(dǎo)致大量的盤膜碎片堆積，最終導(dǎo)致光感受器細(xì)胞進(jìn)行性變性和凋亡，是一種常染色體隱性遺傳病，具有人類RP的主要特征，是廣泛用于RP病因及治療方法研究的經(jīng)典模型鼠[15]。既往研究發(fā)現(xiàn)，在出生14天時視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)正常，之后睜眼并接受光線刺激后開始視網(wǎng)膜變性，在出生后28天時，可見視網(wǎng)膜明顯變薄，感光細(xì)胞層數(shù)減少，外節(jié)不規(guī)則甚至消失，到42天時視網(wǎng)膜變性進(jìn)一步加重，56天時則視網(wǎng)膜外層光感細(xì)胞完全消失[16]。因此，我們選擇出生后42天進(jìn)行相關(guān)檢測，即在視網(wǎng)膜感光細(xì)胞損傷較為嚴(yán)重階段，評估溫腎活血方對視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的保護(hù)作用。

本研究結(jié)果顯示，RCS大鼠視網(wǎng)膜外核層隨著鼠齡增加視網(wǎng)膜外層逐漸變薄，細(xì)胞核排列漸變疏松且數(shù)目減少；經(jīng)不同濃度溫腎活血方治療后，視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)排列相對規(guī)整，視網(wǎng)膜外層感光細(xì)胞層數(shù)以及細(xì)胞核密度較模型組有不同程度改善，且以較高劑量治療效果更為顯著，說明視網(wǎng)膜形態(tài)和結(jié)構(gòu)得到了改善，且以較高劑量濃度改善更為顯著。同時，我們對視網(wǎng)膜組織進(jìn)行感光細(xì)胞凋亡檢測，染色結(jié)果顯示凋亡陽性細(xì)胞表達(dá)程度與外核層變薄的程度具有一致性，且高濃度溫腎活血方較低濃度組更能較少感光細(xì)胞凋亡，提示溫腎活血方可以減少RCS大鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞凋亡，對視網(wǎng)膜損傷具有一定保護(hù)作用。既往也研究發(fā)現(xiàn)，溫陽益氣活血方可以有效抑制RDS小鼠感光細(xì)胞的凋亡，保護(hù)視網(wǎng)膜外層損傷[3]。結(jié)合我們研究結(jié)果，進(jìn)一步說明溫腎活血法在治療視網(wǎng)膜色素變性中具有重要作用。

綜上所述，本研究進(jìn)一步證實溫腎活血方對遺傳性視網(wǎng)膜色素變性RCS大鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞變性具有一定的保護(hù)作用，能夠延緩感光細(xì)胞變性和凋亡的進(jìn)程，但具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。