黃驊蝦醬的微生物學(xué)和理化性質(zhì)研究

吳小禾，耿曉杰，張建旭，桑亞新，孫紀(jì)錄，*

（1.中山火炬職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物醫(yī)藥系，廣東 中山 528436；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071001）

蝦醬是一種在東亞和東南亞地區(qū)流行的傳統(tǒng)調(diào)味品，由蝦鹽腌發(fā)酵而成[1-2]。傳統(tǒng)發(fā)酵食品不僅具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和獨(dú)特的風(fēng)味，還含有很多生理活性成分[3]。但是，許多傳統(tǒng)發(fā)酵食品是在作坊或家庭內(nèi)進(jìn)行加工[4]。它們主要采用天然發(fā)酵，受外部環(huán)境等條件的影響，其品質(zhì)不穩(wěn)定，還可能存在一定的安全性問(wèn)題，例如，菌落總數(shù)超標(biāo)，高鹽環(huán)境、發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生的生物胺[5-7]，揮發(fā)性鹽基氮，丙二醛和亞硝酸鹽等。

蝦醬發(fā)酵過(guò)程中，產(chǎn)生微生物學(xué)的和生物化學(xué)的變化。其中，蛋白質(zhì)水解是蝦醬發(fā)酵期間發(fā)生的一種重要的生化反應(yīng)。它由蝦中內(nèi)源性蛋白酶以及在高鹽條件下存活的嗜鹽細(xì)菌產(chǎn)生的蛋白酶引起。蛋白質(zhì)水解引發(fā)低分子量化合物的形成，如，肽、氨基酸和胺類(lèi)，發(fā)酵過(guò)程中也會(huì)產(chǎn)生有害的代謝產(chǎn)物，從而影響發(fā)酵產(chǎn)品的質(zhì)地和風(fēng)味[2]。另外，腐胺的增加和鹽厭氧菌屬的增長(zhǎng)有關(guān)[8]。所以，自然發(fā)酵產(chǎn)品的微生物菌群在產(chǎn)品感官、品質(zhì)中起著重要的作用。

生物胺作為人體的正?；钚猿煞挚纱龠M(jìn)生長(zhǎng)和代謝，增強(qiáng)腸道系統(tǒng)免疫活性，并在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮作用[9]；但是，高濃度的生物胺將造成人體神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)損傷[10]。食品中的生物胺主要由氨基酸經(jīng)脫羧酶類(lèi)催化的脫羧反應(yīng)產(chǎn)生，最常見(jiàn)的生物胺是組胺、腐胺、尸胺、亞精胺和精胺[11]。生物胺可以作為食品和含酒精飲料的質(zhì)量和新鮮度的指標(biāo)[12]。但是，由于大部分生物胺沒(méi)有熒光和紫外發(fā)色基團(tuán)，因此需經(jīng)衍生化后才能測(cè)量[9]。本研究采用丹磺酰氯柱前衍生的高效液相色譜方法測(cè)定黃驊蝦醬的生物胺含量。

在每個(gè)國(guó)家或地區(qū)，制作蝦醬的原料、發(fā)酵溫度、鹽濃度、pH 值和加工過(guò)程往往不同[13]，因此，每種蝦醬可能具有不同的名稱(chēng)、顏色、理化特性、感官特性以及功能特性。本研究旨在對(duì)黃驊蝦醬的微生物學(xué)和理化特性進(jìn)行系統(tǒng)分析，以評(píng)價(jià)黃驊蝦醬的安全性，并為其傳統(tǒng)發(fā)酵方法的改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蝦醬：5 種，購(gòu)自黃驊海園市場(chǎng)（家庭自制，3 種，分別編號(hào)為XJ1、XJ2、XJ3）和黃驊耀華商廈（工場(chǎng)生產(chǎn)，2種，分別編號(hào)為 XJ4、XJ5）。

伊紅美藍(lán)瓊脂、平板計(jì)數(shù)瓊脂（plate count agar，PCA）、孟加拉紅瓊脂和乳酸細(xì)菌液體（De Man，Rogosa and sharpe，MRS）瓊脂培養(yǎng)基：北京索萊寶科技有限公司。

硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈，色譜純：福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司；1，1，3，3-四乙氧基丙烷（丙二醛乙縮醛）、標(biāo)準(zhǔn)品（組胺二鹽酸鹽，純度≥99%；酪胺鹽酸，純度≥98%；2-苯乙胺，純度 ≥ 98 %；色胺，純度≥ 98 %；尸胺二鹽酸鹽，純度≥98%；腐胺，純度≥98%；精胺，純度≥97%；亞精胺，純度≥98%）、衍生劑（丹磺酰氯，純度≥99%）：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters Breeze 高效液相色譜儀：沃特世公司；3-18K 型高速冷凍離心機(jī)：Sigma 公司；FA-stlab 水分活度測(cè)定儀：法國(guó)GBX 公司；DTD 超聲波清洗機(jī)：寧波新制生物科技股份有限公司；LDZX-50KBS 立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；HD-850 桌上式潔凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；DHP-500 電熱恒溫培養(yǎng)箱：上?？坪銓?shí)業(yè)發(fā)展有限公司；PHS pH 計(jì)：合肥橋斯儀器設(shè)備有限公司；721G 可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海儀電分析儀器有限公司；XHF-DY 高速分散器：山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蝦醬的微生物學(xué)分析

購(gòu)買(mǎi)蝦醬樣品之后，立刻進(jìn)行蝦醬的微生物學(xué)分析[7]。在試管中，將1 g 樣品和9 mL 無(wú)菌生理鹽水混合，震蕩2 min，充分混勻，制成10-1稀釋度的菌懸液；然后，吸取1 mL 10-1菌懸液于9 mL 無(wú)菌生理鹽水中，制成10-2菌懸液，充分混勻；依次作10 倍逐級(jí)稀釋?zhuān)瞥?0-3、10-4菌懸液；通過(guò)傾注平板法進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)分析。PCA 培養(yǎng)基用于菌落總數(shù)測(cè)定；孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基用于計(jì)數(shù)酵母菌和霉菌；伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基用于計(jì)數(shù)致病性腸桿菌[1]；含有 10%NaCl（pH 7.5）的PCA 用于計(jì)數(shù)嗜鹽細(xì)菌；含有1%CaCO3和10%NaCl（pH 7.5）的MRS 瓊脂培養(yǎng)基用于計(jì)數(shù)乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB），計(jì)數(shù)具有透明圈的菌落；含有10%NaCl 和1%酪蛋白酸鈉（pH 7.5）的PCA 用于計(jì)數(shù)水解蛋白的細(xì)菌，計(jì)數(shù)具有透明圈的菌落[2]。對(duì)于酵母菌和霉菌，在30 ℃培養(yǎng)5 d；對(duì)于所有嗜溫性細(xì)菌和致病性腸桿菌，在37 ℃培養(yǎng)2 d；嗜鹽細(xì)菌、乳酸菌和水解蛋白的細(xì)菌，在37 ℃培養(yǎng)5 d。菌落計(jì)數(shù)結(jié)果報(bào)告為每克樣品的菌落形成單位（colony forming units，CFU）的對(duì)數(shù)（lg CFU/g）[1]。所有的平板計(jì)數(shù)進(jìn)行平行試驗(yàn)并做空白對(duì)照以確保準(zhǔn)確性。

1.3.2 蝦醬的理化性質(zhì)分析

1.3.2.1 pH 值測(cè)定

在試管中，將2 g 蝦醬和10 mL 蒸餾水混合，振蕩 2 min，充分混勻，室溫（25 ℃）靜置 5 min，取出上清液，測(cè)定樣品的pH 值，每種樣品測(cè)定3 次以確保準(zhǔn)確性[14]。

1.3.2.2 鹽分測(cè)定

采用直接滴定法（GB/T 5009.39-2003《醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》）。

1.3.2.3 水分含量測(cè)定

采用直接干燥法（GB 5009.3-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)食品中水分的測(cè)定》）。

1.3.2.4 水分活度測(cè)定

采用水分活度儀擴(kuò)散法（GB 5009.238-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)食品中水分活度的測(cè)定》）。

1.3.2.5 丙二醛含量測(cè)定

采用分光光度法（GB 5009.181-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)食品中丙二醛的測(cè)定》）。

1.3.2.6 亞硝酸鹽含量測(cè)定

采用分光光度法（GB 5009.33-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》）。

1.3.2.7 揮發(fā)性鹽基氮測(cè)定

采用自動(dòng)凱氏定氮法（GB 5009.228-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》）。

1.3.2.8 生物胺含量的測(cè)定

采用高效液相色譜法（GB 5009.208-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)食品中生物胺的測(cè)定》）。

1）生物胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。

2）樣品處理：準(zhǔn)確稱(chēng)取蝦醬樣品2.5 g，置于50 mL離心管中；加入25 mL 0.1 mol/L HCl，混勻；在高速分散器內(nèi)16 000 r/min 均質(zhì)1 min；然后，在20 ℃條件下，在離心機(jī)內(nèi)6 500 r/min 離心30 min；過(guò)濾[7]。

3）生物胺的衍生：取1 mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液/濾液于10 mL離心管內(nèi)；加入 200 μL 2 mol/L NaOH、300 μL 飽和NaCO3、1 mL 丹磺酰氯（10 mg/mL 丙酮溶解），黑暗中，40 ℃水浴 45 min；加入 100 μL 氨水，避光反應(yīng) 30 min；最后，用乙腈定容到5 mL。用濾膜（0.22 μm）將上述樣品過(guò)濾至進(jìn)樣瓶，供液相色譜檢測(cè)[7]。

4）高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC） 條件：WondaSil C18色譜柱：5 μm，4.6 mm×250 mm，Tokyo，Japan；流速：0.8 mL/min；柱溫：40 ℃；波長(zhǎng)：254 nm；進(jìn)樣量：20 μL；流動(dòng)相：流動(dòng)相 A為0.1%的乙酸銨，流動(dòng)相B 為乙腈；梯度洗脫程序：0.01 min～10 min，35 %；10 min～15 min，20 %；15 min～30 min，10%；30 min～35 min，35%[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃驊蝦醬的微生物學(xué)分析

2.1.1 蝦醬的菌落總數(shù)分析

黃驊蝦醬中的菌落總數(shù)情況見(jiàn)圖1。

圖1 黃驊蝦醬中的菌落總數(shù)Fig.1 Aerobic bacterial count in Huanghua shrimp paste

菌落總數(shù)是食品安全的一個(gè)重要標(biāo)準(zhǔn)。由圖1 可知，在5 種受試樣品中，只有家庭自制的XJ3 中菌落總數(shù)（5.40 lg CFU/g）大于食品安全標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的水產(chǎn)調(diào)味劑中菌落總數(shù)（5 lg CFU/g）；其它4 種蝦醬均合格，XJ1、XJ2、XJ4 和 XJ5 中菌落總數(shù)分別為 2.81、2.91、0.92、2.44 lg CFU/g，總體來(lái)看，工廠生產(chǎn)的蝦醬中的菌落總數(shù)低于家庭自制的蝦醬。

2.1.2 蝦醬的嗜鹽性細(xì)菌數(shù)量分析

黃驊蝦醬中的嗜鹽性細(xì)菌數(shù)量情況見(jiàn)圖2。

圖2 黃驊蝦醬中的嗜鹽性細(xì)菌數(shù)Fig.2 Halophilic bacteria count in Huanghua shrimp paste

蝦醬屬于高鹽食品。由圖2 可知，5 種受試蝦醬中均含有一定數(shù)量的嗜鹽性細(xì)菌，其中，家庭自制的XJ3中嗜鹽性細(xì)菌數(shù)量最多（6.28 lgCFU/g），其它4 種蝦醬XJ1、XJ2、XJ4 和 XJ5 中的嗜鹽性細(xì)菌數(shù)量分別為1.78、3.04、2.78、1.89 lgCFU/g。Pongsetkul J 等的研究結(jié)果揭示，Kapi 蝦醬中的主要微生物也是嗜鹽性細(xì)菌[2]。有研究表明，恒溫發(fā)酵蝦加工副產(chǎn)物，在高鹽度下，只有耐鹽/嗜鹽性細(xì)菌生長(zhǎng)，有效地抑制了腐敗菌，發(fā)酵的產(chǎn)品更美味[13]。

2.1.3 蝦醬的酵母菌和霉菌數(shù)量分析

黃驊蝦醬中的酵母菌和霉菌數(shù)量情況見(jiàn)圖3。

由圖3 可知，受試黃驊蝦醬樣品中真菌數(shù)量較少，僅在家庭自制的XJ1 和XJ3 中檢出了真菌，數(shù)量分別為0.50 lg CFU/g 和1.66 lg CFU/g，而在其它3 種蝦醬中，沒(méi)有真菌檢出。Cheok C Y 等的研究表明，辣椒蝦醬中的真菌數(shù)也較少，為2.43 lg CFU/g[1]。

圖3 黃驊蝦醬中酵母菌和霉菌數(shù)Fig.3 Yeast and mold counts in Huanghua shrimp paste

2.1.4 蝦醬的致病性腸桿菌數(shù)量分析

黃驊蝦醬中的致病性腸桿菌數(shù)量情況見(jiàn)圖4。

圖4 黃驊蝦醬中致病性腸桿菌數(shù)Fig.4 Pathogenic enterobacteriaceae count in Huanghua shrimp paste

由圖4 可知，在5 種受試的蝦醬樣品中，除了工廠生產(chǎn)的XJ4，其它4 種都有致病性腸桿菌的檢出，XJ1、XJ2、XJ3 和 XJ5 中的致病性腸桿菌數(shù)分別為 1.29、0.63、2.28 lgCFU/g 和 0.50 lgCFU/g，家庭自制的 XJ3 中數(shù)量最高。總體來(lái)看，工廠生產(chǎn)的蝦醬中，致病性腸桿菌數(shù)量少于家庭自制蝦醬。

2.1.5 蝦醬的分解蛋白質(zhì)的細(xì)菌和乳酸菌數(shù)量分析

在受試的5 種蝦醬樣品中，均未檢出乳酸菌和分解蛋白質(zhì)的細(xì)菌。這可能由于樣品為終產(chǎn)品，鹽度較高不利于這些微生物的長(zhǎng)期存活。在以后的試驗(yàn)中，可以采用宏基因組測(cè)序技術(shù)[16]，對(duì)蝦醬進(jìn)行微生物多樣性分析，以更好地了解蝦醬各個(gè)發(fā)酵時(shí)期的微生物區(qū)系組成，分析蝦醬的生物安全性與微生物菌群之間的關(guān)系[17]。

2.2 黃驊蝦醬的理化性質(zhì)分析

2.2.1 蝦醬的一般理化指標(biāo)分析

黃驊蝦醬的一般理化指標(biāo)情況見(jiàn)表1。

由表1 可以看出，5 種受試蝦醬中的食鹽含量都低于國(guó)家安全標(biāo)準(zhǔn)（25%），均為合格。謝主蘭等[18]的研究表明，食鹽添加量為15%～18%的低鹽蝦醬，也具有較好的防腐作用，并利于風(fēng)味物質(zhì)的形成，保持高品質(zhì)特征。受試蝦醬的pH 值均在7.0～8.0 之間，可能是由于蛋白質(zhì)過(guò)度水解，產(chǎn)生生物胺等堿性物質(zhì)，從而使pH 值升高[19]。各蝦醬樣品的水分活度均在0.70～0.90之間，對(duì)一般細(xì)菌的生長(zhǎng)有抑制作用。根據(jù)水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，蝦醬中水分含量應(yīng)≤60%。因此，受試蝦醬的水分含量整體偏高，只有工廠生產(chǎn)的XJ5 在該項(xiàng)目達(dá)標(biāo)。

表1 黃驊蝦醬的一般理化指標(biāo)Table 1 General physicochemical indicators of Huanghua shrimp paste

2.2.2 蝦醬的丙二醛含量分析

黃驊蝦醬中的丙二醛測(cè)定和含量情況分別如圖5和圖6所示。

圖5 丙二醛標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Malonaldehyde standard curve

圖6 黃驊蝦醬中丙二醛的含量Fig.6 Malondialdehyde content in Huanghua shrimp paste

丙二醛含量是衡量油脂氧化程度的一個(gè)重要指標(biāo)。在油脂的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中，丙二醛含量≤0.25 mg/kg，對(duì)于蝦醬中的丙二醛，目前尚無(wú)適用標(biāo)準(zhǔn)。由圖6 可知，家庭自制與工廠生產(chǎn)的蝦醬中都含有丙二醛，XJ1、XJ2、XJ3、XJ4 和 XJ5 中的含量分別為 4.53、0.80、1.55、0.14、0.94 mg/kg，其中家庭自制的 XJ1 含量最高，工廠生產(chǎn)的XJ4 含量最低。整體而言，相對(duì)于工廠生產(chǎn)的蝦醬，家庭自制蝦醬內(nèi)丙二醛含量更高。

2.2.3 蝦醬的亞硝酸鹽含量分析

黃驊蝦醬中的亞硝酸鹽測(cè)定和含量情況分別如圖7 和圖8所示。

圖7 亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 Sodium nitrite standard curve

圖8 黃驊蝦醬中的亞硝酸鹽含量Fig.8 Nitrite content in Huanghua shrimp paste

由圖8 可知，5 種受試蝦醬樣品 XJ1、XJ2、XJ3、XJ4和 XJ5 中的亞硝酸鹽含量分別為 0.18、0.31、0.29、0.24、0.48 mg/kg，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于我國(guó)食品安全標(biāo)準(zhǔn)（30 mg/kg），因此，受試黃驊蝦醬不存在亞硝酸鹽超標(biāo)的問(wèn)題。

2.2.4 蝦醬的揮發(fā)性鹽基氮含量分析

黃驊蝦醬中的揮發(fā)性鹽基氮含量情況如圖9所示。

圖9 黃驊蝦醬中的揮發(fā)性鹽基氮含量Fig.9 Volatile base nitrogen content in Huanghua shrimp paste

揮發(fā)性鹽基氮是動(dòng)物性食品中蛋白質(zhì)分解腐敗變質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)。在綠色食品標(biāo)準(zhǔn)中，我國(guó)農(nóng)業(yè)部對(duì)其規(guī)定的限量是≤150 mg/100 g；對(duì)于蝦醬，目前尚無(wú)明確的適用標(biāo)準(zhǔn)。從圖9 可知，5 種受試蝦醬樣品XJ1、XJ2、XJ3、XJ4、XJ5 中揮發(fā)性鹽基氮含量分別為167、400、401、271、208 mg/100 g。因此，蝦醬中揮發(fā)性鹽基氮的含量還有待降低，以使其更加安全。

2.2.5 蝦醬的生物胺含量分析

黃驊蝦醬中的生物胺含量情況如表2所示。

表2 黃驊蝦醬中的生物胺含量Table 2 The content of bovine serum albumin in Huanghua shrimp paste

美國(guó)食品和藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，除水產(chǎn)品外，其他食品中組胺含量應(yīng)＜50 mg/kg，生物胺總量應(yīng)≤1 000 mg/kg。歐盟規(guī)定，除水產(chǎn)品以外，其他食品（包括肉制品）中組胺含量應(yīng)≤100 mg/kg，酪胺含量應(yīng)限制在 100 mg/kg～800 mg/kg，β-苯乙胺含量應(yīng)＜30 mg/kg。荷蘭乳品協(xié)會(huì)推薦，肉制品中組胺含量應(yīng)限定在100 mg/kg～200 mg/kg。我國(guó)目前只限定了鮮、凍動(dòng)物性水產(chǎn)品中組胺的含量，僅上海市制定了DB 31/2004-2012《食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵肉制品》，其中規(guī)定組胺含量應(yīng)≤100 mg/kg[20]。從表2 可以看出，5 種受試蝦醬樣品中均含有一定量的生物胺；色胺只在家庭自制的XJ3 中檢出，含量為24 mg/kg；精胺、亞精胺和組胺在5種蝦醬中均未檢出；除了XJ1，在其它4 種蝦醬中，均檢出了苯乙胺；在家庭自制的XJ2 和工廠生產(chǎn)的XJ5中，檢出了腐胺，含量分別為445 mg/kg 和13 mg/kg；在家庭自制的XJ1、XJ3 和工廠生產(chǎn)的XJ5 中，檢出了尸胺，含量分別為1、391、152 mg/kg；僅在家庭自制的XJ1 和XJ2 中，檢出了酪胺?？傮w來(lái)說(shuō)，家庭自制的黃驊蝦醬中生物胺含量較高。

3 結(jié)論

在受試黃驊蝦醬的微生物學(xué)特征方面，大多數(shù)樣品菌落總數(shù)合格，數(shù)量在3 lgCFU/g 以下；所有樣品中均存在嗜鹽性細(xì)菌；樣品中酵母菌和霉菌數(shù)量較低，數(shù)量在2 lgCFU/g 以下，且在多數(shù)樣品中未檢出；大多數(shù)樣品中檢出了致病性腸桿菌，數(shù)量在3.16 lgCFU/g以下；所有樣品中未檢測(cè)到乳酸菌和分解蛋白質(zhì)的細(xì)菌。在受試黃驊蝦醬的理化特征方面，所有樣品的食鹽含量合格；pH 值在7.0～8.0 之間；水分活度在0.70～0.90 之間；大多數(shù)樣品的水分含量超標(biāo)，在65%～80%之間；所有樣品中均檢出了丙二醛，含量在5 mg/kg 以下；亞硝酸鹽合格；所用樣品總均含有揮發(fā)性鹽基氮，含量在450 mg/100 g 以下；生物胺普遍存在，總含量均在550 mg/kg 以下。整體而言，在菌落總數(shù)、真菌數(shù)量、致病性腸桿菌數(shù)量、丙二醛、揮發(fā)性鹽基氮和生物胺這些與安全性有關(guān)的指標(biāo)方面，工廠生產(chǎn)的蝦醬優(yōu)于家庭自制的蝦醬。因此，為確保傳統(tǒng)發(fā)酵蝦醬對(duì)消費(fèi)者的安全性，應(yīng)嚴(yán)格注意和規(guī)范生產(chǎn)過(guò)程，包括原料的預(yù)處理、發(fā)酵條件的優(yōu)化、發(fā)酵過(guò)程中有害微生物的控制和有害產(chǎn)物的抑制以及發(fā)酵成品的殺菌。此外，建議有關(guān)部門(mén)對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵蝦醬的品質(zhì)尤其是安全性進(jìn)行全面的監(jiān)督，并盡快制定相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。