預(yù)處理及表面活性劑對(duì)米曲霉固體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶影響的研究

何海燕， 陸秀青， 秦文芳，何雪穎，韋秋艷，覃擁靈*

（1.河池學(xué)院，廣西宜州546300；2.微生物及植物資源開發(fā)利用廣西高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西宜州 546300；3.廣西壯族自治區(qū)糧油質(zhì)量檢驗(yàn)站，廣西南寧 530031）

纖維素是自然界儲(chǔ)量最豐富的聚合物，據(jù)估計(jì)每年生物圈產(chǎn)生纖維素9×109t，是地球含量最豐富的可再生能源物質(zhì) （王超和章超樺，2003）。纖維素在降解前一般都要進(jìn)行預(yù)處理，破壞纖維素的結(jié)晶結(jié)構(gòu)和木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)，提高接觸比表面積和酶對(duì)纖維素的可及性，從而提高纖維素和半纖維素的轉(zhuǎn)化率。目前預(yù)處理技術(shù)主要包括物理法、化學(xué)法、生物法，這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn),可同時(shí)選用多種方法對(duì)纖維素進(jìn)行預(yù)處理（Mohammed 等，2018）。

表面活性劑可以用來提高纖維素的水解率，其中非離子表面活性劑被認(rèn)為是更合適的可提高纖維素水解率的物質(zhì)（周妍等，2015）。研究表明，非離子表面活性劑是多種酶的激活劑，對(duì)酶活性的保護(hù)和增效具有特殊的作用，而Tween（多聚山梨醇酯）系列的表面活性劑作為非離子型表面活性劑的典型代表被廣泛應(yīng)用于試驗(yàn)中（王丹等，2002）。

本試驗(yàn)以前期研究篩選得到的1株高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的米曲霉HML366為出發(fā)菌株，以甘蔗渣為原料，采用固態(tài)發(fā)酵的方法，向不同濃度酸堿處理的甘蔗渣粉末中加入不同濃度的化學(xué)表面活性劑Tween 80，研究不同預(yù)處理方法及表面活性劑對(duì)米曲霉HML366固體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)室保存的HML366米曲霉菌種，粉碎后過80目篩的甘蔗渣（廣西河池市宜州博慶糖業(yè)公司）。

1.2 試劑 0.05 mol/L、pH 4.5的檸檬酸緩沖溶液 （Smettem，1987）；3，5- 二 硝 基 水 楊 酸 溶 液（DNS）（Ghose，1987）；Mandels溶液 （Mandels等，1976）；0.5 mg/mL BSA的配制：先完全溶解牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（5 mg/L BSA），從中取 10 μL 并用0.9%NaCl稀釋標(biāo)準(zhǔn)品至100 μL，充分混勻；濃度為1 mol/L的葡萄糖；0.9%生理鹽水；濃度為0.2%、0.5%、1.0%的 Tween 80； 濃度為 2%、5%、10%的氨水；濃度為2%、5%、10%的乙酸。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 DNS濾紙酶活力檢測(cè) 根據(jù)林英等（2006）、趙春玲等（2006）的方法檢測(cè) DNS 濾紙酶活力。一個(gè)酶活力國(guó)際單位（U）表示在標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下1 min轉(zhuǎn)化1 μmol底物所需要的酶量（管斌和丁友，1999）。

1.3.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 根據(jù)張樹政（1984）的方法以葡萄糖含量（mg）為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的540 nm波長(zhǎng)吸光度值為縱坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.3 制備培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂 （PDA）培養(yǎng)基根據(jù)沈萍和陳向東（2007）的方法進(jìn)行配制。將實(shí)驗(yàn)室保存的HML366米曲霉菌種，PDA斜面培養(yǎng)基30℃恒溫培養(yǎng)3 d。

1.3.4 甘蔗渣酸堿預(yù)處理 乙酸處理：稱取6 g過80目篩的甘蔗渣粉末于250 mL的三角瓶中，加入40 mL的乙酸水溶液浸泡24 h，8層紗布過濾進(jìn)行固液分離，蒸餾水洗去殘留在濾渣中的乙酸，烘干之后進(jìn)行纖維素酶解試驗(yàn)。

氨水處理：稱取6 g過80目篩的甘蔗渣粉末于250 mL的三角瓶中，分別加入40 mL的氨水溶液浸泡24 h，8層紗布過濾進(jìn)行固液分離，蒸餾水洗去殘留在濾渣中的氨水，烘干之后進(jìn)行纖維素酶解試驗(yàn)。

1.3.5 固體發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基 6 g經(jīng)處理過的蔗渣，4 g麩皮，0.5 mL的 Tween 80，向固體培養(yǎng)基中加入 30 mL Mandels溶液，121℃滅菌 20 min，待接種時(shí)使用。

1.3.6 接種及固體培養(yǎng)基產(chǎn)酶培養(yǎng) 在無菌超凈工作臺(tái)中將一支活化的米曲霉試管種用10 mL生理鹽水洗下制成孢子液。取107個(gè)孢子轉(zhuǎn)入固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，再將接種后的固體產(chǎn)酶培養(yǎng)基放入30℃恒溫?fù)u床中，培養(yǎng)4 d。

酶液的提?。簭暮銣?fù)u床中取出固體產(chǎn)酶培養(yǎng)基，加入50 mL蒸餾水，30℃恒溫?fù)u床1h，8層紗布過濾，4000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液，4℃冰箱中保存（赫志軍和李忠興，2002）。

1.3.7 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 用考馬斯亮藍(lán)染色法（Bradford 法）[蛋白質(zhì)定量試劑盒（碧云天）]測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：在試管中分別精確移取牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.5 mg/mL BSA）0、1、2、4、8、12、16、20 μL， 加 0.9%NaCl至 20 μL，然后在各支試管中分別加入200 μL Bradford染色液，搖勻，在595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（李建武等，1994），以牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）。

圖2 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度的Tween 80對(duì)產(chǎn)酶的影響 試驗(yàn)結(jié)果顯示，1號(hào)管為未添加表面活性劑的空白對(duì)照管，2、3、4 號(hào)管為添加 0.4%、0.8%、1.2%Tween 80的 3管， 濾紙酶活分別為 1.02、2.75、2.81、2.49 U/mL。試驗(yàn)中可以明顯的觀察到2、3、4號(hào)管顏色均比1號(hào)管深，說明試驗(yàn)所得酶液具有一定的催化活性，且2、3號(hào)管顏色逐漸加深，濾紙酶活也逐漸增大，但4號(hào)管的濾紙酶活卻比3號(hào)管的小，說明Tween 80可以增加酶的產(chǎn)量，提高酶活，但濃度提高到1.2%時(shí)抑制了部分酶活。

2.2 不同濃度的Tween 80對(duì)預(yù)處理蔗渣產(chǎn)酶的影響 由圖3可以看出，加入不同濃度的Tween 80對(duì)經(jīng)5%氨水和乙酸處理過的蔗渣濾紙酶活的影響較為顯著，蔗渣經(jīng)5%氨水處理后，添加0.8%Tween 80的濾紙酶活可達(dá)到6.6 U/mL。蔗渣經(jīng)5%乙酸處理后，添加0.8%Tween 80的濾紙酶活為6.3 U/mL。經(jīng)10%乙酸處理過的蔗渣，添加0.8%Tween 80的濾紙酶活為 6.1 U/mL。當(dāng)Tween 80濃度增加到1.2%時(shí)，濾紙酶活有所下降。其他處理方式結(jié)果相近。

圖3 不同濃度的Tween 80對(duì)預(yù)處理蔗渣產(chǎn)酶的影響

2.3 發(fā)酵液中蛋白質(zhì)含量結(jié)果分析 由圖4可以看出，加入不同濃度的Tween 80對(duì)經(jīng)5%氨水和乙酸處理過的蔗渣產(chǎn)蛋白質(zhì)的影響較為顯著，蔗渣經(jīng)5%氨水處理后，添加0.8%Tween 80時(shí)，蛋白質(zhì)含量最高為14.6 mg/mL，空白對(duì)照組的蛋白質(zhì)含量為4.0 mg/mL，提高了3.65倍。蔗渣經(jīng)5%乙酸處理后，添加0.8%Tween 80的蛋白質(zhì)含量可以達(dá)到12.6 mg/mL。經(jīng)10%乙酸處理過的蔗渣，添加0.8%Tween 80的蛋白質(zhì)含量可以達(dá)到11.0 mg/mL。產(chǎn)蛋白質(zhì)較多的處理方式，對(duì)應(yīng)酶活也較高。所有不同方法預(yù)處理的蔗渣材料，添加0.4%～0.8%的表面活性劑時(shí)蛋白質(zhì)含量相對(duì)較高，增加到1.2%時(shí)，含量有所減小，與濾紙酶活檢測(cè)結(jié)果相對(duì)應(yīng)。

圖4 不同預(yù)處理后發(fā)酵液中蛋白質(zhì)含量

3 討論

本試驗(yàn)以米曲霉HML366為出發(fā)菌株，研究不同預(yù)處理方法及表面活性劑對(duì)米曲霉固體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的影響。蔗渣經(jīng)5%氨水、5%乙酸、10%乙酸處理后，添加0.8%Tween 80的濾紙酶活分別可以達(dá)到6.6、6.3 U/mL和6.1 U/mL。當(dāng)Tween 80濃度增加到1.2%濃度時(shí)，濾紙酶活有所下降。預(yù)處理過的蔗渣及添加Tween 80經(jīng)發(fā)酵后，其發(fā)酵液中蛋白質(zhì)含量較高，酶活較高。

添加有Tween 80到未處理的甘蔗渣發(fā)酵后的濾紙酶活比未添加Tween 80也未處理的發(fā)酵液濾紙酶活高，蛋白質(zhì)含量高，說明表面活性劑Tween 80對(duì)產(chǎn)纖維素酶合成有促進(jìn)作用。蔗渣經(jīng)過預(yù)處理發(fā)酵液的濾紙酶活比未處理過的高。加入較多表面活性劑抑制了部分酶活力,可能是過量加入表面活性劑會(huì)使表面活性劑聚合成為膠束，表面張力不能進(jìn)一步下降或者是表面活性劑的濃度過大時(shí)，膜可以解體，透性大增，使細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)大量外滲，加上細(xì)胞內(nèi)各細(xì)胞器膜被破壞，各種代謝失調(diào)甚至死亡，產(chǎn)酶活力受到抑制。Tween 80在培養(yǎng)基中的用量為0.4%時(shí)對(duì)產(chǎn)酶有顯著的促進(jìn)作用，用量提高到0.8%酶活有所提高，所以Tween 80在培養(yǎng)基中的用量以0.4%～0.8%為佳。

表面活性劑在產(chǎn)酶過程中往往有特殊的作用，因而在酶劑工業(yè)常常得到應(yīng)用，其主要作用是提高細(xì)胞質(zhì)膜的通透性，有利于胞外酶的不斷排出（姚蘭等，2012）。表面活性劑可以降低纖維素的表面張力，提高纖維素這種高分子聚合物的親水性，使其更易與纖維素酶結(jié)合,提高酶的降解效率。此外表面活性劑還降低了溶液的表面張力，從而使纖維素酶在整個(gè)反應(yīng)體系中分散得更均勻，并能促進(jìn)酶與底物的結(jié)合，因此可以提高纖維素酶活力。

本文通過研究表面活性劑協(xié)同酸堿預(yù)處理對(duì)木質(zhì)纖維素原料的作用效果，通過添加非離子表面活性劑Tween 80的方法來阻止木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的無效吸附，從而提高纖維素酶的催化活性，探究表面活性劑對(duì)纖維素酶催化的作用機(jī)制，充分利用甘蔗渣等豐富而又廉價(jià)的資源來生產(chǎn)乙醇，降低生產(chǎn)成本，具有良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。