駝絨藜和苜蓿對(duì)蘇尼特羊增重及瘤胃細(xì)菌區(qū)系的影響

楊 鼎，祁云霞，王曉娟，伊風(fēng)艷，吳江鴻,3*

（1.中國科學(xué)院內(nèi)蒙古草業(yè)研究中心，內(nèi)蒙古呼和浩特 010031；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010031；3.內(nèi)蒙古民族大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼028000）

駝絨藜（Ceratoides Latens，CL）又名優(yōu)若藜，屬多年生半灌木，分布較廣，具有適應(yīng)性強(qiáng)、利用年限長、耐旱、耐寒和耐牧性強(qiáng)等優(yōu)良特性，駝絨藜種植面積達(dá)73.33 km2，每年可提供鮮駝絨藜數(shù)百萬噸，是一種很可觀的飼草資源，利用前景廣闊[1]。苜蓿（Alfalfa）是世界上種植面積較大的一種多年生豆科牧草，由于其具有產(chǎn)草量高、營養(yǎng)豐富、適口性好、易于家畜消化等特點(diǎn)，被譽(yù)為“牧草之王”[2]。與苜蓿相比，駝絨藜纖維含量高而蛋白含量低，在營養(yǎng)成分和產(chǎn)量上都處于劣勢(shì)，但駝絨藜適宜在干旱半干旱、水肥條件差的地區(qū)大面積生長，這對(duì)保護(hù)當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)和降低飼草成本具有重要意義。

瘤胃的消化作用主要依賴于瘤胃內(nèi)復(fù)雜多樣的微生物[3]。不同的飲食結(jié)構(gòu)可直接影響腸道中的微生物，而微生物種類的差異可以反向影響宿主的營養(yǎng)吸收[4]。在舍飼條件下，飼料種類都比較單一，可能導(dǎo)致羊只營養(yǎng)不良。通過牧草組合調(diào)整瘤胃微生物的菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)而達(dá)到或近乎于放牧條件下的菌群結(jié)構(gòu)，可提高舍飼羊的肉品質(zhì)[5]。雖然不同牧草間存在組合效應(yīng)，但研究單一牧草對(duì)瘤胃微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響是解決上述問題的基礎(chǔ)。

蘇尼特羊是優(yōu)良的地方蒙古綿羊品種，素以肉質(zhì)細(xì)嫩味道鮮美而聞名。然而舍飼養(yǎng)殖后羊肉品質(zhì)發(fā)生了改變，因此亟待闡明營養(yǎng)物質(zhì)影響肉品質(zhì)的分子機(jī)制。本研究選取遺傳背景相同的蘇尼特雙胞胎羔羊（降低個(gè)體差異，縮小樣本量），飼喂駝絨藜和苜蓿2 種顆粒飼料后對(duì)羊瘤胃液中細(xì)菌的16S rDNA 進(jìn)行高通量測(cè)序，比較飼喂不同飼料的綿羊瘤胃細(xì)菌區(qū)系的差異性，為在舍飼條件下通過牧草組合調(diào)整瘤胃微生物的菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)而達(dá)到或近乎于放牧條件下的菌群結(jié)構(gòu)奠定數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 飼料原料及成分 華北駝絨藜和紫花苜蓿均收獲于2014 年9 月中旬四子王旗，營養(yǎng)成分見表1。試驗(yàn)日糧粗飼料與精飼料比為3∶1，精料為內(nèi)蒙古正大有限公司的成品羊飼料（冬春寶精補(bǔ)料），粗飼料為華北駝絨藜和苜蓿，把粗飼料粉碎（80 目）與精料按比例混勻，加工成直徑8 mm 顆?；旌先占Z，2 種顆粒飼料的營養(yǎng)成分見表2。駝絨藜顆粒料的酸性洗滌纖維、中性洗滌纖維都高于苜蓿顆粒料，粗蛋白質(zhì)含量低于苜蓿顆粒料。

表1 駝絨藜與苜蓿干草營養(yǎng)成分 %

表2 駝絨藜與苜蓿顆粒飼料的營養(yǎng)成分 %

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼養(yǎng)管理 選取4 對(duì)（共8 只）3 月齡、（25±3）kg 雙胞胎蘇尼特母羊分為2 組，分別記為駝絨藜組（A1、B1、C1、D1）、苜蓿組（A2、B2、C2、D2），飼喂試驗(yàn)在內(nèi)蒙古康輝牧業(yè)第六牧場(chǎng)進(jìn)行。預(yù)試期15 d，正試期96 d。

試驗(yàn)羊按不同處理在封閉式棟舍單圈舍飼，每天飼喂3 次（07：00、12：00、19：00）， 試 驗(yàn) 期前20 d 每 只羊每次精確喂1.8 kg/d 全混顆粒日糧，之后每10 d 每只羊增加飼喂相應(yīng)顆粒日糧0.3 kg，保證試驗(yàn)期內(nèi)所有羊均自由采食。免疫、驅(qū)蟲、藥浴及疫病防治等按常規(guī)正常進(jìn)行，自由飲水。每試驗(yàn)組添加羊舔磚1 塊（防止微量元素缺乏）。飼喂期間對(duì)每只試驗(yàn)羊定期稱重，組間增重趨勢(shì)由Excel 計(jì)算每次稱重平均值以及標(biāo)準(zhǔn)誤差繪制而成。飼喂試驗(yàn)結(jié)束后，屠宰所有試驗(yàn)羊，采用4 層紗布過濾法立即將瘤胃固態(tài)內(nèi)容物樣品放入液氮保存，并送往北京百邁克生物科技有限公司，進(jìn)行16S rRNA 基因測(cè)序。

1.3 16S rRNA 基因組文庫的構(gòu)建 參照OMEGA DNA Kit試劑盒說明，抽提1.2 所取樣品細(xì)菌基因組DNA，根據(jù)細(xì)菌V3-V4 區(qū)通用引物：338F（5'-ACTCCTACGGGAGGC AGCA-3'）、806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'），合并引物接頭，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增并對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行純化、定量和均一化形成測(cè)序文庫，質(zhì)檢合格的文庫用Illumina MiSeq PE300 測(cè)序。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 首先對(duì)原始測(cè)序序列進(jìn)行質(zhì)控過濾[6]：根據(jù)PE reads 之間的Overlap 關(guān)系，將Miseq 測(cè)序得到的雙端序列數(shù)據(jù)拼接（Merge）成1 條序列Tags，同時(shí)對(duì)Reads 的質(zhì)量和 Merge 的效果進(jìn)行質(zhì)控過濾。①PE reads 拼接：使用 FLASH（v1.2.7）軟件，按照最小overlap 長度10 bp，overlap 區(qū)允許的最大錯(cuò)配比率為0.2，對(duì)每個(gè)樣品的reads 進(jìn)行拼接，得到的拼接序列即原始Tags 數(shù)據(jù)（Raw Tags）；②Tags 過濾：使用Trimmomatic（v0.33）軟件，對(duì)拼接得到的Raw Tags 進(jìn)行過濾，參數(shù)為設(shè)置 50 bp 的窗口，如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20，從窗口開始截去后端堿基，過濾質(zhì)控后長度小于Tags 長度75%的Tags，得到高質(zhì)量的Tags 數(shù)據(jù)。雙端拼接，得到優(yōu)化序列Tags[7]，使用UCHIME[8]軟件鑒定并去除嵌合體序列，利用QIIME軟件[9]中的UCLUST[10]對(duì)97% 相似度的Tags 進(jìn)行聚類并獲得OTU，并基于Silva（V132）分類學(xué)數(shù)據(jù)庫對(duì)OTU 進(jìn)行微生物分類學(xué)注釋。

基于OTU 分析結(jié)果，對(duì)樣品在各個(gè)分類水平上進(jìn)行分類學(xué)Alpha 多樣性及Beta 多樣性分析。包括利用Qiime 軟件繪制稀釋性曲線[11]，應(yīng)用軟件Mothur中的summary.single 命令和metastats 命令，分別計(jì)算Chaol、ACE、Shannon、Simpson 參數(shù)和兩組之間的差異顯著性分析。此外，將所有細(xì)菌按分類學(xué)統(tǒng)計(jì)并利用Unifrac 算法通過R 語言工具繪制樣品間主坐標(biāo)分析圖（PCoA），以及組間多樣性分析。

2 結(jié) 果

2.1 不同飼料對(duì)蘇尼特羊增重效果的影響 由圖1 可見，飼喂苜蓿的羔羊增重達(dá)到0.19 kg/d，顯著高于駝絨藜組（P＜0.001）。

2.2 不同飼料組的瘤胃細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化 對(duì)16S rRNA 基因測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接和質(zhì)控過濾，8 份樣品共產(chǎn)生Tags 868 901 條，平均每個(gè)樣品產(chǎn)生108 613 條Tags。所有8 只羊瘤胃細(xì)菌種類在門分類學(xué)水平上共包括12 個(gè)門（圖2、圖3），擬桿菌門和厚壁菌門是受飼料影響最大的2 類細(xì)菌。其中，飼喂駝絨藜的擬桿菌門占70.1%、厚壁菌門19.3%；而飼喂苜蓿后擬桿菌門升高到86.5%，厚壁菌門降至9.0%。

圖1 不同飼料對(duì)蘇尼特羊增重效果的影響

圖2 飼喂駝絨藜顆粒飼料瘤胃細(xì)菌在門分類水平上的比例

圖3 飼喂苜蓿顆粒飼料瘤胃細(xì)菌在門分類水平上的比例

在屬分類學(xué)水平上，8 只羊瘤胃細(xì)菌種類共包括28 個(gè)屬的細(xì)菌。2 組樣品中相對(duì)豐度最大的可培養(yǎng)細(xì)菌為普雷沃菌和腸道RC9 菌（圖4），其中飼喂駝絨藜的普雷沃菌平均豐度為32.6%，顯著小于苜蓿的平均豐度60.24%（P=0.028）；而腸道RC9 菌在2 種飼料飼喂下沒有顯著差異。Shannon 值顯示，飼喂駝絨藜可以顯著提高瘤胃中細(xì)菌的多樣性（P＜0.01）（表3）。

對(duì)多樣品進(jìn)行Beta 多樣性分析，主坐標(biāo)分析（PCoA）可以發(fā)現(xiàn)飼喂駝絨藜的樣品點(diǎn)與飼喂苜蓿的樣品點(diǎn)被明顯分成2 個(gè)部分（圖5），即2 組處理造成組間樣品細(xì)菌多樣性的差異較大。組間樣品線性判別分析效能值（LDA Effect Size，LEfSe）分析[12]顯示，對(duì)駝絨藜組來說，影響其瘤胃微生物菌群結(jié)構(gòu)的且豐度有顯著差異的菌種有11 種，而對(duì)苜蓿組影響其細(xì)菌組成的且豐度有顯著差異種類僅有5 種（圖6）。

圖4 樣品屬分類水平上物種分布柱狀圖

表3 Alpha 多樣性指數(shù)

圖5 飼喂不同飼料的羊瘤胃內(nèi)容物樣品間主坐標(biāo)分析

圖6 不同飼料飼喂下羊瘤胃內(nèi)容物樣品豐度差異細(xì)菌分布圖

3 討 論

羊瘤胃中細(xì)菌種類豐富，其中優(yōu)勢(shì)菌群在營養(yǎng)代謝中起主要作用。本研究中，飼喂2 種飼料后瘤胃菌群結(jié)構(gòu)中含量最多的細(xì)菌種類依然是厚壁菌門和擬桿菌門。韓旭峰[13]研究發(fā)現(xiàn)，擬桿菌門和厚壁菌門是不同精粗比日糧處理組的陜北白絨山羊瘤胃內(nèi)含量最多的2 種細(xì)菌。擬桿菌門在瘤胃代謝中具有重要的作用。Kang 等[14]應(yīng)用16S rRNA 構(gòu)建文庫研究瘤胃微生物發(fā)現(xiàn)，擬桿菌門的細(xì)菌占到總RNA 的30%左右。Han 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，80～100 d 的羔山羊腸道微生物主要為厚壁菌門和互養(yǎng)菌門，但當(dāng)羔羊長到110 d 時(shí)主要腸道微生物為厚壁菌門和擬桿菌門，斷奶可改變腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)。本研究中，羊瘤胃內(nèi)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為厚壁菌門和擬桿菌門，而改變?nèi)占Z結(jié)構(gòu)可以直接影響菌群含量及比例，這與前人研究結(jié)果一致。

瘤胃厚壁菌門和擬桿菌門對(duì)飼糧中纖維和蛋白比例有一定的選擇性。Kim 等[16]和Petri 等[17]發(fā)現(xiàn)，采食高粗料飼糧的肉牛糞便和瘤胃中的擬桿菌門含量比采食高谷物飼糧的肉牛顯著降低。由于駝絨藜纖維素較高，使得本研究中飼喂駝絨藜的羊瘤胃內(nèi)厚壁菌門的豐度有所提高，其中瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的相對(duì)豐度也較飼喂苜蓿的羊高，而擬桿菌門的相對(duì)豐度有降低趨勢(shì)，這一結(jié)果與Kim 等[16]的結(jié)論一致。

厚壁菌門主要分解纖維類物質(zhì)，擬桿菌門則在非纖維物質(zhì)的降解中發(fā)揮重要作用[18]。瘤胃內(nèi)纖維素降解菌種類豐富，主要包括厚壁菌門的瘤胃球菌、溶纖維丁酸弧菌和梭菌屬以及產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌等[3]。其中瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌被認(rèn)為是主要的纖維分解細(xì)菌[19-20]。究其原因主要是瘤胃球菌可以產(chǎn)生大量纖維素酶和半纖維素酶以分解植物纖維[21]。產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌能產(chǎn)生大量的多糖酶，但不能降解木聚糖，也是重要的纖維素降解菌[3]。擬桿菌門由于能夠合成降解植物多聚糖酶，具有一定降解纖維素的能力[22-23]。大多數(shù)的瘤胃細(xì)菌都具有降解蛋白的活性，其中研究最多的是嗜淀粉瘤胃桿菌、溶纖維丁酸弧菌和棲瘤胃普雷沃菌，其中目前已知的數(shù)量最多的降解菌是棲瘤胃普雷沃菌[3]。普雷沃菌可大量產(chǎn)生降解二肽鍵酶IV，具有降解寡肽活性，因此在瘤胃蛋白代謝中具有重要作用[24]。本研究中，飼喂蛋白質(zhì)含量較高的苜蓿時(shí)，瘤胃菌群結(jié)構(gòu)中普雷沃菌（屬擬桿菌門）具有最高的相對(duì)豐度，而其在駝絨藜組則維持在一個(gè)很低的水平。擬桿菌門中豐度較高的細(xì)菌還包括腸道RC9 菌。有研究表明，提高飼料中蛋白質(zhì)含量對(duì)于腸道RC9 菌有激增的作用[25]。本研究中腸道RC9 菌在2 種飼料飼喂下瘤胃菌群結(jié)構(gòu)中都具有較高的豐度，推測(cè)是由2 種飼草都含有較高的粗蛋白質(zhì)所致。

蛋白質(zhì)含量高的飲食結(jié)構(gòu)不僅降低了腸道細(xì)菌多樣性，還對(duì)動(dòng)物的增肥起到了促進(jìn)作用。Ley 等[26]對(duì)1對(duì)肥胖和消瘦的雙胞胎腸道微生物進(jìn)行宏基因組研究發(fā)現(xiàn)，與消瘦個(gè)體相比，肥胖個(gè)體的腸道細(xì)菌多樣性降低且細(xì)菌豐度發(fā)生變化。De Filippo 等[27]通過研究非洲貧窮地區(qū)兒童（以高纖維素食物為主）和歐洲發(fā)達(dá)國家兒童（以高蛋白食物為主）腸道微生物多樣性變化，發(fā)現(xiàn)非洲兒童的腸道微生物多樣性要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于歐洲兒童，而歐洲兒童多易超重；此外，超重人群的腸道微生物多樣性也要明顯低于正常體重人群。

快速增肥和提高肉品質(zhì)是畜牧業(yè)的兩大目標(biāo)，但二者往往不能兼得。舍飼羊的優(yōu)點(diǎn)是家畜出欄快，增肥效果明顯但肉品質(zhì)差；放牧羊盡管增肥慢出欄周期長，但牧草種類可以影響肉羊生長率、胴體重，還可以影響肉的風(fēng)味[28]，以致其味道鮮美得到越來越多消費(fèi)者的青睞，羊肉價(jià)格也比舍飼羊高。舍飼和放牧的主要差別就是飼糧組成，舍飼單一，而放牧多樣化。本研究結(jié)果表明，增重效果較好的飼喂苜蓿組在瘤胃細(xì)菌多樣性上卻低于飼喂駝絨藜組。由此可以假想，放牧羊與舍飼羊是因采食不同品種飼草導(dǎo)致羊瘤胃微生物多樣性的不同，進(jìn)而改變了營養(yǎng)物質(zhì)的多樣化最終影響羊肉品質(zhì)。即飼草品種越多樣，羊瘤胃微生物越多樣，羊肉品質(zhì)越好。此外，一個(gè)較高的羊瘤胃微生物多樣性可以營造一個(gè)較穩(wěn)定的瘤胃微生態(tài)環(huán)境，有利于抵抗外來病原微生物的入侵。生產(chǎn)中可以針對(duì)不同生產(chǎn)目的，對(duì)日糧結(jié)構(gòu)進(jìn)行調(diào)整。如快速出欄的育肥羊可以適當(dāng)加大苜蓿的比例快速增肥，而懷孕母羊可以適當(dāng)增加駝絨藜等高纖維飼草的比例。

4 結(jié) 論

飼喂苜蓿一類高蛋白飼草能夠促進(jìn)羊增肥，但降低了羊瘤胃細(xì)菌多樣性，瘤胃優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為擬桿菌門，優(yōu)勢(shì)菌種為普雷沃菌；而飼喂駝絨藜一類高纖維飼料對(duì)羊的增肥效果不明顯，但提高了瘤胃細(xì)菌多樣性和微生態(tài)環(huán)境，可能更有利于羊群健康。