譚志承 薛 鵬 許 瑾 唐順明 沈興家

(1江蘇科技大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，江蘇省蠶桑生物學(xué)與生物技術(shù)重點實驗室，江蘇鎮(zhèn)江 212018；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蠶桑遺傳改良重點實驗室，江蘇鎮(zhèn)江 212018)

“飲食有節(jié)，方能百歲，飲食自倍，腸胃乃傷”，自古以來，飲食限制一直作為一種既能延長壽命又能改善生活質(zhì)量的方法[1]。飲食限制又稱熱量限制(calorie restriction，CR)，是指在保證生物體不發(fā)生營養(yǎng)不良的條件下限制食量，達(dá)到延長壽命的效果，并且能有效地防止生物功能惡化，防治和延緩與老齡相關(guān)疾病的發(fā)生[2]。1935年，MCCAY等[3]提出了著名的“麥卡效應(yīng)”，即減少大鼠正常食量的30%～50%能顯著延長大鼠壽命。迄今為止，研究者先后在酵母、果蠅和靈長類動物等多種生物體中觀察到CR不同程度誘導(dǎo)壽命延長的現(xiàn)象[4]。CR的這種作用，可降低癌癥、神經(jīng)退行性疾病、自身免疫性疾病、心血管疾病和2型糖尿病等與年齡相關(guān)疾病的發(fā)生。隨著全球人口老齡化問題的日益嚴(yán)重，關(guān)于CR機(jī)制的探索也成為了生命科學(xué)中長久不衰的研究熱點。研究者們分別從能量代謝、氧化應(yīng)激、炎癥和自噬等生理生化水平進(jìn)行探索研究[5]，發(fā)現(xiàn)飲食限制的生物機(jī)體氧自由基生成與氧化損傷減少,血糖水平、非酶糖基化、代謝速率降低,代謝潛力保持[6]。到目前為止，長壽分子水平的研究已有突破性的認(rèn)識，長壽相關(guān)基因的研究結(jié)果逐步揭示了生理功能、代謝途徑等對長壽的重要影響[7]。胰島素受體底物1-B基因(chico)是胰島素/胰島素樣生長因子通路(IGF-1)表達(dá)調(diào)控的一員，此信號通路被證明是第1個得以驗證在不同物種中調(diào)控壽命的分子信號通路；組蛋白去乙酰酶基因(rpd3)所在的組蛋白去乙酰酶(sirtuins)通路能介導(dǎo)飲食限制下的壽命延長[8]；脂代謝激素2基因(Akh2)調(diào)控糖代謝能直接參與營養(yǎng)和能量代謝，從而影響生物體的壽命[9-10]。家蠶(Bombyxmori)是世界上最重要的大規(guī)模人工飼養(yǎng)的經(jīng)濟(jì)昆蟲，也是重要的鱗翅目模式生物，它的生命周期短、子代多、遺傳背景清楚，是研究延長壽命機(jī)制的良好模型動物。KELLOGG等[11]最早開展了家蠶限食與壽命關(guān)系的研究，通過節(jié)律性地控制給桑次數(shù)使幼蟲的壽命延長。1984年，王德厚[12]報道了不同程度的限食對家蠶壽命的影響，發(fā)現(xiàn)在一定范圍內(nèi)，給食量越少，家蠶壽命越長；在不同發(fā)育階段限食，都能使幼蟲壽命延長，連續(xù)限食者延壽幅度更大。2010年，孔祥賓[13]調(diào)查證明，限食和家蠶胰島素信號系統(tǒng)基因的表達(dá)密切相關(guān)。同時，有研究者指出限食處理對家蠶幼蟲絲氨酸蛋白酶基因(SPs)與絲氨酸蛋白酶抑制劑基因(serpins)表達(dá)敏感性有所不同，暗示限食對家蠶不同組織的影響有差異[14]。但是對限食為何能延長家蠶壽命，相關(guān)的長壽基因是如何調(diào)控壽命長短，至今尚不清楚。

本試驗選取家蠶二化性品系秋豐為材料，研究食量限制對家蠶的體質(zhì)量、壽命、生理生化指標(biāo)、壽命相關(guān)基因表達(dá)水平和生育繁殖能力的影響，為人類健康飲食研究提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試家蠶品系 本試驗所用家蠶品系為秋豐，二化性，斑紋限性(雌蠶為普斑，雄蠶為素蠶),由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所育成并保存提供。

1.1.2 主要試劑 總RNA提取試劑(RNAiso Plus)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量SYBR@Premix Ex TaqTM試劑盒，均為寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司產(chǎn)品；超氧化物歧化酶、可溶性蛋白[含聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA，試劑盒中試劑A和試劑B共同配制而成的工作液)和蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液]、海藻糖、丙二醛檢測試劑盒，均為蘇州科銘生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；過氧化氫酶檢測試劑盒，為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 LightCycler?96實時熒光定量PCR儀，為Roche公司(美國)產(chǎn)品；UV-2600紫外分光光度計，為島津儀器(蘇州)有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 家蠶限食模型的建立與限食對食下量、體質(zhì)量和壽命的影響調(diào)查 秋豐越年蠶種(解除滯育)或浸酸處理后的蠶種，25 ℃室內(nèi)自然光照催青。孵化后單蛾或雙蛾混合收蟻，25±1 ℃室內(nèi)自然光照下新鮮桑葉飼養(yǎng)，從2齡開始將幼蟲隨機(jī)分為2組，一組自由采食(ad libitum feeding，簡稱AL組)，每日給桑2次，保持24 h自由進(jìn)食時間；另一組限制給食(detary restriction，簡稱DR組)，每日給桑1次，保持16 h自由進(jìn)食時間，即停食8 h，給食量以AL組食量的60%為宜。自4齡起按照斑紋將2組幼蟲雌雄分開飼養(yǎng)，每組雌雄蠶各3個重復(fù)，每個重復(fù)30頭蠶。后續(xù)研究均以此為模型。調(diào)查每日食下量、體質(zhì)量、齡期經(jīng)過等。

食下量調(diào)查：按“食下量=每日給桑量-幼蟲未食完的余桑量”公式計算食下量。其中，余桑量為折算成的鮮桑葉量。每次喂食前留取10 g鮮桑葉，至下次喂食前稱量，作為余桑量折算成鮮桑葉量的指標(biāo)[13]。

體質(zhì)量調(diào)查：2齡、3齡幼蟲體質(zhì)量在蛻皮完成眠起時稱量；4～5齡幼蟲每天稱量體質(zhì)量；化蛹第3天稱量體質(zhì)量。

齡期經(jīng)過調(diào)查：幼蟲期每個齡期經(jīng)過為上一齡期蛻皮完成至下一齡期蛻皮完成；蛹期經(jīng)過為熟蠶結(jié)繭至羽化為成蟲；成蟲期經(jīng)過為羽化至成蟲死亡。本文家蠶壽命為幼蟲期經(jīng)過、蛹期經(jīng)過和成蟲期經(jīng)過時間之和，即從幼蟲孵化到成蟲死亡的時間。

繁殖能力調(diào)查：采用雌蛾交尾后造卵數(shù)(產(chǎn)出卵和未產(chǎn)出卵之和)，雄蛾一次交尾、二次交尾是否正常來初步評估家蠶繁殖能力。

1.2.2 家蠶壽命相關(guān)基因的表達(dá)分析 分別取AL組和DR組家蠶5齡3 d的雌和雄幼蟲頭部、中腸、表皮、血淋巴、精巢/卵巢、絲腺、馬氏管和脂肪體，提取總RNA。采用相對定量方法(qPCR)，每組3次重復(fù)，分析不同給食條件下Bmchico(GeneID：101745072)、Bmrpd3(Gene ID：101744526)、BmAkh2(GeneID：100174839)基因的表達(dá)水平變化(表1)[13]。

表1 qRT-PCR引物

引物引物序列 (5′-3′)BmchicoF:TACCGAACCTCTGCTACCCATR:CCGTCGTAGTCTGCCTTCCGABmrpd3F:ATGCTGTAAATATACCCCTTCGTR:TCGTAAGTCCAACAGCGAGABmAkh2F:TACTTGTGTTGATTCTGTCCGR:TCTTCAGAGGAGCATCCATCGActin3F:CGGCTACTCGTTCACTACCR:CCGTCGGGAAGTTCGTAAG

1.2.3 家蠶部分生理生化指標(biāo)的檢測 分別取AL組和DR組家蠶5齡期雌雄幼蟲，酒精擦拭后尾足取血淋巴，將血淋巴收集在預(yù)先加入苯基硫脲的1.5 mL離心管中，用于檢測分析血淋巴超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(catalase)、丙二醛(MDA)、可溶性蛋白(soluble protein)和海藻糖(trehalose)等生理生化指標(biāo)。各生理生化指標(biāo)均按照試劑盒說明書操作測定。

參見可溶性蛋白含量測定試劑盒，取稀釋200倍的待測樣品20 μL和配制好的BCA工作液(試劑 A 和 B 按照 50∶1的比例混合)1 000 μL混勻作為測定管，分別取蒸餾水20 μL和工作液1 000 μL混勻作為空白管，取蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL和工作液1 000 μL混勻作為標(biāo)準(zhǔn)管，于60 ℃水浴保溫30 min后測定562 nm 處吸光度值，按照“可溶性蛋白含量(mg/mL)=0.5×(A測定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)”計算待測樣品可溶性蛋白含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

本文所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)均使用GraphPad Prism軟件(v7.04)。所有數(shù)值均表示為平均值或平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。本試驗顯著性差異分析均采用Holm-Sidak，比較2組模型相同日齡相同性別的差異，顯著性水平P<0.05表示2組之間的比較具有顯著性差異，顯著性水平P<0.01表示2組之間的比較具有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 限食對家蠶食下量、體質(zhì)量和壽命的影響

在上述限食模型下，統(tǒng)計了自2齡幼蟲限食開始，到5齡結(jié)束(上蔟)期間的食下量。結(jié)果顯示，限食顯著減少幼蟲食下量。以5齡期為例，DR組食下量約為AL組的61.03%，2組食下量差異達(dá)顯著水平(P<0.05)；而且，雌蠶食下量均高于雄蠶，符合生產(chǎn)實際(圖1-A)。

♀分別代表限制給食組雄、雌蠶；♀分別代表自由采食組雄、雌蠶；*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)；圖2-4，表2-6相同。圖1 限食模型與自由采食模型家蠶5齡幼蟲日均食下量(A)、齡期經(jīng)過(B)、體質(zhì)量(C)和雌蛾造卵數(shù)(D)比較

從限食開始，DR組每個齡期經(jīng)過時間均有不同程度的延長，其中在5齡幼蟲和成蟲期經(jīng)過延長最明顯，綜合整個齡期(圖1-B)來看，雌蠶DR組比AL組延長了132 h，雄蠶DR組比AL組延長了130 h，差異均達(dá)到顯著水平(P<0.05)，表明限食能夠顯著延長家蠶的壽命。

隨著限食時間的推移，DR組家蠶體質(zhì)量較AL組有明顯的減輕。DR組雌、雄幼蟲體質(zhì)量峰值分別為AL組雌、雄幼蟲的75.07%和70.30%，表明DR組家蠶發(fā)育周期中，體質(zhì)量始終達(dá)不到AL組幼蟲的峰值水平，限食減輕了家蠶的體質(zhì)量。蛹期3 d的DR組雌、雄蛹平均體質(zhì)量分別為AL組的63.34%和63.52%(圖1-C)，2組中雌蠶體質(zhì)量均大于雄蠶體質(zhì)量，這與食下量的調(diào)查結(jié)果一致。

對雌蛾交配后造卵數(shù)的調(diào)查結(jié)果(圖1-D)顯示，DR組和AL組雌蛾的造卵數(shù)量并沒有顯著性差異(P>0.05)，說明適度限食對家蠶生育繁殖沒有明顯的影響。

2.2 限食影響家蠶壽命相關(guān)基因的表達(dá)水平

2.2.1Bmchico基因表達(dá)水平的變化 家蠶幼蟲5齡3 d是蠶絲蛋白大量合成的時期，常用于家蠶生理毒理研究，我們用qRT-PCR技術(shù)分析了限食后5齡3 d幼蟲各組織中3個長壽相關(guān)基因表達(dá)量的變化。結(jié)果表明，與AL組雌蠶相比，DR組雌蠶Bmchico基因表達(dá)水平在中腸和馬氏管中上調(diào)，在頭部、絲腺、卵巢和脂肪體中下調(diào)，其中在絲腺和脂肪體中顯著下調(diào)(圖2-A)，與限食降低蠶絲蛋白合成一致；DR組雄蠶Bmchico基因在表皮中的表達(dá)水平顯著下調(diào)，在絲腺、精巢、脂肪體、馬氏管和血淋巴中的表達(dá)水平上調(diào)，但差異不顯著(圖2-B)。同時雌、雄對比發(fā)現(xiàn)，Bmchico基因在雌蠶中表達(dá)水平較雄蠶高，推測Bmchico基因存在一定的性別特異性。

A.雌蠶，B.雄蠶；圖3-4相同。圖2 Bmchico在家蠶5齡3 d各組織中的表達(dá)水平

2.2.2Bmrpd3基因表達(dá)水平的變化 與AL組相比，DR組中雌蠶Bmrpd3在頭部和表皮中的表達(dá)水平下調(diào)但差異不顯著；在其余組織中均表現(xiàn)上調(diào)，其中在中腸、絲腺、脂肪體和馬氏管中顯著上調(diào)(圖3-A)。在DR組雄蠶中該基因在頭部、表皮、中腸的表達(dá)水平下調(diào)，在其余組織中表現(xiàn)為上調(diào)(圖3-B)。而且在雌、雄家蠶幼蟲中Bmrpd3基因的表達(dá)水平相近。

圖3 Bmrpd3在家蠶5齡3 d各組織中的表達(dá)水平

圖4 BmAkh2在家蠶5齡3 d各組織中的表達(dá)水平

2.2.3BmAkh2基因表達(dá)水平的變化 DR組雌蠶BmAkh2在各個組織中的表達(dá)水平均表現(xiàn)出不同程度的下調(diào)，在絲腺中下調(diào)的幅度最大，達(dá)到顯著水平(圖4-A)；DR組雄蠶BmAkh2在表皮中的表達(dá)水平顯示上調(diào)，在其余組織中的表達(dá)水平顯示下調(diào)，在絲腺、精巢、馬氏管和血淋巴中的表達(dá)水平差異顯著(圖4-B)。BmAkh2基因整體上表達(dá)水平較低，在不同組織和不同性別中的表達(dá)差異大，顯示出一定的性別和組織特異特性。

2.3 限食對家蠶5齡幼蟲血淋巴部分生理生化指標(biāo)的影響

2.3.1 超氧化物歧化酶活性的變化 超氧化物歧化酶對機(jī)體的氧化和抗氧化平衡起著重要的作用，從表2可以看出，AL組超氧化物歧化酶的活力從5齡1 d開始上升，在5齡4 d(盛食期)到達(dá)極值后開始下降；而DR組超氧化物歧化酶活力變化從5齡1 d開始，一直呈現(xiàn)上升的趨勢，在5齡6 d超過AL組家蠶。

表2 超氧化物歧化酶在5齡家蠶血淋巴中的活力

時間/d樣本數(shù)/個超氧化物歧化酶活力/(U/mL)AL♂AL♀DR♂DR♀5齡1 d313.32±1.8714.13±2.6412.71±1.8014.69±0.995齡2 d316.08±2.3716.41±1.5614.96±2.7013.39±1.215齡3 d318.64±4.5318.39±4.4116.83±0.8616.64±2.455齡4 d320.90±1.3219.24±1.6119.60±1.6818.75±0.155齡5 d320.37±0.6619.16±3.0217.24±1.14?18.65±3.585齡6 d317.40±1.1115.07±2.6619.37±2.4420.45±3.525齡7 d321.74±2.5022.37±1.645齡8 d323.99±4.0124.02±2.62日均-17.79±1.9817.07±2.6518.31±2.1418.62±2.02

日均為5齡期酶活總量除以5齡期天數(shù)；表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；表3-6相同。

2.3.2 過氧化氫酶活性的變化 過氧化氫酶是反映生物體氧化水平的指標(biāo)之一，AL組5齡期血淋巴中過氧化氫酶活力隨著時間的推移持續(xù)下降，而DR組活力呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，至5齡6 d到達(dá)峰值，末期再次降低(表3)。而且DR組過氧化氫酶活力均高于AL組同性別的家蠶，在同一模型中過氧化氫酶活力雌蠶均高于雄蠶，表明該酶活力存在性別差異。

表3 過氧化氫酶在5齡家蠶血淋巴中的活力

時間/d樣本數(shù)/個過氧化氫酶活力/(U/mL)AL♂AL♀DR♂DR♀5齡1 d332.96±3.8834.47±2.8139.09±1.6742.65±4.665齡2 d331.08±3.7934.74±3.9429.64±1.7435.18±2.875齡3 d332.18±2.1937.71±2.9529.98±1.7831.41±1.405齡4 d326.28±1.9329.32±4.3935.88±1.21?33.22±1.645齡5 d328.67±1.8332.49±3.1636.41±1.12?39.58±1.905齡6 d326.78±1.0334.68±3.8836.46±1.64?45.23±1.615齡7 d327.82±1.4825.82±1.715齡8 d334.11±2.9336.21±1.95日均-29.66±2.4433.90±3.5233.67±1.7036.16±2.22

2.3.3 丙二醛含量的變化 丙二醛是脂質(zhì)氧化的終產(chǎn)物，能直接反映機(jī)體脂質(zhì)氧化水平。在AL組家蠶血淋巴中丙二醛濃度為0.50～0.92 nmol/mL，說明正常蠶體也存在較弱的脂質(zhì)氧化作用，在5齡期隨發(fā)育進(jìn)程呈現(xiàn)逐步下降的趨勢。與AL組家蠶相比，DR組家蠶血淋巴中丙二醛平均含量更低，同樣隨發(fā)育進(jìn)程逐步下降(表4)，但2組間差異未到達(dá)顯著水平。

表4 丙二醛在5齡家蠶血淋巴中的含量

時間/d樣本數(shù)/個丙二醛含量/(nmol/mL)AL♂AL♀DR♂DR♀5齡1 d30.68±0.120.83±0.070.90±0.120.65±0.165齡2 d30.68±0.070.76±0.150.64±0.130.80±0.205齡3 d30.74±0.190.62±0.130.55±0.100.39±0.205齡4 d30.71±0.110.68±0.060.52±0.160.44±0.10?5齡5 d30.92±0.230.79±0.260.48±0.180.37±0.075齡6 d30.52±0.190.50±0.080.30±0.100.36±0.105齡7 d30.34±0.030.26±0.035齡8 d30.67±0.300.80±0.38日均-0.71±0.150.70±0.130.66±0.130.61±0.18

2.3.4 可溶性蛋白含量的變化 可溶性蛋白包含昆蟲發(fā)育過程中的各種關(guān)鍵蛋白質(zhì)，其性質(zhì)和數(shù)量隨著發(fā)育階段改變，從側(cè)面反映著昆蟲的發(fā)育狀態(tài)。經(jīng)過長期限食，AL組雄蠶血淋巴中可溶性蛋白平均含量達(dá)到119.33 mg/mL，DR組雄蠶為124.50 mg/mL，相差不大；而AL組和DR組雌蠶血淋巴中可溶性蛋白平均含量相差約10 mg/mL(表5)，說明限食對可溶性蛋白含量影響在雌蠶中表現(xiàn)得更為顯著。

表5 可溶性蛋白在5齡家蠶血淋巴中的含量

時間/d樣本數(shù)/個可溶性蛋白含量/(mg/mL)AL♂AL♀DR♂DR♀5齡1 d3112.56±6.97104.56±1.97160.27±2.28 ?152.87±1.64 ?5齡2 d3102.27±2.82134.27±2.82116.47±2.28?134.14±4.145齡3 d3112.71±1.31122.48±2.82118.99±1.79?120.54±5.655齡4 d3110.99±1.79150.81±8.48116.12±3.94120.71±1.31?5齡5 d3132.71±1.31150.84±5.45112.27±2.28?116.56±1.97?5齡6 d3148.12±3.94182.26±4.08118.84±2.45?122.84±2.45?5齡7 d3124.42±2.62130.89±1.795齡8 d3132.56±1.97148.76±1.97日均-119.33±3.02140.33±4.33124.50±2.45130.25±2.62

2.3.5 海藻糖含量的變化 海藻糖是家蠶的血糖，也是家蠶生理活動的主要能源物質(zhì)。在血淋巴海藻糖測定中發(fā)現(xiàn)，DR組和AL組家蠶均呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢，5齡3 d達(dá)到峰值(AL組：10.90 mg/mL；DR組：7.62 mg/mL)。但DR組整體海藻糖平均含量更低，并在5齡6 d出現(xiàn)了含量上升的現(xiàn)象(表6)。

表6 海藻糖在5齡家蠶血淋巴中的含量

時間/d樣本數(shù)/個海藻糖含量/(mg/mL)AL♂AL♀DR♂DR♀5齡1 d36.52+1.656.51±1.675.33±0.435.12±0.975齡2 d38.53±0.646.92±1.335.93±0.506.42±0.055齡3 d310.84±0.4610.95±0.46 7.32±0.16?7.92±0.35?5齡4 d38.76±0.717.95±1.944.77±0.24?5.06±1.46?5齡5 d37.49±1.466.18±0.824.64±0.89?4.71±0.545齡6 d37.38±0.645.94±0.616.69±1.296.68±1.61

續(xù)表6

3 討論

3.1 家蠶限食模型

動物限食模型的利用，解決了醫(yī)學(xué)和健康性試驗人體的困難以及倫理問題。家蠶作為鱗翅目昆蟲模式生物，子代多、生命周期短、遺傳背景清楚、繁殖能力強(qiáng)，是研究壽命較好的實驗動物。為了探究限食延長壽命的機(jī)制，我們以家蠶為試驗材料，限食組給食量為自由采食組的61.03%，符合其他動物模型限食標(biāo)準(zhǔn)(60%)[15]。通過定時限食，家蠶的壽命得到顯著延長。根據(jù)嚙齒類動物常用的體質(zhì)量、血糖水平和壽命長短等指標(biāo)判斷[16]，我們的家蠶限食模型建立成功。限食可延長家蠶的壽命，其中延長最明顯的是5齡期和成蟲期，分別占總延長時間的36.64%和18.32%。而且家蠶限食后未觀察到如嚙齒類動物由于長期禁食生殖力下降的現(xiàn)象[1]，雌蠶的造卵數(shù)沒有明顯變化，雄蛾交尾正常，說明適度限食對家蠶生育繁殖沒有明顯的影響。

3.2 限食對家蠶壽命相關(guān)基因表達(dá)的影響

一直以來，人們都在尋找延緩衰老的有效途徑，研究方向由原來的宏觀水平到細(xì)胞、基因水平，再到基因功能，希望通過抑制或調(diào)控長壽相關(guān)基因來延緩衰老，達(dá)到健康長壽的目的[17]。我們從家蠶中選取了3個黑腹果蠅中調(diào)控壽命相關(guān)的同源基因，分析了它們在家蠶不同組織中的表達(dá)情況。chico基因編碼胰島素受體底物1-B，該底物在胰島素/胰島素樣生長因子(IGF-1)信號通路扮演重要角色，而胰島素/胰島素樣生長因子信號通路是經(jīng)典的壽命調(diào)節(jié)相關(guān)通路[18]，該信號通路廣泛存在于脊椎動物和非脊椎動物中，在進(jìn)化上高度保守并與各種正常生理活動及多種疾病發(fā)生密切相關(guān)[19-20]。CLANCY等[18]在果蠅中對chico基因進(jìn)行了誘變，發(fā)現(xiàn)果蠅平均壽命在突變純合子中延長了48%，在突變雜合子中延長了36%，在本試驗中，與AL組家蠶相比，DR組Bmchico在雌蠶絲腺、脂肪體和雄蠶表皮中的表達(dá)水平都顯著下調(diào)，這與chico基因在果蠅中的研究結(jié)果一致，表明限食通過誘導(dǎo)chico基因的表達(dá)水平下調(diào)來實現(xiàn)延長壽命的效果，而在其他組織中Bmchico的表達(dá)水平下調(diào)不明顯甚至有些組織中還出現(xiàn)上調(diào)，也說明飲食限制通過chico來調(diào)節(jié)壽命的程度和方式在不同物種間有所不同。

rpd3是一類保守的組蛋白去乙酰酶，大量的試驗證明，在果蠅中rpd3基因的突變會導(dǎo)致果蠅壽命的延長[21]。同時，rpd3作為一類組蛋白去乙酰化酶在表觀遺傳調(diào)控方面也起著至關(guān)重要的作用[22]。據(jù)報道，劉易斯-卡茨醫(yī)學(xué)院揭示表觀遺傳學(xué)隨年齡而變化的速度與物種的壽命相關(guān)，而限食減緩了這一變化進(jìn)程，甲基化程度與壽命之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。換句話說，表觀遺傳變化越大，發(fā)生的速度越快，物種的壽命就越短[23]。在本試驗中，在2組家蠶的各個組織中我們都觀察到不同程度的表達(dá)差異，我們推測因為生物體衰老并不是同時發(fā)生的，各個組織中的衰老程度都會有所不同，表觀遺傳在各個組織中的變化速度不同，造成rpd3在不同組織中的表達(dá)情況有所差異，暗示著限食能延長壽命，也可能是生物體表觀遺傳調(diào)節(jié)的結(jié)果。

已有研究發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)代謝在飲食限食延長壽命中起關(guān)鍵作用。昆蟲脂代謝激素(Akh2)是一種代謝性神經(jīng)肽，主要以其在需要能量的活動(如飛行和運動)中動員能量底物，它介導(dǎo)了昆蟲體內(nèi)糖類和脂類代謝調(diào)控[24]。在DR組家蠶脂肪體中，BmAkh2的表達(dá)水平普遍下調(diào)，這與果蠅中的試驗結(jié)果一致，表明，Akh2表達(dá)水平下降導(dǎo)致調(diào)動其能源的速度越慢，家蠶的存活時間就越長，同時限食誘導(dǎo)脂質(zhì)代謝的改變也可能為我們治療肥胖癥等疾病帶來新的曙光[19]。

3.3 限食對家蠶主要生理生化指標(biāo)的影響

生物機(jī)體氧化和抗氧化的動態(tài)平衡與其健康、衰老和疾病的發(fā)生有著密不可分的關(guān)系。超氧化物歧化酶和過氧化氫酶作為抗氧化防御系統(tǒng)中的重要組成部分，能有效地清除機(jī)體中的氧自由基防止其累積對細(xì)胞造成氧化傷害。通過限制食量，我們發(fā)現(xiàn)超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活力在DR組家蠶血淋巴中均有上升的趨勢，其最高水平均超過AL組家蠶水平，同時脂質(zhì)氧化產(chǎn)物丙二醛含量下降。表明限食降低了蠶體脂質(zhì)氧化水平，加速了自由基的清除，使機(jī)體抗氧化應(yīng)激能力提高，從而延緩細(xì)胞的衰老，延長生物體的壽命[25-26]?？扇苄缘鞍资侵匾臐B透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)，是代謝系統(tǒng)運作的各種關(guān)鍵酶的主要來源，DR組雌蠶血淋巴可溶性蛋白含量較AL組雌蠶血淋巴低預(yù)示著限食可能導(dǎo)致生物體較低的代謝率，并將大部分營養(yǎng)和能量代謝用來繁殖后代。同時海藻糖作為家蠶的主要能源物質(zhì)，大部分時候在血淋巴中穩(wěn)定存在，而在DR組家蠶中，海藻糖平均含量較AL組家蠶低且含量水平發(fā)生變化，暗示著限食可能改善了家蠶血糖的調(diào)節(jié)方式，這種調(diào)節(jié)方式很可能為人類2型糖尿病提供新的干預(yù)治療方法。

限制飲食對于生物體壽命的延長顯示出明顯的效果，大量報道指出限制飲食也是預(yù)防和治療各種與老年相關(guān)疾病的有效手段[2]。然而限制飲食并不是每個人都能接受的長壽方案，我們利用家蠶作為模型，研究限食對壽命、繁殖和生理生化指標(biāo)的影響，結(jié)果表明限食不僅可以延長家蠶的壽命，不影響繁殖，而且主要生理生化指標(biāo)得到改善或提高，給未來長壽機(jī)制研究提供了新的線索和借鑒。