陳 卓 劉佳蔚 李文睿 劉 限 秦 利 夏潤璽

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院蠶學(xué)系，遼寧沈陽 110161)

柞蠶空胴病是柞蠶的主要病害之一，在各柞蠶區(qū)均有發(fā)生，特別是“二化一放”柞蠶區(qū)更易發(fā)生危害，一般發(fā)病率在30%～40%，重者可達(dá)70%[1]，甚至造成粒繭不收。

柞蠶空胴病的病原是柞蠶鏈球菌(StreptococcuspernyiSp. nov)[1]。柞蠶鏈球菌主要經(jīng)取食進(jìn)入柞蠶體內(nèi)，主要寄生在柞蠶的中腸，破壞圍食膜和中腸上皮細(xì)胞，引起柞蠶發(fā)病[1]。生產(chǎn)上通過選留無病種和卵面消毒，可以有效防止該病經(jīng)卵面?zhèn)魅?；但幼蟲期經(jīng)口食下傳染一直沒有得到有效控制，致使該病長期危害柞蠶。為此，人們做了大量工作，以求研制出能有效防治該病的藥物。目前，在生產(chǎn)中應(yīng)用的防治藥物主要有保蠶寧和蠶得樂等[2]，但其防治效果不盡人意。為更有效地防治柞蠶空胴病，經(jīng)多年研究，我們研制出了一種新的防治柞蠶空胴病藥物，暫定名蠶康寧。本文總結(jié)了蠶康寧防治柞蠶空胴病的室內(nèi)試驗結(jié)果，以供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 柞蠶品種 沈黃2號[3]，由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)柞蠶研究所提供。

1.1.2 供試病原菌 柞蠶鏈球菌，由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院蠶學(xué)系提供，濃度1×107個/mL。

1.1.3 供試藥劑 蠶康寧，沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院蠶學(xué)系研制，按預(yù)備試驗確定的使用濃度用清潔水配制成0.1 mg/mL的溶液；保蠶寧3號[4]，沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，按說明書標(biāo)注的使用濃度用清潔水配制成0.13%的溶液；蠶得樂[5]，遼寧省蠶業(yè)科學(xué)研究所提供，按說明書標(biāo)注的使用濃度用清潔水配制成3.33%的溶液。

1.1.4 主要試劑 蔗糖、蛋白胨、氯化鈉、牛肉膏和瓊脂粉，均為分析純，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 柞蠶鏈球菌固體平面培養(yǎng)基的制作 參考文獻(xiàn)[1]的方法，稱取蔗糖20 g、蛋白胨20 g、氯化鈉5 g、牛肉膏5 g、瓊脂粉20 g，先加約800 mL的蒸餾水充分?jǐn)嚢?，然后定容? 000 mL，用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH=9.0，然后用高壓蒸汽121 ℃滅菌20 min。待滅菌后培養(yǎng)基溫度降至約60 ℃時，在超凈工作臺，將培養(yǎng)基分裝到直徑9 mm的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿25 mL培養(yǎng)基。待培養(yǎng)基凝固制成固體平面培養(yǎng)基后，置4 ℃冰箱冷藏備用。

1.2.2 抑菌試驗 在無菌條件下，將1×107個/mL的柞蠶鏈球菌懸液用涂布器均勻涂布于柞蠶鏈球菌固體平面培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)皿200 μL。待菌液吸收后，取直徑10 mm的小圓濾紙片，分別加50 μL預(yù)備試驗確定使用濃度或說明書標(biāo)注使用濃度(見1.1.3項)的蠶康寧、保蠶寧3號、蠶得樂藥液后，平貼于培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)皿貼放分別加有蠶康寧、保蠶寧3號、蠶得樂3種藥劑的濾紙片各1片，3片濾紙片均勻排布，重復(fù)3次。于28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后測量抑菌環(huán)的大小，比較3種藥劑的抑菌效果。

1.2.3 防治試驗 按照常規(guī)飼育方法野外飼育柞蠶，3齡起蠶后分區(qū)，分別進(jìn)行先施藥后添菌(防病)和先添菌后施藥(治病)2種防治試驗，每個處理設(shè)3個重復(fù)區(qū)，每個重復(fù)區(qū)30頭柞蠶。處理后置飼育袋中室內(nèi)飼育，測定比較3種藥劑的防治效果。

葉面添食柞蠶鏈球菌方法為將濃度為1×107個/mL的柞蠶鏈球菌懸液均勻涂于柞葉上，適當(dāng)陰干后飼喂柞蠶，每小區(qū)所用柞葉量相等，并在6 h內(nèi)食盡。葉面添食藥劑方法為將標(biāo)準(zhǔn)使用濃度的藥劑均勻噴灑于柞葉上，噴至葉面充分濕潤而不滴，陰干后飼喂柞蠶，每小區(qū)用藥體積和柞葉量盡量一致，并在6 h內(nèi)食盡。

(1)先施藥后添菌試驗。先給3齡起柞蠶分別添食葉面噴灑蠶康寧、保蠶寧3號、蠶得樂3種藥劑的柞葉6 h，以噴灑等量清水的柞葉作對照。然后分別用正常柞葉飼喂24 h，再分別添食葉面涂布柞蠶鏈球菌的柞葉6 h，之后飼喂正常柞葉，10 d后調(diào)查發(fā)病情況。

(2)先添菌后施藥試驗。先給3齡起柞蠶分別添食葉面涂布柞蠶鏈球菌的柞葉6 h，然后用正常柞葉飼喂24 h，再分別添食葉面噴灑蠶康寧、保蠶寧3號、蠶得樂3種藥劑的柞葉6 h，以葉面噴灑等量清水的柞葉做對照，之后飼喂正常柞葉，10 d后調(diào)查發(fā)病情況。

各處理區(qū)處理后置飼育袋中室內(nèi)飼育，飼喂正常柞葉10 d后，統(tǒng)計各區(qū)發(fā)病蠶頭數(shù)，計算出各藥劑處理區(qū)相對對照區(qū)的防治效果(保護(hù)率)。防治效果(%)=(對照區(qū)發(fā)病率-藥劑處理區(qū)發(fā)病率)/對照區(qū)發(fā)病率×100。參照文獻(xiàn)[6]的方法，對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，比較差異顯著性。

1.2.4 毒性試驗 取蠶康寧標(biāo)準(zhǔn)使用濃度的5倍(0.5 mg/mL)、10倍(1.0 mg/mL)、20倍(2.0 mg/mL)的藥液，從2齡第3天起連續(xù)進(jìn)行葉面添食，以清水作對照，觀察柞蠶是否有中毒現(xiàn)象，1周后調(diào)查柞蠶的體質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌效果

用蠶康寧等3種藥劑進(jìn)行抑菌試驗，結(jié)果如表1所示。蠶康寧的抑菌環(huán)最大，其平均直徑為47 mm，約是保蠶寧3號(25 mm)和蠶得樂(24 mm)的2倍。保蠶寧3號和蠶得樂的抑菌環(huán)大小相近，保蠶寧3號的略大?？梢?，蠶康寧對柞蠶鏈球菌的抑制作用最強(qiáng)，明顯優(yōu)于保蠶寧3號和蠶得樂。

表1 蠶康寧等3種藥劑的抑菌效果mm

藥劑名稱抑菌環(huán)直徑重復(fù)1重復(fù)2重復(fù)3平均值蠶康寧46484747保蠶寧3號26242525蠶得樂24232524

2.2 防治效果

以蠶康寧等3種藥劑對柞蠶空胴病進(jìn)行防治試驗，比較3種藥劑的防治效果，結(jié)果如表2所示。對表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，如表3所示。藥劑間F=276.96>F0.01=6.93，不同藥劑間的防治效果均達(dá)極顯著水平。施藥先后間F=5.09>F0.05=4.57，先藥后菌與先菌后藥2種處理方法間的防治效果均達(dá)顯著水平。藥劑和施藥先后間互作F=0.19

表2 蠶康寧等3種藥劑的防治效果%

藥劑名稱先藥后菌(“防病”)先菌后藥(“治病”)重復(fù)1重復(fù)2重復(fù)3重復(fù)1重復(fù)2重復(fù)3蠶康寧76.6773.3373.3373.3366.6770.00保蠶寧3號43.3340.0040.0036.6733.3336.67蠶得樂33.3330.0036.6733.3330.0030.00

對3種藥的防治效果采用新復(fù)極差法(SSR法)進(jìn)行多重比較。查“Duncan’s新復(fù)極差測驗SSR0.05和SSR0.01值表”，得到測驗極差的平均數(shù)個數(shù)(P)為2和3時對應(yīng)的α為0.05及0.01時的新復(fù)極差(SSR)值，并計算出對應(yīng)最小顯著極差(LSR)值，如表4所示。多重比較結(jié)果如表5所示，蠶康寧與保蠶寧3號、蠶得樂的防治效果間存在極顯著差異。

表3 蠶康寧等3種藥劑防治效果的方差分析

變異來源自由度離均差平方和均方F值F0.05F0.01藥劑間25 453.652 726.83276.963.886.93施藥先后間150.1150.115.094.579.33藥劑和施藥先后間互作23.701.850.193.886.93試驗誤差12118.159.85總變異1175 625.62

表4 蠶康寧等3種藥劑防治效果不同極差平均數(shù)的最小顯著極差(LSR)值

極差平均數(shù)(P)新復(fù)極差(SSR)值最小顯著極差(LSR)值SSR0.05SSR0.01LSR0.05LSR0.0123.084.325.577.8233.234.555.858.24

表5 蠶康寧等3種藥劑防治效果平均數(shù)的多重比較

藥劑名稱平均值差異顯著性0.050.01蠶康寧72.22aA保蠶寧3號39.44bB蠶得樂32.22bB

保蠶寧3號與蠶得樂間差異不顯著。說明蠶康寧的防治效果極顯著優(yōu)于保蠶寧3號和蠶得樂。

對3種藥劑先藥后菌和先菌后藥的防治效果進(jìn)行t檢驗，求得t=0.22>t0.05=2.12，P<0.05，添藥先后之間差異顯著，先添藥的防治效果顯著優(yōu)于先添菌后添藥。

2.3 毒性試驗

蠶康寧以標(biāo)準(zhǔn)使用濃度的5倍(0.5 mg/mL)、10倍(1.0 mg/mL)和20倍(2.0 mg/mL)的藥液給柞蠶連續(xù)添食1周，從表6可以看出，與對照相比未見明顯差異，僅20倍標(biāo)準(zhǔn)使用濃度添食區(qū)，在第7 天發(fā)現(xiàn)極個別柞蠶行動略遲緩?？梢姡撍幵跇?biāo)準(zhǔn)使用濃度10倍以下對柞蠶安全。

表6 蠶康寧對柞蠶的毒性

藥劑濃度添藥天數(shù)1 d3 d5 d7 d7 d后柞蠶體質(zhì)量/g蠶康寧5倍(0.5 mg/mL)液----1.05蠶康寧10倍(1.0 mg/mL)液----1.06蠶康寧20倍(2.0 mg/mL)液---極個別行動略遲緩1.05清水1.05

“-”表示與對照無差異。

3 結(jié)論

蠶康寧對柞蠶鏈球菌具有明顯的抑制作用，抑菌環(huán)明顯大于保蠶寧3號和蠶得樂，對柞蠶空胴病的防治效果明顯優(yōu)于現(xiàn)行防治柞蠶空胴病的藥物。試驗結(jié)果表明，先施藥后添菌的防治效果明顯優(yōu)于先添菌后施藥，即該藥的預(yù)防效果好于治療效果。蠶康寧對柞蠶的毒性試驗表明，在使用濃度范圍內(nèi)該藥對柞蠶安全。我們在柞園的試驗結(jié)果也表明在3齡、4齡起蠶各噴藥1次，即可有效防治柞蠶空胴病的發(fā)生，其效果優(yōu)于現(xiàn)行防治柞蠶空胴病的藥劑保蠶寧3號和蠶得樂，而且其對柞蠶是安全的。