王裕玉，徐跑，聶志娟，華忠， 李全杰，邵乃麟，徐鋼春

中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214081

池塘養(yǎng)殖是淡水養(yǎng)殖的主要方式。2017年我國池塘養(yǎng)殖面積2527.78千公頃，占淡水養(yǎng)殖總面積的47.12%，養(yǎng)殖產(chǎn)量2122.22萬噸，占淡水養(yǎng)殖總產(chǎn)量的73.05%[1]，為優(yōu)化居民膳食結(jié)構(gòu)、調(diào)整產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)、增加漁民收入、保障糧食安全并帶動(dòng)相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展等方面做出了重要貢獻(xiàn)。然而，池塘養(yǎng)殖仍以“進(jìn)水渠+養(yǎng)殖池塘+排水渠”為主要形式[2]，這種養(yǎng)殖模式的發(fā)展是以高放養(yǎng)密度、高投喂量、高勞動(dòng)力成本、高能耗且犧牲環(huán)境為代價(jià)換來的。養(yǎng)殖尾水造成的環(huán)境負(fù)荷已成為制約淡水池塘養(yǎng)殖發(fā)展的主要瓶頸，此外，還存在抗生素濫用引起細(xì)菌耐藥性增加、微生物區(qū)系遭到破壞和水產(chǎn)品質(zhì)量安全等問題[3,4]。

池塘工程化循環(huán)水養(yǎng)殖是近幾年來我國漁業(yè)轉(zhuǎn)型升級(jí)、創(chuàng)新發(fā)展的一種新模式，與傳統(tǒng)池塘養(yǎng)殖模式相比，新模式在工藝?yán)砟?、技術(shù)裝備和養(yǎng)殖方式等方面都有了重大革新。工程化循環(huán)水養(yǎng)殖是指利用占池塘面積2%～5%的水面建設(shè)具有氣提推水增氧、自動(dòng)投餌系統(tǒng)和集排污裝備的系列水槽作為養(yǎng)殖區(qū)進(jìn)行類似于“工廠化”的高密度養(yǎng)殖，實(shí)施智能化在線監(jiān)測、工業(yè)化管理，并對(duì)其余95%～98%的水面進(jìn)行適當(dāng)改造后作為凈化區(qū)對(duì)養(yǎng)殖尾水進(jìn)行生物凈化處理，能構(gòu)建良好生境，實(shí)現(xiàn)養(yǎng)殖尾水的零排放和綜合養(yǎng)殖效益增收的目標(biāo)。目前有關(guān)池塘工程化循環(huán)水養(yǎng)殖模式的研究主要集中在系統(tǒng)建設(shè)優(yōu)化、養(yǎng)殖品種篩選等方面，而關(guān)于高密度養(yǎng)殖條件下養(yǎng)殖對(duì)象生長適應(yīng)情況及配套技術(shù)的研究尚屬空白。大量研究表明，養(yǎng)殖密度作為一種脅迫因子，會(huì)對(duì)魚類行為、內(nèi)分泌、生長發(fā)育、代謝及免疫力等生理機(jī)能產(chǎn)生影響，最終會(huì)影響魚類福利、產(chǎn)量和養(yǎng)殖效益，這主要與擁擠脅迫引發(fā)魚類的應(yīng)激反應(yīng)、抗氧化、抗病能力和水質(zhì)的改變相關(guān)[5～8]。因此，研究不同養(yǎng)殖密度條件下魚類的生理反應(yīng)機(jī)制，有助于在生產(chǎn)實(shí)踐中掌握適宜的養(yǎng)殖密度，提高養(yǎng)殖效益和環(huán)境效益。

吉富羅非魚“中威1號(hào)”是采用被動(dòng)整合雷達(dá)標(biāo)記(PIT)技術(shù)、數(shù)量遺傳學(xué)最佳線性無偏預(yù)測(BLUP)分析和家系選育等綜合育種新技術(shù)，經(jīng)過多年多代培育而成，具有生長速度快、出肉率高、病害少、易馴化、起捕率高等優(yōu)點(diǎn)[9]，已成為我國出口創(chuàng)匯的重要水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本研究探討了池塘工程化循環(huán)水養(yǎng)殖模式下不同養(yǎng)殖密度對(duì)吉富羅非魚生長及生理指標(biāo)的影響，旨在了解吉富羅非魚在密度脅迫條件下的響應(yīng)，為工程化循環(huán)水養(yǎng)殖技術(shù)的推廣與示范提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)條件

養(yǎng)殖試驗(yàn)在中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心揚(yáng)中基地改性PVC鋼架流水槽內(nèi)進(jìn)行。流水槽分為氣提推水增氧區(qū)、養(yǎng)殖區(qū)(22m×5m×2.5m，水深2.0m)和集污區(qū)。流水槽前端安裝氣提推水增氧裝置；養(yǎng)殖區(qū)底部安裝增氧設(shè)施；集污區(qū)設(shè)有軌道式吸污裝置。采用凈化區(qū)水下放養(yǎng)白鰱、花鰱和鱖魚，水上種植水葫蘆及吊養(yǎng)珍珠蚌的組合方式進(jìn)行水質(zhì)調(diào)控。養(yǎng)殖水源為長江水，水質(zhì)清新、無污染，符合《漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與養(yǎng)殖管理

試驗(yàn)開始前，將中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心宜興養(yǎng)殖基地繁育的吉富羅非魚“中威1號(hào)”苗種暫養(yǎng)于土池中。將體質(zhì)健康、規(guī)格一致的魚苗(初始平均體質(zhì)量為6.25g)隨機(jī)分組。試驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)處理，分別為低密度組(LSD)、中密度組(MSD)和高密度組(HSD)，各密度組的初始放養(yǎng)量分別為10000、20000、30000 尾/槽，初始養(yǎng)殖密度分別為45、90、136尾/m3，每個(gè)處理組設(shè)2個(gè)重復(fù)，暫養(yǎng)2d后開始投喂。試驗(yàn)期間，投喂羅非魚浮性膨化飼料(飼料粗蛋白28%，嘉吉飼料(鎮(zhèn)江)有限公司)，飼料粒徑根據(jù)魚體生長適時(shí)調(diào)整。每天投喂3次(6：00、11:00和17：00)，按體質(zhì)量的2%～5%進(jìn)行投喂，具體投喂量根據(jù)攝食、水溫、天氣變化等情況調(diào)整。投飼時(shí)確保飼料不漂出流水槽，每次投飼時(shí)長約為30min，以觀察上浮搶食魚數(shù)量明顯減少時(shí)即可。養(yǎng)殖全程凈化區(qū)不投飼。試驗(yàn)期間，水流速度約為3cm/s，水溫24.0～31.8℃，溶解氧3.01～7.18mg/L，pH 7.68～8.27，氨氮0.19～0.86mg/L。試驗(yàn)周期為80d。

1.3 樣品采集

分別于試驗(yàn)第20、50、80天取樣。每次每槽隨機(jī)取20尾魚，首先用200mg/L MS-222將試驗(yàn)魚麻醉，測量體質(zhì)量和體長等指標(biāo)。然后，尾靜脈取血，將血液注入到1.5mL離心管中，4℃冰箱中靜置4h，4000r/min離心15min，將血清轉(zhuǎn)入離心管中，-80℃保存，待測。采血完成后，迅速解剖，取肝臟等組織，液氮中速凍，轉(zhuǎn)入-80℃保存，用于后續(xù)分析。

按照文獻(xiàn)[10]的方法計(jì)算增重率(WG)、特定生長率(SGR)、肥滿度(CF)、肝體指數(shù)(HSI)和內(nèi)臟指數(shù)(VSI)。

1.4 樣品分析

采用全自動(dòng)生化分析儀(邁瑞B(yǎng)S-400，深圳)測定血清總蛋白(TP)、總膽固醇(TC)、血糖(Glu)、甘油三酯(TG)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)含量等血清生化指標(biāo)；采取酶聯(lián)免疫檢測法(ELISA)測定血清皮質(zhì)醇、超氧化物歧化酶(SOD)和溶菌酶含量。

抗氧化指標(biāo)：測定前，肝臟樣品在4℃冰箱中解凍，用預(yù)冷的0.86%生理鹽水洗滌，擦干表面水分，準(zhǔn)確稱取肝臟重量，按照重量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加入9倍體積的生理鹽水，高速勻漿，勻漿液經(jīng)離心(4℃，3000r/min，10min)后，取上清液，-80℃保存用于測定肝臟抗氧化酶活性。使用酶標(biāo)儀(Synergy H1,Bio-Tek，美國)測定總超氧化物歧化酶(T-SOD)、過氧化氫酶(CAT)、總抗氧化能力(T-AOC)活性及丙二醛(MDA)含量等指標(biāo)。采用考馬斯亮藍(lán)法測定肝臟蛋白含量。采用南京建成生物工程研究所的試劑盒進(jìn)行測定，具體方法參照試劑盒說明書。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SAS 9.1.2統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。先作單因素方差分析(ANOVA)，若各處理之間差異顯著，再作Duncan’s多重比較，P<0.05表示差異顯著。試驗(yàn)結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 池塘工程化循環(huán)水模式下養(yǎng)殖密度對(duì)吉富羅非魚生長性能和內(nèi)臟指數(shù)的影響

在整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)，吉富羅非魚很快即適應(yīng)了膨化飼料和流水槽環(huán)境，具有集群搶食的特點(diǎn)，攝食能力較強(qiáng)，未發(fā)生病害和明顯死亡。不同養(yǎng)殖密度對(duì)吉富羅非魚生長性能的影響結(jié)果見表1。結(jié)果表明，試驗(yàn)20d后，各密度組吉富羅非魚平均體重、增重率(WG)和特定生長率(SGR)差異不顯著(P>0.05)；50d后，高密度組平均體重、WG、SGR顯著低于低密度組和中密度組(P<0.05)。80d后，低密度組平均體重、WG、SGR顯著高于中、高密度組(P<0.05)，而中、高密度組之間差異不顯著(P>0.05)。

20d后，各密度組吉富羅非魚肥滿度(CF)差異不顯著(P>0.05)；而在50d和80d后，低密度組魚CF顯著高于其他2組P<0.05。50d后，內(nèi)臟指數(shù)(VSI)隨著養(yǎng)殖密度增加而顯著降低(P<0.05)；而20d和80d后，VSI在各密度組之間差異不顯著(P>0.05)。養(yǎng)殖密度對(duì)HSI無顯著影響。

表1 池塘工程化循環(huán)水模式下不同養(yǎng)殖密度下吉富羅非魚的生長性能和內(nèi)臟指數(shù)

注：同行數(shù)據(jù)后肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)。數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。表2同。

2.2 池塘工程化循環(huán)水模式下養(yǎng)殖密度對(duì)吉富羅非魚血清生化指標(biāo)的影響

養(yǎng)殖密度對(duì)血清ALT、AST、ALP、TC、SOD、皮質(zhì)醇和溶菌酶含量無顯著影響(P>0.05)。20d后，吉富羅非魚血清TP和TG含量在各組之間差異不顯著(P>0.05)；而在50d和80d后，低密度組試驗(yàn)魚血清TP和TG含量顯著高于中、高密度組(P<0.05)。80d后，高密度組試驗(yàn)魚血清Glu含量顯著高于其他密度組(P<0.05)；20d和50d后，各密度組試驗(yàn)魚Glu含量差異不顯著(P>0.05)(表2)。

表2 池塘工程化循環(huán)水模式下不同養(yǎng)殖密度下吉富羅非魚的血清生化指標(biāo)

2.3 池塘工程化循環(huán)水模式下養(yǎng)殖密度對(duì)吉富羅非魚抗氧化指標(biāo)的影響

表3的結(jié)果顯示，養(yǎng)殖密度對(duì)吉富羅非魚肝臟CAT、T-SOD、T-AOC活性和MDA含量的影響不顯著(P>0.05)。

3 討論

3.1 養(yǎng)殖密度對(duì)吉富羅非魚生長性能的影響

魚類的生長受遺傳、激素等內(nèi)源性因素和食物豐度和可消化性、養(yǎng)殖密度、環(huán)境條件等外源性因素的影響。當(dāng)養(yǎng)殖密度適宜時(shí)，魚類健康、生長率和飼料效率高，然而高密度養(yǎng)殖時(shí)，魚類受到許多因素單獨(dú)或疊加影響生長。魚類會(huì)通過改變一系列內(nèi)在的生理狀態(tài)來適應(yīng)高密度脅迫，但是當(dāng)脅迫超過其自身調(diào)節(jié)能力時(shí)，魚類生理功能出現(xiàn)紊亂，最終生長緩慢，甚至患病死亡[7,11～15]。本研究中，吉富羅非魚很快就適應(yīng)了膨化飼料和流水槽養(yǎng)殖環(huán)境，養(yǎng)殖期間未發(fā)生病害和明顯死亡。試驗(yàn)的前20d，養(yǎng)殖密度對(duì)吉富羅非魚生長無顯著影響，而在養(yǎng)殖后期，高密度養(yǎng)殖組魚生長顯著降低。類似地，Papoutsoglou等[16]對(duì)虹鱒(Oncorhynchusmykiss)、Liu等[17]對(duì)大菱鲆(Scophthalmusmaximus)和程佳佳等[18]對(duì)雜交鱘[Acipenserbaerii(♀)×Acipenserschrenckii(♂)]的研究均發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖初期養(yǎng)殖密度不會(huì)影響魚類的生長、攝食和飼料利用，而在養(yǎng)殖后期高密度組魚類生長率降低。高養(yǎng)殖密度抑制魚類生長的原因可歸結(jié)于以下3點(diǎn)：一是高密度養(yǎng)殖引起的水質(zhì)惡化，主要是通過魚類的代謝性排泄導(dǎo)致有機(jī)負(fù)荷和氨氮過高、溶解氧水平降低，從而損害生長[19,20]，提高水中溶解氧水平可減少高密度養(yǎng)殖對(duì)魚類的負(fù)面影響[21]；本研究中，水質(zhì)參數(shù)均在羅非魚養(yǎng)殖水質(zhì)推薦值范圍內(nèi)，魚類沒有受到水質(zhì)的脅迫影響；二是與低攝食量和種群競爭關(guān)系加劇有關(guān)[22～24]；三是高密度養(yǎng)殖引起應(yīng)激反應(yīng)，魚類需要消耗更多的能量來應(yīng)對(duì)脅迫，以維持正常的生理代謝。與之相反的是，對(duì)虹鱒[19]、歐洲鱸魚(Dicentrarchuslabrax)[25,26]和塞內(nèi)加爾鰨(Soleasenegalensis)[6,27]的研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖密度對(duì)其生長和健康無顯著影響；還有研究發(fā)現(xiàn)，低養(yǎng)殖密度也會(huì)對(duì)魚類的生長產(chǎn)生抑制效應(yīng)[28～30]，這可能與魚類的集群行為、活動(dòng)范圍大、覓食等活動(dòng)耗能增多有關(guān)[22]。不同研究者得出不同的結(jié)論可能與魚的種類、生長階段、養(yǎng)殖密度水平、飼料利用率、養(yǎng)殖周期和養(yǎng)殖環(huán)境條件的差異有關(guān)。

表3 池塘工程化循環(huán)水模式下不同養(yǎng)殖密度下吉富羅非魚的抗氧化指標(biāo)

3.2 養(yǎng)殖密度對(duì)吉富羅非魚血清生化指標(biāo)的影響

血液指標(biāo)與其代謝、營養(yǎng)及健康狀況有著密切的聯(lián)系。當(dāng)魚體受到外界因子的影響而發(fā)生病理性變化時(shí)會(huì)在血液指標(biāo)中表現(xiàn)出來，因此血液指標(biāo)被廣泛地用于評(píng)價(jià)魚類的健康、營養(yǎng)和對(duì)環(huán)境的適應(yīng)狀況，為防治方案提供有價(jià)值的信息[31]。本研究中，不同養(yǎng)殖密度組吉富羅非魚血清皮質(zhì)醇水平無顯著差異，對(duì)尼羅非魚(Oreochromisniloticus)[7]、歐洲鰉(Husohuso)[12]、虹鱒[19,24]、歐洲鱸魚[30]和塞內(nèi)加爾鰨[27]的研究中也得到了類似的結(jié)果。這些結(jié)果表明，魚類對(duì)長期的擁擠脅迫形成了適應(yīng)，皮質(zhì)醇水平輕微變化或未發(fā)生變化，血清皮質(zhì)醇可能不適合作為魚類長期應(yīng)激的敏感信號(hào)[23，24]。相反地，在一些研究中發(fā)現(xiàn)，高密度養(yǎng)殖組魚類血清皮質(zhì)醇水平明顯升高[11,26,32，33]，這是由于擁擠應(yīng)激會(huì)激活下丘腦-垂體-腎間軸(HPI)而產(chǎn)生皮質(zhì)醇[34]，高皮質(zhì)醇水平會(huì)對(duì)生長和免疫反應(yīng)產(chǎn)生有害影響[5,35]。Millán-Cubillo等[30]和Procarione等[36]研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖密度跟血清皮質(zhì)醇水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。養(yǎng)殖密度與血清皮質(zhì)醇的關(guān)系存在差異有多方面的原因。例如，當(dāng)魚類處于急性應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，禁食組的血清皮質(zhì)醇含量高于攝食組[26,37]，皮質(zhì)醇含量可作為魚類急性應(yīng)激時(shí)的指標(biāo)。SOD和溶菌酶作為非特異性免疫因子，在魚類的免疫應(yīng)答和抗病力方面起著重要作用[38]，魚類可以通過增加溶菌酶或補(bǔ)體水平、提高免疫水平以應(yīng)對(duì)應(yīng)激[39，40]。本研究中，血清SOD和溶菌酶含量在各密度組之間無顯著差異，表明養(yǎng)殖密度對(duì)免疫應(yīng)答無直接影響。試驗(yàn)前期，未發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖密度對(duì)血清TP、TC、Glu、TG含量有影響，而在養(yǎng)殖后期，高密度組Glu含量升高、TG含量降低，這與Telli等[7]對(duì)羅非魚、Andrade等[27]對(duì)塞內(nèi)加爾鰨、Naderi等[24]對(duì)虹鱒的研究結(jié)果相似，這可能是由于魚類在慢性應(yīng)激過程中，能夠動(dòng)員糖異生和糖原分解以滿足其在擁擠脅迫時(shí)對(duì)能量需求的增加[41，42]。

3.3 養(yǎng)殖密度對(duì)吉富羅非魚抗氧化酶活性的影響

集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖中氧化應(yīng)激是不可避免的一個(gè)問題，當(dāng)魚體受到有害刺激時(shí)抗氧化系統(tǒng)失衡，導(dǎo)致代謝紊亂，最終會(huì)影響魚類的生長、抗病能力、健康和漁產(chǎn)品品質(zhì)。在應(yīng)激條件下，活性氧(ROS)在生物體內(nèi)產(chǎn)生并迅速積累，過量的ROS會(huì)引起基因表達(dá)和細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)改變，導(dǎo)致抗氧化酶的損失并引發(fā)脂質(zhì)過氧化[27,43]。本研究結(jié)果顯示，肝臟CAT、T-SOD、T-AOC和MDA水平在不同養(yǎng)殖密度組之間沒有差異，這表明高養(yǎng)殖密度不會(huì)引起吉富羅非魚組織氧化損傷和脂質(zhì)過氧化。類似地，Andrade等[27]在對(duì)塞內(nèi)加爾鰨的研究中也得到了類似的結(jié)果。相反地，Liu等[17]對(duì)大菱鲆的研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖后期高密度組魚肝臟SOD、CAT和GSH-Px水平明顯降低?？寡趸富钚缘慕档涂赡苁囚~類對(duì)持續(xù)擁擠脅迫的一種響應(yīng)，同時(shí)也反映了魚類抗氧化系統(tǒng)清除有害超氧自由基的能力有限，最終導(dǎo)致氧化損傷[6,27]。

4 結(jié)語

綜上所述，池塘工程化循環(huán)水養(yǎng)殖模式條件下，高養(yǎng)殖密度可影響吉富羅非魚生長性能，但對(duì)其抗氧化活性、某些生理和免疫參數(shù)無顯著影響，該研究結(jié)果有助于監(jiān)測池塘工程化循環(huán)水養(yǎng)殖吉富羅非魚的生長、健康和福利狀況。從生長、福利和經(jīng)濟(jì)效益等方面考慮，建議池塘工程化循環(huán)水養(yǎng)殖吉富羅非魚(初始體重6.25g)的密度為90尾/m3。