周國(guó)忠 羅洪強(qiáng) 董燕媛

原發(fā)性免疫性血小板減少癥（primary immune thrombocytopenia，ITP）臨床表現(xiàn)為患者皮膚黏膜瘀斑、瘀點(diǎn)以及各種出血現(xiàn)象[1]。ITP為患者機(jī)體免疫功能紊亂和失衡等原因所導(dǎo)致的異質(zhì)性自身免疫性疾病，長(zhǎng)期用藥往往會(huì)帶來(lái)不良反應(yīng)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[2]。ITP的治療方法包括靶向性治療、免疫干預(yù)和免疫穩(wěn)態(tài)重建等。ITP患者外周血中活化的淋巴細(xì)胞增多與血小板凋亡異常有重要關(guān)系。目前，臨床尚未明確ITP患者T細(xì)胞凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ITP患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg細(xì)胞）比率與PLT，以及血小板表面Fas的表達(dá)和T細(xì)胞表面Fas配體（FasL）的表達(dá)，探討Fas-FasL凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑在ITP患者血小板異常凋亡中可能的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2015年1月至2017年4月本院血液科門診或住院的ITP患者32例（ITP組），ITP診斷根據(jù)血液和骨髓檢查確診，符合成人ITP診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。另?yè)裢趤?lái)本院行健康體檢者32例為正常對(duì)照組，排除ITP及其它自身免疫性疾病。ITP組男14例，女18例；年齡16～75歲，中位年齡34.8歲。正常對(duì)照組男13例，女19例；年齡19～68歲，中位年齡32.6歲。兩組受檢者性別、年齡比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 試劑和儀器 CD4－FITC、CD127－PE、CD25－PEcy5、CD8－FITC購(gòu)自美國(guó)BD公司。CD41－FITC購(gòu)自美國(guó) Backman Coulter公司。Fas－PE、FasL－PE 和同型對(duì)照IgG1－FITC、IgG1－PE 購(gòu)自北京Immunotech公司。溶血試劑購(gòu)自美國(guó)庫(kù)爾特公司。FC500型流式細(xì)胞儀和EPICS Q－PREP溶血儀均購(gòu)自美國(guó)庫(kù)爾特公司。

1.2.2 外周血T細(xì)胞與血小板的分離 采集ITP組患者（用藥治療前）與正常對(duì)照組受檢者外周靜脈血3ml，EDTA－K2抗凝。先以1 000 r/min離心全血2 min，提取富含血小板的血漿，再以3 000 r/min離心血漿5min提取血小板懸液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)PLT，RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整血小板濃度約2×106/ml。以FICOLL分離液分離出單個(gè)核細(xì)胞，采用溶血素溶解RBC，用10%的小牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度約為2×106/ml。

1.2.3 T細(xì)胞FasL測(cè)定 取2支試管，各加入100μl單個(gè)核細(xì)胞懸液，2管分別加入CD4－FITC、FasL－PE和CD8－FITC、FasL－PE，以上各管配備相應(yīng)的對(duì)照管。混勻，4℃避光 15min，PBS洗滌 1次，各管加入 600μl PBS緩沖液，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+FasL+細(xì)胞比率、CD8+FasL+細(xì)胞比率。

1.2.4 血小板Fas測(cè)定 取2支試管，各加入100μl血小板懸液，分別加入 20μl CD41－FITC、20μl IgG1－PE 和20μl CD41－FITC、20μl Fas－PE，混勻，4℃避光 15min，PBS洗滌1次，各管加入600μl PBS緩沖液，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD41+Fas+血小板比率。

1.2.5 Treg細(xì)胞檢測(cè) 取1支試管，加入100μl單個(gè)核細(xì)胞懸液，分別加入 20μl CD4－FITC、5μl CD127－PE 和10μl CD25－PEcy5，配備相應(yīng)的對(duì)照管?；靹?，4℃避光15min，PBS洗滌1次，各管加入600μl PBS緩沖液，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)Treg細(xì)胞比率。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察并比較ITP組患者與正常對(duì)照組受檢者CD4+FasL+細(xì)胞比率、CD8+FasL+細(xì)胞比率、CD41+Fas+血小板比率、PLT與Treg細(xì)胞比率，并分析ITP組患者以上5種指標(biāo)的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件；計(jì)量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ITP組患者與正常對(duì)照組受檢者CD4+FasL+細(xì)胞比率、CD8+FasL+細(xì)胞比率、CD41+Fas+血小板比率、PLT 與Treg細(xì)胞比率比較 見(jiàn)表1。

表1 ITP組患者與正常對(duì)照組受檢者CD4+FasL+細(xì)胞比率、CD8+FasL+細(xì)胞比率、CD41+Fas+血小板比率、PLT與Treg細(xì)胞比率比較

由表 1可見(jiàn)，ITP組患者CD4+FasL+細(xì)胞比率、CD41+Fas+血小板比率均高于正常對(duì)照組受檢者（均P＜0.05），PLT與Treg細(xì)胞比率均低于正常對(duì)照組受檢者（均P＜0.05）。ITP組患者與正常對(duì)照組受檢者CD8+FasL+細(xì)胞比率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 ITP組患者CD4+FasL+細(xì)胞比率、CD8+FasL+細(xì)胞比率、CD41+Fas+血小板比率、PLT與Treg細(xì)胞比率相關(guān)性分析 見(jiàn)表2。

表2 ITP組患者CD4+FasL+細(xì)胞比率、CD8+FasL+細(xì)胞比率、CD41+Fas+血小板比率、PLT與Treg細(xì)胞比率相關(guān)性分析（相關(guān)系數(shù)r）

由表2可見(jiàn)，ITP組患者PLT與CD4+FasL+細(xì)胞比 率、CD41+Fas+血小板比率均呈負(fù)相關(guān)（均P＜0.05），與Treg細(xì)胞比率呈正相關(guān)（P＜0.05）。Treg細(xì)胞比率與CD41+Fas+血小板比率呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。

3 討論

ITP是免疫功能紊亂造成血小板減少的出血性疾病[4-5]。本研究通過(guò)對(duì)患者淋巴細(xì)胞膜表面相關(guān)分子水平檢測(cè)，分析T淋巴細(xì)胞活化途徑介導(dǎo)的血小板細(xì)胞凋亡機(jī)制在ITP患者發(fā)病中的可能作用。

細(xì)胞凋亡途徑有Fas-FasL途徑、P53途徑和TNFR/TNF途徑等,而以Fas-FasL途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡紊亂是體液和細(xì)胞免疫失衡的主要原因[6]。Fas又稱APO-1（CD95分子），是腫瘤壞死因子受體和神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體家族成員，是Ⅰ型細(xì)胞膜蛋白，能通過(guò)死亡域間作用并促進(jìn)聚合而誘導(dǎo)凋亡，又稱為死亡分子。FasL是腫瘤死亡因子相關(guān)的Ⅱ型跨膜蛋白，是Fas抗原的天然配體[7]。Fas與FasL相互作用是細(xì)胞凋亡的重要途徑之一。FasL陽(yáng)性的細(xì)胞毒性T細(xì)胞與表達(dá)Fas的靶細(xì)胞接觸，可誘導(dǎo)靶細(xì)胞程序化死亡[8]；而Fas/FasL介導(dǎo)的凋亡機(jī)制在ITP發(fā)生、發(fā)展中仍未完全闡明，值得深入研究。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了ITP患者T細(xì)胞亞群FasL蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示T細(xì)胞各亞群FasL表達(dá)均升高。與正常對(duì)照組受檢者相比，ITP患者外周血CD4+FasL+細(xì)胞比率高，CD41+Fas+血小板比率也高。這說(shuō)明高表達(dá)Fas的血小板可與活化的T細(xì)胞上FasL結(jié)合,T細(xì)胞可通過(guò)Fas－FasL途徑直接介導(dǎo)血小板凋亡。此外，本研究結(jié)果顯示，同樣屬于T淋巴細(xì)胞，CD4+T細(xì)胞在ITP的Fas－FasL介導(dǎo)的凋亡發(fā)病機(jī)制中占主要作用，CD8+T細(xì)胞作用不明顯。

Treg細(xì)胞有免疫應(yīng)答低下和免疫抑制的功能，可抑制T、B細(xì)胞的活化、增殖和自身抗體的產(chǎn)生，在免疫性疾病發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[9]。目前Treg細(xì)胞在ITP發(fā)病機(jī)制中的作用受到重視。Treg細(xì)胞約占外周血CD4+T細(xì)胞的5%～10%。根據(jù)不同的免疫表型，Treg細(xì)胞主要包括：CD4+CD25+Treg細(xì)胞、Tr1型CD4+Treg細(xì)胞、Th3型CD4+Treg細(xì)胞和CD8+Treg細(xì)胞等亞群[10]。本研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組受檢者相比，ITP組患者外周血Treg細(xì)胞比率明顯降低；ITP組患者PLT與Treg細(xì)胞比率呈正相關(guān)。這說(shuō)明ITP患者中血小板特別低的，外周Treg細(xì)胞比率明顯減少；當(dāng)ITP患者處于緩解期時(shí)，Treg細(xì)胞比率會(huì)增高。因此Treg細(xì)胞比率或可作為ITP患者預(yù)測(cè)預(yù)后的指標(biāo)來(lái)指導(dǎo)臨床治療。

綜上所述，血小板高表達(dá)Fas可與激活的T細(xì)胞表面FasL結(jié)合，T細(xì)胞可通過(guò)Fas-FasL途徑直接介導(dǎo)血小板凋亡。本研究結(jié)果表明，F(xiàn)as、FasL表達(dá)異常在ITP患者免疫功能紊亂、T細(xì)胞亞群及血小板凋亡中起重要作用。