■李斌昌 董利鋒 王 貝， 葉疆鳳 王睿鑫 成述儒 刁其玉

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室反芻動物及其幼畜營養(yǎng)代謝中美聯(lián)合研究中心，北京100081；3.塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾843300；4.河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院，河南洛陽471000)

隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，溫室氣體排放量的增加，而溫室氣體增加使全球變暖對人類生活的影響已越來越大。2005 年我國溫室氣體凈排放總量為70.46 億噸二氧化碳當(dāng)量，其中甲烷所占比重為13.25%，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中產(chǎn)生的甲烷占總CH4產(chǎn)量的56.62%，而反芻動物排放的CH4在農(nóng)業(yè)中占57.13%[1]。反芻動物排放甲烷造成溫室氣體增加的同時(shí)也使得飼料的能量(2%～12%)損失[2]，而奶牛損失的甲烷能可達(dá)6%～10%[3]。反芻動物CH4排放與飼料營養(yǎng)成分、日糧結(jié)構(gòu)和瘤胃微生物的組成密切有關(guān)，改變?nèi)占Z的精粗比、日糧組成、瘤胃微生物以及添加外源調(diào)控劑等都可影響CH4的生成。相關(guān)研究表明，飼料的類型和日糧NFC/NDF 可顯著影響瘤胃甲烷排放[4]。李嵐捷等[5]給3～6 月齡肉犢牛飼喂不同NFC/NDF 的全混合日糧，發(fā)現(xiàn)NFC/NDF 最高組的甲烷能最低，CH4排放量最少，適當(dāng)?shù)脑黾泳峡梢杂行p少CH4排放[6-8]。目前，國內(nèi)在室外條件下，對荷斯坦后備牛甲烷排放的研究還是空白。因此本試驗(yàn)借助SF6示蹤技術(shù)，主要研究在自由采食的條件下，不同精粗比日糧對9 月齡荷斯坦后備牛CH4排放、生長性能和營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響，得出9 月齡荷斯坦后備奶牛的相關(guān)CH4排放因子，為國家溫室氣體計(jì)算提供部分?jǐn)?shù)據(jù)支持，并為CH4減排提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)與時(shí)間

2018年6月至7月在北京市房山區(qū)中加永宏奶牛場完成。

1.2 試驗(yàn)動物和試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選用15 頭[BW=(274.4±24.4) kg，月齡=9.4±0.56]健康的中國荷斯坦后備奶牛，根據(jù)月齡、體重相近的原則隨機(jī)分成低精料組（A）、中精料組（B）和高精料組（C），依次飼喂精料水平為30%、40%和50%的全混合日糧（TMR）。A 組飼喂牧場日常日糧，B、C 飼喂試驗(yàn)配置日糧。各組日糧根據(jù)NRC（2001）[9]配制，配方和營養(yǎng)成分見表1。

試驗(yàn)期18 d(預(yù)飼期10 d，正試期8 d)，正試期第3 d開始?xì)怏w代謝試驗(yàn)（共6 d）。

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)?？崭狗Q重，驅(qū)蟲后，隨機(jī)分為三組進(jìn)行飼養(yǎng)。自由采食、自由飲水，每天于8：00 和17：00 飼喂，每天16：00 清槽，投喂的干物質(zhì)按體重的3.5%供應(yīng)TMR，每天剩料占總投料量的5%～10%，隔3 d清理1次水槽和糞污。

1.4 SF6測定技術(shù)及方法

1.4.1 滲透管的制備

滲透管（北京環(huán)科易成科技有限公司生產(chǎn)）由滲透管體、密封螺母、滲透膜、密封墊和支持墊五部分組成；其規(guī)格為外徑6.21 mm、內(nèi)徑3.77 mm、高度45 mm。在制作滲透管時(shí)首先把支持墊、滲透膜、密封墊依次放入密封螺母，再把密封螺母安裝滲透管體上，然后使用0.000 1 g 精度的天平稱重，記為空管重（W1）。

表1 試驗(yàn)飼糧組成及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

滲透管裝填SF6氣體的原理是：在低溫條件下，SF6氣體會變?yōu)楣虘B(tài)。首先將滲透管體侵入液氮（-196 ℃）中冷卻約10 min，使用150 ml注射器（市場購買）分3 次向管體中打入450 ml 的SF6氣體（99.99%），然后迅速用鉗子拿出滲透管體并固定在卡槽上，使用專用扭矩扳手（扭力為5 N）擰緊密封螺母，待滲透管溫度和常溫相近，管體上沒有水珠，質(zhì)量恒定時(shí)，使用0.000 1 g 精度的天平稱量滲透管重（W2）。W2-W1為滲透管裝填SF6的質(zhì)量。

將裝填好SF6氣體的滲透管放入39 ℃恒溫的生化培養(yǎng)箱中，并通入氮?dú)猓?0 ml/min），以模擬反芻動物瘤胃環(huán)境。每隔5 d 使用0.000 1 g 精度的天平對滲透管稱重一次，連續(xù)稱重60 d，并記錄其管重?cái)?shù)據(jù)變化。對滲透管的質(zhì)量變化與時(shí)間（天/d）進(jìn)行線性回歸分析，得出回歸方程的斜率即為滲透管SF6釋放速率（mg/d）。

1.4.2 采氣設(shè)備的制備

采氣管路由連接管、毛細(xì)鋼管、過濾器、快速接頭A、快速接頭B 五部分組成。這些部件均采購自美國Swaglok 公司。由連接管依次連接過濾器、快速接頭A。在過濾器出氣端連接一個(gè)35 mm 長毛細(xì)鋼管控制采氣速率，通過專用鉗子夾毛細(xì)鋼管，使毛細(xì)鋼管在一個(gè)大氣壓下的氣體流速達(dá)到指定值（0.45 ml/min）。

集氣罐（自行設(shè)計(jì)委托生產(chǎn)）為不銹鋼材質(zhì)半徑均勻有底的圓筒，規(guī)格：半徑（r）=8 cm、高（h）=25 cm。進(jìn)氣口與長150 mm、外徑3.5 mm、內(nèi)徑2 mm 的不銹鋼材質(zhì)的圓筒一端連接，圓筒的另一端與快速接頭B連接，快速接頭B 和快速接頭A 可以快速連接取開，便于集氣罐的更換。

背墊（自行設(shè)計(jì)委托生產(chǎn)）是由帆布制成，四個(gè)角連接有尼龍帶。規(guī)格：寬70 cm、長150 cm、尼龍帶長120 cm。根據(jù)集氣罐的大小設(shè)計(jì)了兩個(gè)以帆布為材質(zhì)的袋子（帶拉鏈，便于更換集氣罐），分別固定于背墊兩側(cè)的中間。

1.4.3 相關(guān)氣體的來源

SF6純氣（99.99%）、SF6標(biāo)準(zhǔn)氣（5×10-5cm3/m3）、CH4標(biāo)準(zhǔn)氣（20 cm3/m3）（采購自北京氦普北分氣體工業(yè)有限公司）；高純氮?dú)猓?9.999%）（采購自北京利合成泰氣體有限公司）。

1.4.4 氣體樣品的采集

預(yù)飼期第4 d投喂?jié)B透管（滲透管內(nèi)SF6氣體剩余量≥400 mg、滲透速率≥2.5 mg/d），給予9 d 的穩(wěn)定期[11]。在正飼期第1 d 給試驗(yàn)牛綁定背墊，籠頭和采氣管路，并給予2 d的適應(yīng)期。

正試期采集氣體樣品，采氣前先將集氣罐用高純氮?dú)猓?9.999%）沖洗3 遍，并用真空泵抽真空（P≤-98 kPa）。每天早晨9：00 給每頭試驗(yàn)牛安裝集氣罐開始采氣，到次日早晨9：00取下并更換新的集氣罐，同時(shí)測定集氣罐收氣后的剩余壓力（-60 kPa≤P≤-50 kPa）是否在規(guī)定壓力范圍內(nèi)。每頭試驗(yàn)牛至少有4個(gè)氣體樣品。背景氣體的收集為從每個(gè)試驗(yàn)組中隨機(jī)選取一頭牛多安裝一個(gè)集氣罐，其進(jìn)氣口朝向與牛體向相反，安裝和取下的時(shí)間同上。氣體收集成功的集氣罐填充高純氮?dú)猓?9.999%），填充壓力至120～125 kPa保存，待測。

1.5 飼料樣和糞樣的采集

1.5.1 飼料樣的采集

記錄正試期每天的放料量和剩料量，計(jì)算干物質(zhì)采食量（DMI）；正試期第4、6 d 和8 d 采集各試驗(yàn)組TMR樣品和剩料樣品，每次采集TMR樣品1 000 g，剩料樣100 g，待3 次采集完混勻取1 000 g 于-20 ℃保存待測。

1.5.2 糞樣的采集

選取全部試驗(yàn)動物，正試期第4、6 d和8 d采用直腸取糞法采集糞樣，每天等時(shí)間點(diǎn)收集3 次，每次約100 g，采集完立即用10%的鹽酸固氮處理。消化代謝試驗(yàn)結(jié)束后將每頭牛3 d采集的糞樣混合、縮樣、凍存，用于營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率和酸不容灰分含量的測定。

1.6 樣品分析

1.6.1 飼料樣和糞樣的測定

將采集的飼料樣和糞樣風(fēng)干，粉碎過40目篩，依照AOAC（2000）[12]測定DM、OM、CP、EE、NDF、ADF、Ash、Ca、P 和總能（GE）。CP 含量用Ketuo KDY-9830凱氏定氮儀測定，NDF和ADF含量以ANKOM 200 Fiber Analyzer 測定，總能（GE）采用PARR-6400全自動氧彈量熱儀測定，同時(shí)測定樣品的DM和Ash含量，計(jì)算OM含量[12]。

樣品酸不容灰分的測定參照國標(biāo)（GB/T23742—2009）[13]。

營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率計(jì)算公式：

式中：D——某養(yǎng)分的消化率（%）；

a——糞中該成份含量（%）；

b——飼料中酸不容灰分含量（%）；

c——飼料中該養(yǎng)分含量（%）；

d——糞中酸不容灰分含量（%）。

1.6.2 生長性能的測定

在試驗(yàn)期第10、18 d清晨空腹稱重試驗(yàn)牛并計(jì)算其平均日增重（ADG）和料重比（F/G）。

1.6.3 氣體樣品的測定

氣體樣品CH4濃度和SF6濃度的測定由G126 型氣相色譜（上海儀電分析儀器有限公司）測定。電子捕獲檢測器（ECD）測定SF6濃度，氫火焰離子檢測器（FID）測定CH4濃度。分析條件：色譜柱長3 m，5A分子篩（60～80）；柱箱40 ℃，F(xiàn)ID 150 ℃，ECD 300 ℃；氫氣30 ml/min，氮?dú)?0 ml/min；CH4標(biāo)準(zhǔn)氣20 cm3/m3，SF6標(biāo)準(zhǔn)氣5×10-5cm3/m3。進(jìn)樣量由定量環(huán)控制。甲烷產(chǎn)量計(jì)算公式如下：

式中：QCH4——甲烷排放量(g/d)；

QSF6——滲透管SF6滲透速率(mg/d)；

QCH4樣品和QCH4背景——分別為樣品氣體和背景氣體中的CH4(cm3/m3)；

QSF6樣品和QSF6背景——分別為樣品氣體和背景氣體中SF6濃度(1×10-6cm3/m3)；

16.04和146.06——分別是CH4和SF6的分子量。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel2016 初步處理，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SAS 9.1 的單因素方差分析（one-way ANOVA），進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，差異顯著時(shí)用Duncan's法進(jìn)行多重比較。P＜0.05為差異顯著，P在0.05～0.10之間為有提高或降低的趨勢。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同精粗比對9月齡后備奶牛甲烷排放量的影響

表2 不同精粗比對后備奶牛甲烷排放量的影響

由表2 可知，隨著日糧精粗比增加，DMI 顯著增高（P＜0.05），CH4日排放量、單位代謝體重CH4排放量、單位DMI 甲烷排放量、單位有機(jī)物采食量CH4排放量、單位中性洗滌纖維采食量CH4排放量、甲烷能CH4E、甲烷能/總能攝入量（CH4E/GEI）皆顯著降低（P＜0.05）。

2.2 不同精粗比對9月齡后備奶牛生長性能的影響

由表3 可知，3 組間的初始體重、結(jié)束體重、日增重和料重比均無顯著差異(P＞0.05)。DMI B 組和C 組顯著高于A組(P＜0.05)。

表3 不同精粗比對后備奶牛生長性能的影響

2.3 不同精粗比對9 月齡后備奶牛營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響

表4 不同精粗比對后備奶牛營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響(%)

由表4可知，各處理組間DM、OM和EE的表觀消化率差異不顯著(P＞0.05)。CP的表觀消化率C組顯著高于A 和B(P＜0.05)，A 和B 無顯著差異(P＞0.05)，然而NDF 和ADF 的表觀消化率C 組顯著低于A(P＜0.05)且兩組皆與B無顯著差異(P＞0.05)。

3 討論

3.1 不同精粗比對9月齡后備奶牛甲烷排放的影響

CH4是反芻動物瘤胃發(fā)酵的必然產(chǎn)物，其排放量與動物品種、日糧組成、采食量和瘤胃發(fā)酵模式等密切相關(guān)[14]。CH4是由甲烷菌利用瘤胃其它微生物的降解底物（甲酸、乙酸、甲醇、CO2和H2）生成的[15]，其中CO2-H2還原合成CH4的途徑是瘤胃甲烷合成的主要途徑，CO2和H2主要來源于糖降解中丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酸和丁酸的過程，但丙酸可利用H2生成糖增加氫氣的消除途徑，因此CH4排放與乙酸和乙酸/丙酸正相關(guān)，與丙酸負(fù)相關(guān)[16]。Rotger[17]在牛上的研究表明，隨著飼料精粗比增加，瘤胃發(fā)酵向丙酸發(fā)酵偏移，乙酸產(chǎn)量減少，所以日糧精粗比與CH4排放顯著負(fù)相關(guān)。運(yùn)用SF6失蹤技術(shù)測定集約化養(yǎng)殖條件下后備奶牛的甲烷排放量具有可行性，本研究運(yùn)用SF6示蹤技術(shù)測定9月齡中國荷斯坦后備牛不同精料水平（30%、40%和50%）的CH4日排放量為117.7、107.10 g 和97.46 g，發(fā)現(xiàn)隨著日糧精粗比升高，CH4日排放量顯著降低，低于Jiao 等[18]采用呼吸測熱室測得的得出的結(jié)果，主要是SF6示蹤技術(shù)測得甲烷排放量不包括動物直腸產(chǎn)生甲烷[19]，因此比呼吸測熱室測得的甲烷排放量約低6%[20]。Hindrichsen 等[21]給泌乳奶牛飼喂精粗比為0∶100 和50∶50 的日糧，發(fā)現(xiàn)50∶50 組的甲烷排放量比全粗組降低了18%；樊霞等[4]的研究結(jié)果也表明隨著日糧精料比例的增加甲烷排放量顯著降低；Lovett 等[22]給肉犢牛飼喂精粗比35∶65，60∶40，90∶10的日糧時(shí)發(fā)現(xiàn)，單位代謝體重的甲烷排放量隨日糧精料比例增加顯著降低。

甲烷排放量與DMI 密切相關(guān)[23]，Ramin 等[24]認(rèn)為隨著采食量的增加，食糜通過瘤胃的速度增加，營養(yǎng)物質(zhì)在瘤胃的發(fā)酵時(shí)間減少，日糧中NFC 含量增加，NDF 含量減少，發(fā)酵模式改變，也使總甲烷排放量減少，所以單位DMI、OMI 的甲烷排放量減少，這與Aguerre 等[25]給泌乳奶牛飼喂不同精粗比（53∶47，46∶54，39∶61，32∶68）的日糧時(shí)增加精料比例而顯著減少單位DMI、OMI、DNFI 的甲烷排放量的結(jié)果一致。Jihnson 等[26]報(bào)道，奶牛CH4/GEI 約為6%，隨著日糧中精料比例的增加，CH4/GEI 可降低至4%～5%，本研究也得出相似結(jié)果。單位NDF 消化產(chǎn)生的甲烷是單位非纖維物質(zhì)的3～5倍[23]，且NDF 含量與甲烷排放是正相關(guān)的[6]，因此增加日糧NFC/NDF 減少NDF，且使瘤胃pH值降低而降低了纖維降解菌的活性和豐度導(dǎo)致NDF 的降解率降低，所以甲烷排放降低，甲烷能減小。在Aguerre 等[25]的研究中，精粗比為32∶68 組和53∶47 組的的奶牛甲烷日排放量分別為648 g/頭和538 g/頭，甲烷日排放量減少了17.2%，而本研究中NFC/NDF 高組相比于低組的甲烷日排放量也減少了17.2%。通過本研究結(jié)果與前人結(jié)果相比較，向日糧中添加精料，可以有效降低青年后備牛的甲烷排放和甲烷能/總能。但在實(shí)際生產(chǎn)中，反芻動物采食過多的精料，會引起動物酸中毒、蹄炎和過度肥胖等營養(yǎng)代謝疾病，因此日糧精粗比應(yīng)控制在適宜范圍內(nèi)。

3.2 不同精粗比對9月齡后備牛生長性能的影響

在適宜的精粗比范圍內(nèi)，日糧精粗比與日增重正相關(guān)[27]。梁大勇等[28]給荷斯坦青年公牛分別飼喂精粗比為40∶60，50∶50，60∶40 的日糧，發(fā)現(xiàn)隨著日糧精料比例增加，日增重顯著增加。日糧能量水平和日增重相關(guān)，能量攝入越多，平均日增重越高[29-30]。本試驗(yàn)中，不同精粗比日糧對日增重?zé)o顯著影響，可能是由于日糧能量水品相近所致，這也與本研究飼料營養(yǎng)物質(zhì)消化率各組間無顯著差異的結(jié)果相統(tǒng)一。在Lamas等[31]的試驗(yàn)中，隨著日糧精粗比的增加，干物質(zhì)采食量顯著增加，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致，也與王吉峰[32]、Weiss 等[33]的研究相同。NRC[9]認(rèn)為，消化率低的飼料限制干物質(zhì)采食量，因?yàn)槠湎俣嚷?，在消化道停留時(shí)間長，因此提高日糧精料水平(小于60%)總能提高干物質(zhì)采食量。本試驗(yàn)結(jié)果表明，日糧精飼料從30%增加到50%，并沒有改變后備奶牛的增重，說明此生理階段的后備牛，可以利用粗飼料，從飼料轉(zhuǎn)化效率和飼料成本的角度分析，后備牛應(yīng)該飼喂精料在30%左右的日糧，對于生產(chǎn)實(shí)際起到有利作用。

3.3 不同精粗比對9 月齡后備牛營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響

適宜的精料比例可以提高反芻動物對日糧中營養(yǎng)物質(zhì)的利用，本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼喂精粗比30∶70，40∶60，50∶50 的日糧，后備牛DM、OM 的表觀消化率無顯著差異，粗蛋白質(zhì)表觀消化率顯著提高，但NDF和ADF的表觀消化率顯著下降，這與汪水平等[34]和Macgrgeor等[35]的結(jié)果一致，表明9月齡后備牛瘤胃發(fā)育成熟，具有消化粗飼料的能力，應(yīng)維持日糧的精粗比在30%為宜。而在Dado 等[36]和Yang 等[37]的研究中，提高日糧精料比可顯著提高DM 和OM 的表觀消化率，這可能與日糧中NDF水平有關(guān)。隨著日糧精料比例增加，快速可發(fā)酵碳水化合物數(shù)量增加，纖維的消化速度和流量會變化[9]，所以在一定精粗比范圍內(nèi)，纖維和非纖維營養(yǎng)物質(zhì)的消化率是動態(tài)平衡的，因?yàn)殡S著日糧NFC/NDF增加，pH值顯著升高，瘤胃纖維降解菌活性和豐度顯著降低[38-40]，使纖維降解率降低，而NFC是易消化有機(jī)物，可在瘤胃降解也可在后腸道消化吸收。瘤胃蛋白降解菌主要有棲瘤胃普雷沃氏菌、嗜淀粉瘤胃桿菌和溶纖維丁酸弧菌[41]，雖然溶纖維丁酸弧菌會隨NFC/NDF下降[42]，但棲瘤胃普雷沃氏菌與日糧蛋白含量正相關(guān)[43]，淀粉分解菌與NFC/NDF正相關(guān)[44]。這可以解釋本試驗(yàn)的CP 的消化率隨著精粗比增加而增高，與Dado 等[36]和Yang 等[37]的高精料組CP消化率高的結(jié)果一致。提高日糧精粗比，降低了纖維的消化率，使甲烷菌合成甲烷的前體物質(zhì)H2減少，因此瘤胃甲烷排放降低。

4 結(jié)論

在本試驗(yàn)條件下，得出如下結(jié)論：

①提高日糧精粗比能夠有效減少9 月齡后備奶牛的甲烷排放，但綜合其對生長性能和營養(yǎng)物質(zhì)消化的影響及牧場經(jīng)濟(jì)效益，應(yīng)給9月齡后備奶牛飼喂精料水平約30%的日糧為益，甲烷排放量為117.7 g/d。

②提高日糧精粗比，可以提高9月齡后備奶牛的粗蛋白消化率和干物質(zhì)采食量，降低纖維的消化率，且對干物質(zhì)和有機(jī)物的消化率無顯著影響和日增重?zé)o顯著影響。