周敬華，韓瑞鈺，陳拽生，默義，周策，王樹松

(河北省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究院，國家衛(wèi)計(jì)委計(jì)劃生育與優(yōu)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石家莊 050071)

目前人類生殖能力呈下降趨勢(shì)，約有20%的育齡夫婦受到不孕不育的困擾，其中男性因素占到40%～60%[1]。特別是近年來，隨著周圍環(huán)境帶來的各種污染、生活壓力增大、生活方式改變等因素的影響，男性精液質(zhì)量呈下降趨勢(shì)[2]。精子形態(tài)分析在男性不育癥的診斷和治療中發(fā)揮著重要的作用[3]。在精液形態(tài)參數(shù)中胞漿小滴(cytoplasmic droplet)和過量殘留胞漿(excess residual cytoplasm)作為精子正常和異常部分對(duì)其產(chǎn)生截然不同的影響[4]。

早在2003年Fischer等[5]以有生育力和不育男子精液作為標(biāo)本進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)精子殘留胞漿與精子DNA變性呈正相關(guān)，不能生育的男性精子殘留胞漿和變性DNA的含量明顯高于能生育男子。但是國內(nèi)對(duì)于過量殘留胞漿與男性不育的研究很少，本文的研究目的是比較不同過量殘留胞漿比例組男性精液的檢測(cè)指標(biāo)，探討過量殘留胞漿與男性精液質(zhì)量的相關(guān)性，進(jìn)一步確定過量殘留胞漿在男性不育中的影響。

資料與方法

一、研究對(duì)象

收集2018年1～4月在本院男科門診就診的年齡在22～45歲的男性生育咨詢患者為研究對(duì)象，共198例。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)存在外傷及遺傳性疾病家族史；(2)睪丸、附睪和輸精管存在異常；(3)患有乙肝、淋病、梅毒等傳染性疾?。?4)染色體核型異常。取其完整精液標(biāo)本進(jìn)行分析，并簽訂知情同意書。

二、主要儀器、試劑

Diff-Quick精子形態(tài)染色試劑購自深圳華康生物醫(yī)學(xué)工程有限公司。精子質(zhì)量分析儀(江蘇瑞祺CFT-9201)、相差顯微鏡BX43(奧林巴斯，日本)，DM750光學(xué)顯微鏡(萊卡，德國)。

三、研究方法

1.精液常規(guī)分析：禁欲時(shí)間為2～7 d，手淫法取精，采用一次性專用塑料取精杯收集射出來的全部精液，立即送實(shí)驗(yàn)室，精液液化后按照WHO《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(第5版)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行精液質(zhì)量分析。精液體積：采用稱重法測(cè)量精液體積；精子濃度：在200倍相差顯微鏡下，精液標(biāo)本采用計(jì)算機(jī)輔助精液分析系統(tǒng)(CASA)計(jì)數(shù)；前向運(yùn)動(dòng)：精子主動(dòng)地呈直線或沿一大圓周運(yùn)動(dòng)，不管速度如何；非前向運(yùn)動(dòng)：所有其他非前向運(yùn)動(dòng)的形式，如以小圓周泳動(dòng)，尾部動(dòng)力幾乎不能驅(qū)使頭部移動(dòng)，或者只能觀察到尾部擺動(dòng)。系統(tǒng)觀察至少6個(gè)視野，對(duì)至少200個(gè)精子進(jìn)行分級(jí)，計(jì)數(shù)前向運(yùn)動(dòng)和 非前向運(yùn)動(dòng)精子的百分率。

2. 精液形態(tài)分析：參照WHO《人類精液檢查處理實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》(第5版)用Diff-Quik快速染色法進(jìn)行形態(tài)評(píng)估，用油鏡檢查已染色的涂片。按照WHO推薦標(biāo)準(zhǔn)對(duì)精子形態(tài)進(jìn)行評(píng)估，判斷標(biāo)準(zhǔn)：精子頭部外形上應(yīng)該是光滑、輪廓規(guī)則，大體上呈橢圓形；頂體區(qū)可清晰分辨，占頭部的40%～70%；頂體區(qū)沒有大空泡，并且不超過2個(gè)小空泡，空泡大小不超過頭部的 20%；頂體后區(qū)不含任何空泡。中段應(yīng)該細(xì)長(zhǎng)、規(guī)則，大約與頭部長(zhǎng)度相等；中段主軸應(yīng)與頭部長(zhǎng)軸成一條直線。殘留胞漿只有在過量時(shí)才被認(rèn)為是異常的，即胞漿超過了精子頭大小的1/3時(shí)被認(rèn)為過量殘留胞漿。主段應(yīng)該比中段細(xì)，均一，其長(zhǎng)約45 μm(約為頭部長(zhǎng)度的 10倍)；尾部應(yīng)沒有顯示鞭毛折斷的銳利折角；主段可以自身卷曲成環(huán)狀。按照上述判斷標(biāo)準(zhǔn)每例患者均隨機(jī)計(jì)數(shù)200個(gè)以上精子，并換算出精子形態(tài)畸形率。如：過量殘留胞漿比例是指計(jì)數(shù)至少200條精子，其中含有過量殘留胞漿的精子數(shù)除以計(jì)數(shù)的所有精子數(shù)所得的百分比，具體圖示見圖1。

注：箭頭所指處為過量殘留胞漿精子圖1 過量殘留胞漿精子與正常形態(tài)精子(Diff-Quik快速染色法)

3.精液質(zhì)量分析標(biāo)準(zhǔn)：按照WHO《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(第5版)作為精子質(zhì)量分析的參考標(biāo)準(zhǔn)：(1)精液體積≥1.5 ml；(2)精液PH≥7.2；(3)精子濃度≥15×106/ml；(4)前向運(yùn)動(dòng)精子比例≥32%；(5)總活力(前向運(yùn)動(dòng)+非前向運(yùn)動(dòng)精子比例)≥40%；(6)正常形態(tài)精子比例≥4%。

4.分組：按照三分位法將過量殘留胞漿精子比例進(jìn)行分組，胞漿殘留比例≤7%的為第1組，共68例；胞漿殘留比例7.1%～11.0%的為第2組，共66例；胞漿殘留比例>11%的為第3組，共64例。分別比較各組間精液的不同參數(shù)，并分析此198例標(biāo)本中精子過量殘留胞漿與精液各參數(shù)間的相關(guān)性。

5.檢測(cè)指標(biāo)：分別記錄禁欲天數(shù)、精液體積、精子濃度、精子活力百分比(前向運(yùn)動(dòng)精子、非前向運(yùn)動(dòng)精子及不動(dòng)精子)、精子異常形態(tài)百分比(頭部缺陷、頸部缺陷、尾部缺陷、頂體缺陷及過量殘留胞漿比例)。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、不同過量殘留胞漿比率組的患者精液質(zhì)量

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與第3組相比，第1組患者的正常形態(tài)率升高、頭部缺陷率及頸部缺陷率下降，具有顯著性差異(P<0.05)；第2組的濃度和正常形態(tài)率升高、頭部缺陷率及頸部缺陷率下降，具有顯著性差異(P<0.05)。隨著精液過量殘留胞漿比例增高，精子前向運(yùn)動(dòng)呈現(xiàn)“下降”趨勢(shì)，在非前向運(yùn)動(dòng)上呈“上升”趨勢(shì)，在濃度上呈現(xiàn)“先上升后下降”趨勢(shì)(表1)。

表1 不同過量殘留胞漿比例組的精液參數(shù)比較(-±s)

注：與第3組比較，*P<0.05

二、過量殘留胞漿比例與精液參數(shù)的相關(guān)性

相關(guān)性分析顯示：過量殘留胞漿比例與精液濃度、精子正常形態(tài)率呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；過量殘留胞漿比例與禁欲天數(shù)、非前向運(yùn)動(dòng)百分比、頭部畸形率、頸部畸形率、尾部畸形率呈顯著正相關(guān)(P<0.05)(表2)。

表2 過量殘留胞漿比例與精液參數(shù)的相關(guān)性

三、過量殘留胞漿比例預(yù)測(cè)弱精子癥及畸形精子癥的ROC曲線分析

以精液分析結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)不同的過量殘留胞漿比例計(jì)算過量殘留胞漿比例篩查弱精子癥和畸形精子癥的靈敏度和特異度。以敏感度為縱坐標(biāo)，1-特異度為橫坐標(biāo)，繪制ROC曲線(圖2、3)。當(dāng)取過量殘留胞漿比例9.1%為cut-off值時(shí)，分析其診斷弱精子癥(精子前向運(yùn)動(dòng)<32%)的敏感性為64.9%，特異性為54.4%，ROC曲線下面積為0.614，標(biāo)準(zhǔn)誤為0.045，其95%置信區(qū)間(CI)為(0.526，0.702)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；當(dāng)取過量殘留胞漿比例9.1%為cut-off值時(shí)，分析其診斷畸形精子癥(精子正常形態(tài)率<4%)的敏感性為56.7%，特異性為60.6%，ROC曲線下面積為0.610，標(biāo)準(zhǔn)誤為0.04，其95%CI為(0.532，0.689)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表3)。

圖2 過量殘留胞漿比例診斷弱精子癥的ROC曲線

圖3 過量殘留胞漿比例診斷畸形精子癥的ROC曲線

表3 過量殘留胞漿比例預(yù)測(cè)弱精子癥及畸形精子癥分析

討 論

男性精液檢測(cè)在診斷和治療不育癥中起著非常重要的作用，特別是對(duì)于精子形態(tài)的評(píng)估與男性不育具有密切的相關(guān)性，是評(píng)估男性生殖能力的一個(gè)重要指標(biāo)。有研究表明，男性不育人群中由精液異常所致的不育癥比例高達(dá)70%～80%[6]。雖然從理論上講，卵母細(xì)胞受精只需一條正常精子就可以，但根據(jù)WHO相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求，當(dāng)正常精子形態(tài)率小于4%，即精子形態(tài)畸形率大于96%時(shí)，就很難自然受孕。對(duì)于采用輔助生育技術(shù)(ART)的夫婦來說，男性精子形態(tài)和質(zhì)量也同樣至關(guān)重要。

通常正常的精子發(fā)生后，大部分精子胞漿通過支持細(xì)胞的“細(xì)胞質(zhì)擠壓”過程來實(shí)現(xiàn)壓縮，在睪丸的管腔中，支持細(xì)胞將大部分細(xì)胞質(zhì)吞噬為“殘余體”，其余部分，大小不會(huì)超過精子頭部的1/3，這部分胞漿稱為胞漿小滴。在大多數(shù)非人類哺乳動(dòng)物當(dāng)中，這些胞漿小滴從尾部向下遷移并最終在射精時(shí)流出，但人類卻不同，正常人類精子中的胞漿小滴在射精后仍然存在。根據(jù)WHO的最新規(guī)定，胞漿小滴是人類精子有生理功能的正常成分，其含有的少量胞漿內(nèi)儲(chǔ)存的多種酶，可以產(chǎn)生適量的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，在精子運(yùn)動(dòng)、獲能、超激活運(yùn)動(dòng)、頂體反應(yīng)和精卵融合等過程中發(fā)揮重要作用[7-8]。而當(dāng)胞漿小滴超過精子頭部的1/3時(shí)，稱為過量殘留胞漿，攜帶過量殘留胞漿的精子在精子發(fā)生過程中“細(xì)胞質(zhì)擠壓”中斷，導(dǎo)致精子發(fā)生過程受損，因此帶有過量殘留胞漿的精子在發(fā)生過程中是具有“成熟障礙”的。Cooper等[9]所做的研究闡述了胞漿小滴和過量殘留胞漿最大的不同是，過量殘留胞漿幸存于用人類的空氣干燥技術(shù)做的精液涂片，而胞漿小滴沒有；二者在位置上也有區(qū)別，過量殘留胞漿可能跨越整個(gè)中段區(qū)域，而胞漿小滴則更集中在精子中間的頸部。

早在1997年，Keating等[10]就研究發(fā)現(xiàn)胞漿殘留的存在與體外受精(IVF)的成功率成顯著負(fù)相關(guān)，與精子膜的完整性及精子濃度也成負(fù)相關(guān)。俞建軍等[11]同樣證實(shí)不育組精子殘留胞漿的比例顯著高于生育組，并推測(cè)過量殘留胞漿可能導(dǎo)致不育的原因是影響了精子的運(yùn)動(dòng)速度，由于其不脫落進(jìn)一步影響到頂部質(zhì)膜的暴露繼而影響受精。本文通過比較不同過量殘留胞漿比例組男性精液的檢測(cè)指標(biāo)，結(jié)果顯示過量殘留胞漿比例高的組相比于過量殘留胞漿比例低的組，二者在精液參數(shù)上有不同程度的差異，隨著精液過量殘留胞漿比例增高，精子在前向運(yùn)動(dòng)上呈現(xiàn)“下降”趨勢(shì)，因此，我們推測(cè)：過量殘留胞漿是因?yàn)榻档土司拥那跋蜻\(yùn)動(dòng)，從而影響了精子的總活力。相關(guān)性分析顯示過量殘留胞漿比例與精液濃度、精子正常形態(tài)率呈顯著負(fù)相關(guān)，過量殘留胞漿比例與禁欲天數(shù)、非前向運(yùn)動(dòng)百分比、頭部畸形率、頸部畸形率、尾部畸形率呈顯著正相關(guān)。這與之前的一些研究結(jié)果大體一致。

過量殘留胞漿由于胞漿含量高，因此含有較高水平的G6PDH，導(dǎo)致更多的NADPH產(chǎn)生，NADPH是ROS產(chǎn)生NADPH氧化酶的底物[12]，由于高ROS水平，精子可能呈現(xiàn)氧化應(yīng)激狀態(tài)，其特征在于對(duì)線粒體和核DNA[13]以及對(duì)精子質(zhì)膜的過氧化損傷[14]，使精子活力和功能受損，影響獲能和受精[15]。因此我們推測(cè)，高比例的過量殘留胞漿會(huì)產(chǎn)生高水平的ROS，同時(shí)升高的ROS水平與增加的細(xì)胞凋亡有關(guān)[16]，當(dāng)ROS水平超過身體抗氧化系統(tǒng)的能力時(shí)，出現(xiàn)氧化應(yīng)激(Oxidative Stress，OS)[17]，OS對(duì)精子發(fā)生中不成熟精子轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒炀拥倪@個(gè)最后階段產(chǎn)生影響。精子從生精小管到附睪轉(zhuǎn)移期間可能受到損傷，結(jié)果導(dǎo)致成熟精子中的OS-依賴型損傷[18]。如此一來，便造成了OS影響精子發(fā)生，使精子保留過量殘留胞漿，過量殘留胞漿又產(chǎn)生過多的ROS，ROS升高導(dǎo)致OS發(fā)生的惡性循環(huán)，最終影響了精子的活力和形態(tài)。

本研究還對(duì)過量殘留胞漿比例預(yù)測(cè)弱精子癥和畸形精子癥做了分析，結(jié)果顯示，當(dāng)取過量殘留胞漿比例9.1%為cut-off值時(shí)，其對(duì)于診斷弱精子癥和畸形精子癥具有一定的價(jià)值。提示在臨床工作中，過量殘留胞漿精子比例高的精液，可能對(duì)畸形精子癥或弱精子癥的診斷提供了一定的預(yù)測(cè)價(jià)值，對(duì)臨床診斷及治療具有一定的參考意義。為了降低由于過量殘留胞漿產(chǎn)生的過多ROS，可以采用抗氧化劑處理，如使用具有抗氧化作用的維生素A、維生素C、維生素E(生育酚)、谷胱甘肽(GSH)、番茄紅素等[19]。因?yàn)檫^量殘留胞漿和隨后的精子DNA碎片增加，精卵結(jié)合障礙，卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)可以作為改善這一障礙的干預(yù)措施[20]。

本研究同時(shí)提示我們?cè)诜治鼍嘿|(zhì)量參數(shù)對(duì)于臨床的指導(dǎo)意義時(shí)，還要更全面地了解過量殘留胞漿這個(gè)特殊結(jié)構(gòu)與男性不育發(fā)生的關(guān)系，嘗試檢測(cè)人類男性攜帶過量殘留胞漿的發(fā)病率，有意識(shí)地將過量殘留胞漿的檢測(cè)結(jié)果和精液其他常規(guī)檢測(cè)結(jié)果聯(lián)合起來作為評(píng)價(jià)精子功能和藥物療效的有效參數(shù)，這樣可能更準(zhǔn)確、全面地反映精子質(zhì)量，彌補(bǔ)單項(xiàng)指標(biāo)對(duì)生育能力評(píng)估的不足，為尋找治療男性不育提供新的思路。但由于本研究樣本量較少，因此在今后的研究中應(yīng)該擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步在臨床中加以探討和驗(yàn)證，以期更完整地了解其對(duì)于男性不育的影響。