尹 歡 卓鳳萍 鄧可宣 任茂智

(1.重慶大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 重慶 401331; 2.重慶科技學(xué)院, 重慶 401331)

鉀離子(K+)是植物細(xì)胞中最豐富的必需陽(yáng)離子，在植物發(fā)育生長(zhǎng)過程中起著至關(guān)重要的作用。K+缺失將導(dǎo)致植物生長(zhǎng)停滯和光合作用降低，從而嚴(yán)重影響作物產(chǎn)量。

由于土壤中的K+含量有限，許多植物遭受K+缺失脅迫[1]。為了適應(yīng)K+缺乏的環(huán)境，植物已經(jīng)進(jìn)化出相應(yīng)的分子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，以確保它們自身的鉀穩(wěn)態(tài)。依靠鉀離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，植物可以從土壤中吸收K+，并將K+從根部轉(zhuǎn)移到枝條或其他位點(diǎn)[2]。近年來，在植物中已經(jīng)鑒定出大量鉀離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它們被認(rèn)為是感知和吸收K+的關(guān)鍵參與者。據(jù)有關(guān)研究報(bào)道，擬南芥的K+通道包含 9個(gè) Shaker K+通道、5個(gè)TPK K+通道和1個(gè)Kir-like K+通道[3]。與其他轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相比，Shaker K+通道是構(gòu)成質(zhì)膜中的主要K+通路。Shaker K+通道定位于質(zhì)膜上，在K+吸收中起著至關(guān)重要的作用[4]。

本次研究，對(duì)StShaker基因進(jìn)行了全基因組鑒定，分析了StShaker的系統(tǒng)發(fā)育、基因結(jié)構(gòu)、保守基序和染色體位置；檢測(cè)了馬鈴薯Shaker基因在低鉀處理后基因的差異表達(dá)變化。

1 材料和方法

材料使用實(shí)驗(yàn)室保存的馬鈴薯組培苗(品種為Desiree)。

1.1 馬鈴薯Shaker基因的篩選

為了鑒定馬鈴薯的Shaker成員，從權(quán)威的擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)TAIR中，找到已報(bào)道的擬南芥Shaker蛋白序列，將其當(dāng)作源序列，在馬鈴薯數(shù)據(jù)庫(kù)PGSC中進(jìn)行篩選。為了保證預(yù)測(cè)基因的可靠性，使用在線網(wǎng)站SMART(http:∥smart.embl-heidelberg.de)分析保守結(jié)構(gòu)域，以鑒定基因；使用 ExPASy(https:∥web.expasy.orgcompute_pi)計(jì)算StShaker蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量。

1.2 Shaker蛋白的多序列比對(duì)

使用具有默認(rèn)參數(shù)的ClustalX 1.83軟件和ExPASy，將來自馬鈴薯、西紅柿、擬南芥、辣椒和煙草的Shaker蛋白質(zhì)序列，進(jìn)行多序列比對(duì)(MSA)[5]。除馬鈴薯和擬南芥外，其他數(shù)據(jù)均來自NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)。為了比較Shaker基因的進(jìn)化關(guān)系，使用MEGA7.0打開得到的MSA文件，運(yùn)用Neighbor-Joining方法，自展值bootstrap為1 000時(shí)，構(gòu)建多物種的進(jìn)化樹[6]。

1.3 馬鈴薯Shaker的外顯子內(nèi)含子分析

使用ClustalX 1.83軟件，進(jìn)行馬鈴薯和擬南芥Shaker蛋白序列的多序列比對(duì)，運(yùn)用MEGA 7.0的Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。在GSDS 2.0中，通過比較CDS序列及其相應(yīng)的基因組序列，確定StShaker的外顯子內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。

1.4 馬鈴薯Shaker基因的基序分析

1.5 馬鈴薯Shaker基因的染色體定位

為了顯示StShaker基因在染色體上的位置，從馬鈴薯基因組注釋信息的gff3文件中，提取信息到MapInspect軟件，繪制染色體分布圖像。

1.6 馬鈴薯Shaker基因的表達(dá)分析

將無菌馬鈴薯莖段插入裝有固體MS培養(yǎng)基的組培瓶，將組培瓶放到22 ℃的植物生長(zhǎng)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光周期為16 h光照8 h黑暗。低鉀處理馬鈴薯莖段：將生長(zhǎng)1周后的馬鈴薯幼苗轉(zhuǎn)移至低鉀液體培養(yǎng)基和MS液體培養(yǎng)基中，兩種培養(yǎng)基內(nèi)馬鈴薯幼苗數(shù)量相同，分別處理24、48、72 h后取樣。每天更換新的液體培養(yǎng)基。處理結(jié)束后，快速收集樣品，在液氮中冷凍，將樣品儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱中以進(jìn)行RNA提取，反轉(zhuǎn)錄做qRT-PCR。低鉀培養(yǎng)基中的K+濃度最終約為100 μmolL[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯Shaker基因的鑒定

為了鑒定馬鈴薯StShaker基因，將擬南芥Shaker蛋白質(zhì)序列作為源序列，在馬鈴薯數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索，共獲得22個(gè)假定的StShaker基因。通過多序列比對(duì)及保守結(jié)構(gòu)域分析，去除冗余序列，最終發(fā)現(xiàn)，除了2個(gè)已報(bào)道的StShaker基因(SKT1和KST1)，還鑒定出7個(gè)新的StShaker基因。這9個(gè)StShaker蛋白的相對(duì)分子量在68.70～98.50 kDa之間；等電點(diǎn)范圍為5.99～8.94，表明StShaker存在于細(xì)胞的不同區(qū)域并起對(duì)應(yīng)作用；StShaker蛋白的全長(zhǎng)在607～874個(gè)氨基酸之間，基因組序列的長(zhǎng)度范圍為1 836～8 262 bp(見表1)。

表1 馬鈴薯Shaker的基因家族信息

為了能更好地反映StShaker和AtShaker的同源關(guān)系，通過5個(gè)物種Shaker蛋白序列的多重比對(duì)，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹。其中，來自擬南芥的Shaker蛋白序列有9個(gè)，來自馬鈴薯的有9個(gè)，來自辣椒的有11個(gè)，來自西紅柿的有10個(gè)，來自煙草的有16個(gè)。StShaker的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，StShaker聚類可以分為5組。StShaker4、StShaker6、StShaker9聚集在Ⅰ組；StShaker2、StShaker3屬于Ⅱ組；StShaker1、StShaker7在Ⅲ組；StShaker5和StShaker8分別在Ⅳ組和Ⅴ組(見圖1)。這些結(jié)果證明了最初的假設(shè)，即馬鈴薯具有9個(gè)Shaker K+通道，并且各種StShaker在不同條件下發(fā)揮不同的作用。

2.3 馬鈴薯Shaker蛋白的多序列比對(duì)

用ClustalX 1.83和ExPASy進(jìn)行StShaker蛋白質(zhì)序列的多重比對(duì)，發(fā)現(xiàn)在其N-末端存在約150個(gè)氨基酸殘基的高度保守區(qū)域。所有StShaker K+通道蛋白，在該區(qū)域都具有成孔結(jié)構(gòu)域，并且該結(jié)構(gòu)域中的TXXTXGYG基序高度保守。在SMART網(wǎng)站中分析結(jié)構(gòu)域，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了4個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，它們被命名為結(jié)構(gòu)域Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ，具體為Ion_trans_2結(jié)構(gòu)域、cNMP結(jié)構(gòu)域、ANK結(jié)構(gòu)域和KHA結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域Ⅰ是特異性的跨膜鉀離子通道；結(jié)構(gòu)域Ⅱ存在于離子通道和cNMP依賴性激酶中；結(jié)構(gòu)域Ⅲ含有多個(gè)相同短序列重復(fù)；結(jié)構(gòu)域Ⅳ是富含疏水性和酸性殘基的鉀離子通道的二聚化結(jié)構(gòu)域[8]。結(jié)構(gòu)域Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ都是高度保守的，而結(jié)構(gòu)域Ⅲ不是非常保守，這很有可能是因?yàn)檫M(jìn)化中序列發(fā)生了改變。大多數(shù)StShaker都有4個(gè)結(jié)構(gòu)域，只有StShaker5失去了錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域，而擬南芥中的ATKC1的結(jié)構(gòu)和StShaker5的情況相同[9]。這證明了擬南芥和馬鈴薯Shaker結(jié)構(gòu)的相似性。

圖1 馬鈴薯Shaker基因家族的系統(tǒng)發(fā)育圖

通過比較CDS序列及其相應(yīng)的基因組序列，確定StShaker基因的外顯子內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。StShaker的基因結(jié)構(gòu)顯示，內(nèi)含子的數(shù)量范圍為10～12，而StShaker6中沒有內(nèi)含子(見圖2)，這可能是由于馬鈴薯中StShaker6在進(jìn)化過程中內(nèi)含子缺失造成的。與系統(tǒng)發(fā)育分析一致的是，具有相同或相似外顯子內(nèi)含子結(jié)構(gòu)和基因長(zhǎng)度的StShaker基因，聚集在同一組中。這也表明了StShaker基因結(jié)構(gòu)的保守性。

2.5 馬鈴薯Shaker基因的基序

用在線MEME分析工具進(jìn)一步分析了StShaker蛋白的保守基序，將基序數(shù)設(shè)置為20。結(jié)果顯示，所有StShaker蛋白由12個(gè)高度保守的基序組成，包括基序2、4、5、6、7、9、11、12、13、14、15和18(見圖3)。StShaker蛋白在同一組中具有相似的基序分布?；?8是位于結(jié)構(gòu)域Ⅰ中的TXXTXGYGD基序，它是Shaker K+通道中的典型序列，在鉀離子選擇中起重要作用。

2.6 馬鈴薯Shaker基因的染色體定位

9個(gè)StShaker基因，定位于12條馬鈴薯染色體中的7條(Chr1、Chr2、Chr8、Chr9、Chr10、Chr11、Chr12)上。StShaker1位于Chr1。Chr8包含3個(gè)StShaker基因：StShaker3、StShaker4、StShaker5。StShaker2、StShaker6、StShaker7、StShaker8、StShaker9分別位于Chr2、Chr9、Chr10、Chr11、Chr12上。

2.7 馬鈴薯Shaker基因在低鉀脅迫下的表達(dá)模式

Shaker K+通道在響應(yīng)植物低鉀脅迫中起著至關(guān)重要的作用。例如：內(nèi)向整流K+通道AKT1在根中表達(dá)相對(duì)較高，能從低K+濃度的環(huán)境(低至 10 μmolL)吸收鉀離子，因此在擬南芥對(duì)低鉀脅迫的抗性中發(fā)揮了重要作用；OsAKT1也參與了對(duì)水稻低鉀脅迫和鹽脅迫的反應(yīng)[10]。

圖2 馬鈴薯Shaker基因家族的基因結(jié)構(gòu)

圖3 馬鈴薯Shaker基因家族的基序

為了探究低鉀脅迫下StShaker基因的表達(dá)量變化，在正常和低鉀條件下處理馬鈴薯莖段，定量PCR檢測(cè)StShaker的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低鉀脅迫不影響StShaker基因的表達(dá)。在低鉀條件下，StShaker1、StShaker2、StShaker6、StShaker7、StShaker9的表達(dá)水平仍顯著高于StShaker3、StShaker4、StShaker5、StShaker8。大多數(shù)StShaker基因不受低鉀脅迫的影響，即使是經(jīng)過了長(zhǎng)期(72 h)處理的(見圖4)。低鉀脅迫處理擬南芥時(shí)，大多數(shù)擬南芥AtShaker基因的表達(dá)量也沒有顯著變化，這與馬鈴薯StShaker基因的變化相似[11]。這表明StShaker基因不是直接在轉(zhuǎn)錄水平上響應(yīng)低鉀脅迫的，很有可能是在轉(zhuǎn)錄后水平上來響應(yīng)低鉀脅迫以調(diào)控馬鈴薯的生長(zhǎng)。

有趣的是，雖然低鉀脅迫對(duì)Shaker基因在許多物種中的表達(dá)調(diào)控沒有顯著影響，但大量報(bào)道顯示，鹽脅迫對(duì)Shaker基因調(diào)控有明顯影響，暗示了Shaker基因家族在植物鹽脅迫響應(yīng)中具有重要作用[12]。

3 結(jié) 論

馬鈴薯是一種非常重要的經(jīng)濟(jì)作物，鉀營(yíng)養(yǎng)對(duì)馬鈴薯的生長(zhǎng)和產(chǎn)量具有重要影響。Shaker基因家族成員參與了植物對(duì)鉀的吸收過程，并在許多非生物脅迫特別是低鉀脅迫下發(fā)揮了重要作用。

為驗(yàn)證Shaker K+通道的功能，將擬南芥Shaker蛋白質(zhì)序列作為源序列，在馬鈴薯數(shù)據(jù)庫(kù)PGSC中搜索，獲得22個(gè)StShaker基因；再通過多序列比對(duì)和保守結(jié)構(gòu)域分析，去除冗余序列，最終從馬鈴薯基因組中鑒定出9個(gè)StShaker基因。通過分析其外顯子內(nèi)含子結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā)育樹和染色體分布等，發(fā)現(xiàn)可將9個(gè)StShaker基因在進(jìn)化樹上分為5支，具有4個(gè)保守結(jié)構(gòu)域。最后，用低鉀處理馬鈴薯莖段的qRT-PCR分析Shaker基因表達(dá)譜，結(jié)果表明StShaker不直接在轉(zhuǎn)錄水平上響應(yīng)低鉀脅迫。因此，StShaker基因很有可能從轉(zhuǎn)錄后水平上來響應(yīng)低鉀脅迫，以調(diào)控馬鈴薯對(duì)鉀離子的吸收。

圖4 馬鈴薯Shaker基因家族低鉀脅迫的表達(dá)