蔣慶鋒 程金華 申思寧 程紀(jì)偉 邢文群

食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)主要發(fā)生于食管內(nèi)且向鱗狀上皮分化形成的一種惡性腫瘤，常發(fā)生于生理性或病理性狹窄處，具有較高發(fā)生率及預(yù)后差等特性[1]。目前腫瘤診斷及治療水平的提高，但食管鱗癌的治療及預(yù)后無(wú)明顯改善。研究表明食管鱗癌的發(fā)生與原癌基因、抑癌基因等有關(guān)[2]。miRNA(microRNA)是一類(lèi)內(nèi)源性非編碼RNA分子且在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮抑癌或促癌的作用，研究表明miR-802可在舌鱗狀細(xì)胞癌中抑制腫瘤細(xì)胞的增殖及分化[3]。研究證實(shí)RAB23在胃癌組織中上調(diào)表達(dá)并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲及遷移[4]。目前關(guān)于miR-802與RAB23在食管鱗癌中的研究相對(duì)較少，因此本研究主要探討食管鱗癌組織中miR-802與RAB23表達(dá)水平并探究二者是否具有相關(guān)性及其臨床意義。

資料與方法

1.一般資料:收集120例筆者醫(yī)院病理科2014年3月～2015年2月期間進(jìn)行食管鱗癌切除手術(shù)的標(biāo)本為食管鱗癌組，另選取癌旁正常組織為對(duì)照組，所有患者均經(jīng)病理證實(shí)為食管鱗狀癌。食管鱗癌組120例，其中男性57例，女性63例，患者年齡45～70歲，平均年齡59.25±6.56歲。正常組120例，其中男性53例，女性67例，患者年齡47～72歲，平均年齡60.86±5.15歲。收集兩組臨床病理資料，包括腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、組織分化程度、浸潤(rùn)程度等。按照食管癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)分為Ⅰ期19例，Ⅱ期22例、Ⅲ期48例、Ⅳ期31例[5]。根據(jù)評(píng)估組織分化程度：高分化 28例、中分化 51例、低分化 41例[6]。納入標(biāo)準(zhǔn)：①食管鱗癌癌患者均經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)；②未進(jìn)行化學(xué)治療或放射治療者；③病灶無(wú)明顯壞死區(qū)；④患者知情且簽署同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①自身免疫性疾病者；②具有明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)癌旁組織；③嚴(yán)重腎臟損傷者；④臨床資料不全者。兩組臨床資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.研究方法：(1)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)法食管鱗狀細(xì)胞組織中miR-802與RAB23 mRNA相對(duì)表達(dá)量：取出超低溫冰箱內(nèi)保存的食管鱗狀細(xì)胞組織樣本，利用Trizol(北京恩碩科技有限公司)提取組織總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京天根生化科技有限公司)操作步驟將2μgRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，之后按照SYBR Green RCR master mix試劑(北京恩碩科技有限公司)說(shuō)明配反應(yīng)體系并加樣。其中miR-802以U6為內(nèi)參基因，RAB23以GADPH為內(nèi)參基因，引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物設(shè)計(jì)詳見(jiàn)表1。qRT-PCR反應(yīng)體系共為20μl，其中SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10μl，cDNA 2μl，上下游引物各0.8μl，ROX Reference Dye(50×)0.4μl，ddH2O 6μl。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，完成后將其放入熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，程序設(shè)定為：95℃1min，95℃ 15s，60℃ 15s，72℃ 15s，共42個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后收集數(shù)據(jù)，并對(duì)所得數(shù)據(jù)Ct值進(jìn)行分析，采用2-ΔΔCt算法計(jì)算miR-802與RAB23 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。(2)免疫組化法檢測(cè)食管鱗狀細(xì)胞組織中RAB23蛋白表達(dá):食管鱗狀細(xì)胞組織用石蠟包埋制作石蠟切片并經(jīng)二甲苯脫蠟，將其在不同梯度(100%、95%、80%、70%)乙醇中脫水后置于檸檬酸鹽溶液中1min，PBS(0.01mmol/L磷酸鹽緩沖液)清洗后并滴加3%H2O2室溫下反應(yīng)30min，PBS清洗3次且每次清洗時(shí)間為5min，清洗后加入山羊抗兔血清反應(yīng)60min，反應(yīng)后滴加稀釋后(1∶200)的RAB23一抗，放入4℃冰箱過(guò)夜，次日取出切片并用PBS清洗3次， 加入抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，置于37℃溫箱孵育1h，PBS清洗后加入DAB(二氨基聯(lián)苯氨)顯色液進(jìn)行顯色反應(yīng)，蒸餾水清洗后采用蘇木素復(fù)染，經(jīng)蒸餾水沖洗后置于1%鹽酸中5s后清洗，用中性樹(shù)脂進(jìn)行封片，置于顯微鏡下進(jìn)行觀察。

表1 qRT-PCR引物序列

3.結(jié)果判定:從每個(gè)切片中選取5個(gè)高倍視野(×400)中隨機(jī)挑選并對(duì)陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)[7]。觀察并記錄兩項(xiàng)指標(biāo)：陽(yáng)性細(xì)胞百分比與染色程度。按照染色程度：無(wú)色0分；淡黃色1分；棕褐色2分。按照陽(yáng)性細(xì)胞百分比：<10%記為0分；10%～25%記為1分；26%～50%記為2分；>50%記為3分。取兩組計(jì)分之乘積：0分為陰性，≥1分為陽(yáng)性。

4.隨訪:通過(guò)打電話或復(fù)診的方式對(duì)所有患者均進(jìn)行3年隨訪，并統(tǒng)計(jì)無(wú)生存進(jìn)展期(PFS)即患者開(kāi)始治療到腫瘤進(jìn)展或死亡這一段時(shí)間與總體生存時(shí)間(OS)即從隨機(jī)化開(kāi)始至因任何原因引起死亡的時(shí)間。

結(jié) 果

1.兩組miR-802與RAB23 mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果:兩組miR-802、RAB23 mRNA水平存在明顯差異，食管鱗癌組患者miR-802表達(dá)水平低于正常組，而RAB23 mRNA表達(dá)水平高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),詳見(jiàn)表2。

表2 兩組miR-802、RAB23 mRNA表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果

與正常組比較，*P<0.05

2.食管鱗癌及癌旁組織中RAB23蛋白表達(dá)情況:免疫組化組顯示RAB23在細(xì)胞核中表達(dá)，染色呈淡黃黃色、棕褐色，詳見(jiàn)圖1。與正常組比較，食管鱗癌組RAB23蛋白陽(yáng)性表達(dá)增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=17.342,P<0.05)，詳見(jiàn)表3。

圖1 食管鱗癌及癌旁組織中RAB23蛋白表達(dá)情況(免疫組化，×400)A.RAB23陰性表達(dá);B.RAB23陽(yáng)性表達(dá)

表3 食管鱗癌及癌旁組織中RAB23蛋白表達(dá)

組別nRAB23陰性陽(yáng)性陽(yáng)性率(%)正常組120784235.00食管鱗癌組120348671.67

3.miR-802、RAB23表達(dá)與食管鱗癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系:根據(jù)miR-802檢測(cè)結(jié)果的中位值將其分為高表達(dá)組共42例，低表達(dá)組共78例，觀察miR-802、RAB23表達(dá)與食管鱗癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，結(jié)果顯示miR-802與組織分化程度、TNM分期、浸潤(rùn)程度相關(guān)，RAB23與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及組織分化程度相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),詳見(jiàn)表4。

4.食管鱗癌組織中miR-802與RAB23表達(dá)水平的相關(guān)性分析:Pearson相關(guān)性分析miR-802與RAB23表達(dá)水平的相關(guān)性，結(jié)果顯示miR-802與RAB23呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),詳見(jiàn)圖2。

5.食管鱗癌組織中miR-802、RAB23表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系：Kaplan-Meier曲線顯示，miR-802、RAB23均與患者PFS、OS密切相關(guān)。miR-802高表達(dá)組PFS、OS(77.03%、69.25%)均高于低表達(dá)組(19.44%、22.41%)，RAB23陰性表達(dá)組PFS、OS(76.97%、63.94%)均高于陽(yáng)性表達(dá)組(23.19%、20.28%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見(jiàn)圖3、圖4。

討 論

食管癌是一種消化系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤且具有較高發(fā)生率，但其發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，而食管鱗癌是食管癌的主要類(lèi)型且患者預(yù)后差[8]。食管鱗癌確診時(shí)已處于中、晚期且已出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移及浸潤(rùn)而降低患者生存率，目前臨床常采用手術(shù)與放射治療、化學(xué)治療結(jié)合的方式進(jìn)行治療，但不敏感患者治療效果不明顯。隨著現(xiàn)代科技的進(jìn)步，癌癥依靠分子標(biāo)志物進(jìn)行診斷已取得較好的臨床治療效果，但對(duì)食管鱗癌分子標(biāo)志物的研究相對(duì)較少，因而尋求用于早期檢測(cè)食管鱗癌及其預(yù)后的分子標(biāo)志物具有重要指導(dǎo)意義。miRNA是一類(lèi)內(nèi)源性非編碼小RNA分子并可參與調(diào)控轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的過(guò)程，已有研究表明，miRNA可通過(guò)調(diào)控下游基因的表達(dá)進(jìn)而參與腫瘤形成、轉(zhuǎn)移及代謝過(guò)程[9]。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)大量miRNA可在食管鱗癌中發(fā)揮促癌或抑癌的功能并可用于臨床診斷或評(píng)估預(yù)后[10]。因此，探究食管鱗癌組織中miRNA的表達(dá)對(duì)于研究食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展具有十分重要的意義。

表4 食管鱗癌組織中miR-802、RAB23表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

圖2 miR-802與RAB23表達(dá)水平的相關(guān)性分析

圖3 食管鱗癌患者miR-802表達(dá)與PFS、OS的關(guān)系A(chǔ).PFS曲線;B.OS曲線

圖4 食管鱗癌患者RAB23表達(dá)與PFS、OS的關(guān)系A(chǔ).PFS曲線;B.OS曲線

miR-802位于人類(lèi)21染色體上，研究表明miR-802與多種惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[11]。miR-802可通過(guò)調(diào)控靶基因FoxM1表達(dá)而抑制乳腺癌細(xì)胞增殖及遷移[12]。研究表明miR-802在前列腺癌組織中過(guò)表達(dá)時(shí)可通過(guò)調(diào)控Flot-2表達(dá)進(jìn)而抑制癌細(xì)胞中EMT的遷移及侵襲，miR-802可能為抑癌基因[13]。目前關(guān)于miR-802在食管鱗癌組織中的表達(dá)研究相對(duì)較少，本研究通過(guò)qRT-PCR法檢測(cè)食管鱗癌組織及癌旁組織中miR-802表達(dá)量，結(jié)果顯示食管鱗癌組中miR-802表達(dá)顯著低于正常組，說(shuō)明食管鱗癌組織中miR-802呈下調(diào)表達(dá)，且miR-802參與食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。根據(jù)miR-802檢測(cè)結(jié)果的中位值分為高表達(dá)組與低表達(dá)組，并觀察其與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，結(jié)果顯示miR-802與組織分化程度、TNM分期、浸潤(rùn)程度顯著相關(guān)，且TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期時(shí)miR-802高表達(dá)比率較高而Ⅲ～Ⅳ期時(shí)miR-802呈顯著低表達(dá)趨勢(shì)，說(shuō)明miR-802在食管鱗癌的進(jìn)展及轉(zhuǎn)移過(guò)程中呈低表達(dá)并可能發(fā)揮抑癌基因的作用。同時(shí)本研究對(duì)miR-802表達(dá)與食管鱗癌的預(yù)后關(guān)系進(jìn)行研究，Kaplan-Meier曲線顯示miR-802高表達(dá)組PFS、OS均顯著高于低表達(dá)組，說(shuō)明miR-802低表達(dá)與食管鱗癌患者預(yù)后不良有關(guān)，推測(cè)miR-802表達(dá)與食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展有關(guān)并可作為判斷疾病進(jìn)展及評(píng)估患者預(yù)后的分子標(biāo)志物。

RAB23位于人類(lèi)染色體6p12.1是一種小GTP酶且屬于致癌基因，研究表明RAB23是多種惡性腫瘤的靶點(diǎn)，上游基因調(diào)控RAB23表達(dá)并可發(fā)揮腫瘤啟動(dòng)子的作用[14]。相關(guān)研究表明RAB23可通過(guò)整合素β1/Rac1途徑進(jìn)而促進(jìn)鱗狀細(xì)胞的癌細(xì)胞發(fā)生遷移與侵襲[15]。乳腺癌細(xì)胞中RAB23可上調(diào)表達(dá)且與乳腺癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移緊密相關(guān)。Bin等[16]研究表明胃癌組織中RAB23上調(diào)表達(dá)且可參與胃癌細(xì)胞系Hs746T及SGC7901的侵襲及轉(zhuǎn)移過(guò)程。關(guān)于RAB23在食管鱗癌組織中的表達(dá)水平研究相對(duì)較少，因而本研究通過(guò)qRT-PCR法檢測(cè)RAB23在食管鱗癌組織及癌旁組織中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示研究組患者RAB23 mRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，且免疫組化結(jié)果顯示食管鱗癌組中RAB23蛋白陽(yáng)性表達(dá)顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明食管鱗癌組織中RAB23呈高表達(dá)，RAB23表達(dá)與食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

臨床病理參數(shù)分析結(jié)果顯示，RAB23與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及組織分化程度顯著相關(guān)，TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期時(shí)RAB23陰性表達(dá)率較高，而Ⅲ～Ⅳ期時(shí)RAB23陽(yáng)性表達(dá)率較高，說(shuō)明隨著淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移、TNM分期變化及組織分化，食管鱗癌組織中RAB23表達(dá)隨之升高。Kaplan-Meier曲線顯示，RAB23陰性表達(dá)組PFS、OS均顯著高于陽(yáng)性表達(dá)組，說(shuō)明RAB23陽(yáng)性表達(dá)與食管鱗癌患者預(yù)后緊密相關(guān)。推測(cè)RAB23可作為早期診斷及評(píng)估患者預(yù)后的輔助指標(biāo)。研究表明miR-802可通過(guò)上調(diào)靶基因RAB23表達(dá)進(jìn)而參與胃癌細(xì)胞的增殖及遷移[17]。本研究通過(guò)Pearson法對(duì)miR-802與RAB23進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示二者呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明miR-802可通過(guò)調(diào)控靶基因RAB23的表達(dá)進(jìn)而參與食管鱗癌發(fā)生及病情進(jìn)展過(guò)程。本研究結(jié)果揭示miR-802、RAB23表達(dá)水平可判斷食管鱗癌患者的疾病嚴(yán)重程度，并對(duì)早期診斷及評(píng)估患者預(yù)后均具有重要參考價(jià)值。

綜上所述，食管鱗癌組織中miR-802下調(diào)表達(dá)，RAB23上調(diào)表達(dá)，二者呈負(fù)相關(guān)，且均與患者病情進(jìn)展及預(yù)后有關(guān)，二者均可能為臨床早期判斷患者病情及評(píng)估預(yù)后的重要分子標(biāo)志物。miR-802與RAB23是否為負(fù)調(diào)控模式及其內(nèi)在機(jī)制有待進(jìn)一步研究。