張 沛 岳青芬 侯青霞 韓聽(tīng)鋒

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，中國(guó)乳腺癌發(fā)病人數(shù)僅次于美國(guó)，居全球第二位，且呈逐年上升趨勢(shì)[1, 2]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類(lèi)內(nèi)源性非編碼RNA，長(zhǎng)度約為19～25個(gè)核苷酸[3]。miRNA通過(guò)與靶基因mRNA的3′-UTR配對(duì)結(jié)合，導(dǎo)致靶基因mRNA降解或者抑制其翻譯，負(fù)向調(diào)控靶基因的表達(dá)[4]。miR-664a-3p的研究尚處于起步階段，目前僅發(fā)現(xiàn)miR-664a-3p在骨肉瘤細(xì)胞中具有腫瘤抑制作用[5]。本研究通過(guò)qPCR檢測(cè)miR-664a-3p在乳腺癌組織和細(xì)胞株的表達(dá)，并將miR-664a-3p轉(zhuǎn)染到乳腺癌細(xì)胞中，觀察miR-664a-3p對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響，探討其影響乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的分子機(jī)制。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料：(1)一般資料：經(jīng)筆者醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)同意，患者本人或家屬簽署知情同意書(shū)，收集筆者醫(yī)院婦產(chǎn)科2017年1月～8月經(jīng)手術(shù)切除的新鮮乳腺癌組織標(biāo)本16例，所有患者在手術(shù)前均未行放射治療、化學(xué)治療等。取其乳腺癌原發(fā)腫瘤組織和癌旁組織(距離癌灶邊緣>5cm)標(biāo)本。經(jīng)病理學(xué)診斷證實(shí)所得標(biāo)本為乳腺癌組織，根據(jù)具體術(shù)中病理報(bào)告分為早期浸潤(rùn)癌10例、浸潤(rùn)癌6例。標(biāo)本術(shù)中取出后立即放入液氮中保存。(2)細(xì)胞與試劑：RNA提取試劑盒和熒光實(shí)時(shí)定量試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司。DMEM/F12 培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。工具細(xì)胞HEK293、人乳腺癌細(xì)胞株(T47D、MDA-MB-231、BT-549、MCF-7)和正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。miR-664a-3p模擬物和miR-NC購(gòu)自廣州市銳博生物科技有限公司。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。pGL3熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Promega公司。二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購(gòu)自武漢博士德公司。一抗β-actin、TEM8、CDK4、Cyclin D1、Vimentin、β-catenin和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中國(guó)凱基公司。Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司。

2.細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染：在37°C、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中，使用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)MCF-10A、T47D、MDA-MB-231和HEK293細(xì)胞，使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)BT-549和MCF-7細(xì)胞。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的T47D細(xì)胞以每孔2×105個(gè)接種于6孔板。依據(jù)Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染濃度為50nmol/L。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分兩組，即實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染miR-664a-3p模擬物)和對(duì)照組(轉(zhuǎn)染miR-NC)。

3.熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)檢測(cè)miR-664a-3p和靶基因mRNA表達(dá)：Trizol試劑提取總RNA，依據(jù)RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA，取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物qPCR反應(yīng)，擴(kuò)增條件為94℃ 5min，94℃ 30s，60℃ 20s，72℃ 20s，共40個(gè)循環(huán)。使用2-△△Ct法計(jì)算miR-664a-3p相對(duì)于內(nèi)參U6的表達(dá)量及TEM8相對(duì)于內(nèi)參GAPDH的表達(dá)量。引物序列詳見(jiàn)表1。

4.生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-664a-3p靶基因及雙熒光素酶活性檢測(cè)：生物信息學(xué)軟件miRWalk、TarBase和TargetScan預(yù)測(cè)miR-664a-3p的靶基因并取交集，miR-664a-3p的靶基因可能為T(mén)EM8，互補(bǔ)結(jié)合序列詳見(jiàn)圖1。構(gòu)建野生型及突變型 TEM8-3′ UTR的報(bào)告基因質(zhì)粒，突變區(qū)域詳見(jiàn)圖1，并將野生型、突變型分別與miR-664a-3p和miR-NC共轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞中，48h后按照雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，檢測(cè)各組螢火蟲(chóng)熒光素酶和海腎熒光素酶的活性。以螢火蟲(chóng)熒光強(qiáng)度/海腎熒光強(qiáng)度比值反映各組的相對(duì)熒光強(qiáng)度。

5.Western blot法檢測(cè)目的蛋白表達(dá)：分別使用細(xì)胞裂解液提取兩組細(xì)胞總蛋白。取25μg蛋白，行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)，電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂牛奶26℃封閉3h。一抗4℃孵育12h。Tris-HCl緩沖液漂洗2次，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗26℃孵育2h，Tris-HCl緩沖液漂洗2次，滴加增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)發(fā)光顯影分析比較條帶變化。

6.流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)細(xì)胞周期：將兩組細(xì)胞消化收集，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗2次，加入1ml 70%乙醇溶液4℃固定1h，離心去上清，PBS溶液漂洗2次，加入1ml碘化丙啶(PI)試劑，26℃避光孵育30min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)并分析各組細(xì)胞周期，以細(xì)胞所處細(xì)胞周期百分率表示。

7.CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力：將兩組T47D細(xì)胞重懸后計(jì)數(shù)，每孔4000個(gè)接種于96孔板，每間隔24h每孔加入CCK-8試劑10μl，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4h，在酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)值，連續(xù)檢測(cè)5天，以時(shí)間為橫軸，A值為縱軸，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

8.細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：Transwell侵襲小室上室面鋪以細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)膠，培養(yǎng)箱內(nèi)放置4h使ECM膠凝固。將轉(zhuǎn)染后48h的兩組T47D細(xì)胞消化，使用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸并計(jì)數(shù)，以2×104個(gè)/孔接種于上室，下室中加入500μl完全培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24h，吸取培養(yǎng)基，小室內(nèi)加入1ml甲醇固定20min，加入結(jié)晶紫溶液500μl染色20min，自來(lái)水清洗，棉簽擦去未穿過(guò)小室底膜的細(xì)胞，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)穿過(guò)小室底膜的細(xì)胞數(shù)目。

表1 qPCR引物序列

圖1 野生型TEM8 mRNA的3′-UTR區(qū)域含有miR-664a-3p靶向結(jié)合片段

結(jié) 果

1.miR-664a-3p在乳腺癌組織的表達(dá)：qPCR結(jié)果顯示(圖2)，miR-664a-3p在乳腺癌組織和癌旁組織的表達(dá)量分別為1.03±0.09、2.10±0.20，miR-664a-3p在乳腺癌組織中表達(dá)量顯著低于癌旁組織(t=4.83，P<0.01)。

圖2 qPCR檢測(cè)miR-664a-3p在乳腺癌及癌旁組織的表達(dá)量與癌旁組織比較，*P<0.01

2.miR-664a-3p在乳腺癌細(xì)胞株的表達(dá)：qPCR結(jié)果顯示，miR-664a-3p在乳腺癌細(xì)胞T47D、MDA-MB-231、BT-549、MCF-7的表達(dá)量明顯下調(diào)，其中在T47D細(xì)胞中的表達(dá)量最低，與正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A及其他乳腺癌細(xì)胞株比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖3)。以T47D細(xì)胞為對(duì)象進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 qPCR檢測(cè)miR-664a-3p在乳腺癌細(xì)胞株及正常乳腺上皮細(xì)胞的表達(dá)量與正常乳腺上皮細(xì)胞，*P<0.05，**P<0.01

3.轉(zhuǎn)染miR-664a-3p對(duì)T47D細(xì)胞miR-664a-3p表達(dá)的影響：qPCR結(jié)果顯示，T47D細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-664a-3p后miR-664a-3p表達(dá)較對(duì)照組明顯增加(24.87±2.17 vs 1.02±0.10，t=10.96，P<0.01)。

4.熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)：熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-664a-3p可明顯抑制野生型 TEM8-3′ UTR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光素酶活性(P<0.01)，而對(duì)突變型TEM8-3′ UTR 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光素酶活性并無(wú)影響(圖4)。

圖4 熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證miR-664a-3p與TEM8-3′ UTR的靶向結(jié)合與“miR-NC+野生型質(zhì)?！惫厕D(zhuǎn)染比較，*P<0.01

5.轉(zhuǎn)染miR-664a-3p對(duì)T47D細(xì)胞TEM8 mRNA表達(dá)的影響：qPCR結(jié)果顯示，T47D細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-664a-3p后TEM8 mRNA表達(dá)較對(duì)照組明顯下調(diào)(0.27±0.07 vs 1.00±0.01，t=9.97，P<0.01)。

6.轉(zhuǎn)染miR-664a-3p對(duì)T47D細(xì)胞TEM8相關(guān)蛋白表達(dá)的影響：Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示， T47D細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-664a-3p后TEM8、CDK4、Cyclin D1、Vimentin蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著下調(diào)，β-catenin蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著上調(diào)(圖5)。

圖5 Western blot法檢測(cè)miR-664a-3p轉(zhuǎn)染T47D細(xì)胞后目的蛋白的表達(dá)水平

7.轉(zhuǎn)染miR-664a-3p對(duì)T47D細(xì)胞周期的影響：流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，T47D細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-664a-3p后在G0/G1期的細(xì)胞比例較對(duì)照組明顯上升，高表達(dá)miR-664a-3p可抑制T47D 細(xì)胞周期的進(jìn)展(P<0.01，表2)。

8.轉(zhuǎn)染miR-664a-3p對(duì)T47D細(xì)胞增殖能力的影響：使用CCK-8連續(xù)5天檢測(cè)T47D細(xì)胞的生長(zhǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至第4天和第5天，對(duì)照組細(xì)胞A值顯著高于實(shí)驗(yàn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖6)。

9.轉(zhuǎn)染miR-664a-3p對(duì)T47D細(xì)胞侵襲能力影響：Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在乳腺癌T47D細(xì)胞中高表達(dá)miR-664a-3p的細(xì)胞穿過(guò)小室底膜的細(xì)胞數(shù)明顯低于對(duì)照組(96.76±14.54 vs 217.50±17.96，t=5.22，P<0.01)。

表2 miR-664a-3p對(duì)乳腺癌細(xì)胞周期的影響

圖6 CCK-8 法檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-664a-3p后不同時(shí)點(diǎn)T47D細(xì)胞增殖能力的變化與對(duì)照組比較，*P<0.01

討 論

miRNA在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)腫瘤細(xì)胞中的抑癌基因或癌基因的表達(dá)發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[6]。幾乎所有的腫瘤中均出現(xiàn)miRNA的異常表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為如增殖、侵襲轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)[7]。miRNA的異常表達(dá)參與乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展。miR-320、miR-770、miR-361-5p等miRNA通過(guò)抑制癌基因的表達(dá)負(fù)向調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的增殖或遷移、侵襲[8～10]。miR-421、miR-1246、miR-27a等miRNA可抑制抑癌基因的表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[11～13]。miR-664a-3p是miRNA家族的重要一員，可抑制骨肉瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，然而其在乳腺癌中的作用目前尚不清楚[5]。

本研究結(jié)果顯示，miR-664a-3p在乳腺癌組織及乳腺癌細(xì)胞中低表達(dá)，提示miR-664a-3p可能與乳腺癌的發(fā)生、進(jìn)展有一定的關(guān)系。生物信息學(xué)軟件分析顯示腫瘤內(nèi)皮標(biāo)志物8(TEM8)可能是miR-664a-3p的靶基因。以往的研究表明TEM8在腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)，通過(guò)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移進(jìn)而利于腫瘤血管的生成，在腫瘤血管生成中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[14]。近年來(lái)研究顯示，TEM8可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲，在越來(lái)越多的腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[15]。有研究表明，TEM8在乳腺癌組織中高表達(dá)，其表達(dá)水平與患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[16]。本研究通過(guò)雙熒光素酶檢測(cè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證TEM8是miR-664a-3p的靶基因。本研究結(jié)果通過(guò)qPCR和Western blot法檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-664a-3p后TEM8 mRNA和蛋白的表達(dá)均明顯降低。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4(CDK4)和細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)是正向調(diào)控細(xì)胞周期的重要蛋白。本研究顯示TEM8蛋白的下調(diào)引起CDK4和Cyclin D1蛋白表達(dá)降低。β-鏈蛋白(β-catenin)和波形蛋白(Vimentin)與腫瘤細(xì)胞遷移侵襲能力的變化密切相關(guān)，β-catenin蛋白的減少和Vimentin蛋白的增加均是腫瘤細(xì)胞遷移侵襲能力增強(qiáng)的表現(xiàn)。本研究顯示TEM8蛋白的下調(diào)引起β-catenin蛋白表達(dá)降低，Vimentin蛋白表達(dá)升高。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-664a-3p至乳腺癌細(xì)胞T47D，發(fā)現(xiàn)T47D細(xì)胞周期進(jìn)展明顯被抑制，細(xì)胞增殖能力和侵襲能力顯著降低，提示miR-664a-3p具有顯著的抑癌作用。

綜上所述，本研究表明miR-664a-3p在乳腺癌組織中處于高表達(dá)的狀態(tài)，通過(guò)抑制TEM8基因的表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖能力和侵襲能力，在未來(lái)可能具有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值，并可能成為乳腺癌潛在的腫瘤標(biāo)志物，用于乳腺癌的臨床診斷。