莊 飛， 梁 廣， 錢建暢， 鄭 超

(溫州醫(yī)科大學(xué) 1第二臨床醫(yī)學(xué)院， 2附屬第二醫(yī)院， 3藥學(xué)院， 浙江 溫州 325035)

糖尿病是常見(jiàn)的內(nèi)分泌與代謝性疾病，在全國(guó)乃至全世界范圍內(nèi)的發(fā)病人群日益增多[1]，糖尿病所導(dǎo)致的各種急慢性并發(fā)癥，特別是心血管并發(fā)癥被認(rèn)為是糖尿病患者致殘和死亡的主要原因[2]。糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)的疾病特征是糖尿病所致的心肌結(jié)構(gòu)及心臟功能改變，包括心室肥厚、心肌纖維化以及心功能下降，甚至心力衰竭等[3-4]。因此尋求一種新的藥物，并進(jìn)一步探索有效的治療方案，具有重要的意義。蓽茇酰胺(piperlongumine，PL)是中藥蓽茇中提取的有效成分，具有抗炎和抗氧化等多種藥理學(xué)作用[5]，目前多用于抗乳腺癌和前列腺癌等腫瘤的研究[6-8]，然而對(duì)于糖尿病并發(fā)癥的涉及較少，其效果及機(jī)制并不明確。本研究通過(guò)高糖刺激的大鼠心肌 H9C2細(xì)胞模型以及鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)的1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus, T1DM)小鼠模型，探究PL是否能夠緩解DCM的發(fā)生發(fā)展。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞株和動(dòng)物

心肌H9C2細(xì)胞購(gòu)自上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。SPF級(jí)C57BL/6小鼠，雄性，5～6周齡，20～22 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司,許可證編號(hào)為SCXK(浙)2015-0009。

2 主要試劑

蓽茇酰胺購(gòu)自瀚香生物科技公司,用0.1%二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)溶解，配制成20 mmol/L的母液貯存；STZ和MTT購(gòu)自Sigma-Aldrich；DMEM培養(yǎng)基、含EDTA的胰酶和胎牛血清購(gòu)自Gibco；RIPA裂解液和HE染色試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；抗轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-beta，TGF-β)及Ⅳ型膠原蛋白(collagen IV)兔源性 I 抗購(gòu)自Abcam；抗GAPDH兔源性 I 抗購(gòu)自杭州賢至生物科技有限公司；過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)購(gòu)自翊圣公司；肌酸激酶同工酶MB(creatine kinase isoenzyme MB，CK-MB)試劑盒及乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒購(gòu)自南京建成公司；TRIzol和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa。所用引物由上海吉?jiǎng)P基因技術(shù)有限公司根據(jù)設(shè)計(jì)合成，見(jiàn)表1。

表1 引物序列

3 主要方法

3.1 細(xì)胞培養(yǎng) H9C2細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清，1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM(含1 g/L D-glucose)的細(xì)胞培養(yǎng)液中，37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。待細(xì)胞密度生長(zhǎng)至70%～80%即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 將生長(zhǎng)到指數(shù)生長(zhǎng)期的H9C2細(xì)胞以每孔5 000個(gè)接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度梯度的PL孵育48 h。隨后加入MTT，在恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4～6 h，棄去培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔490 nm的吸光度(A)值。細(xì)胞相對(duì)活力用與對(duì)照組細(xì)胞吸光度的比值來(lái)表示，以此計(jì)算出PL的半數(shù)抑制濃度(IC50)。

3.3 qPCR實(shí)驗(yàn) 用TRIzol變性破碎細(xì)胞，依次用氯仿、異丙醇以及無(wú)水乙醇分離提純總RNA。參照二步法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA，進(jìn)行qPCR。qPCR體系為10 μL：cDNA模板1 μL，上、下游引物各 0.25 μL，SYBR 溶液5.25 μL，超純水3.25 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min;95 ℃ 7 s、55 ℃ 10 s、72 ℃ 15 s，重復(fù) 40 個(gè)循環(huán)。以β-actin 作為內(nèi)參照進(jìn)行結(jié)果分析，用2-ΔΔCt計(jì)算相應(yīng)mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

3.4 Western blot實(shí)驗(yàn) 取藥物處理后細(xì)胞，加入PMSF、蛋白磷酸酶抑制劑及RIPA裂解液冰上裂解，收集細(xì)胞裂解液，4 ℃、12 000 r/min離心10 min收集蛋白，并用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量。用SDS-PAGE分離不同分子量的蛋白，電轉(zhuǎn)到PDVF膜上，室溫下用TBST配制的脫脂牛乳封閉1.5 h。加入 I 抗4 ℃搖床孵育過(guò)夜，用TBST洗膜3次，每次5 min后室溫 II 抗孵育1 h，用ECL化學(xué)發(fā)光劑在凝膠成像系統(tǒng)上顯影。

3.5 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) C57BL/6小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為空白對(duì)照(control)組(n=6)和T1DM組(n≥18)。T1DM組腹腔注射STZ 50 mg/kg(用檸檬酸鈉緩沖液配置，pH 4.5)，每天1次,連用5 d，1周后血糖≥12 mmol/L認(rèn)為造模成功。將T1DM小鼠隨機(jī)分為T1DM組(n=6)、T1DM+PL (2.5 mg/kg)組(n=6)及T1DM+PL (5 mg/kg)組(n=6)。后兩組的小鼠在造模成功后隔天腹腔注射相應(yīng)劑量PL連續(xù)13周，control組及T1DM組不作特殊處理。每組小鼠每2周監(jiān)測(cè)體重及血糖變化。第13周行超聲心動(dòng)圖檢測(cè)。

13周末，小鼠用4%水合氯醛麻醉后處理，取心臟，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，每組取3個(gè)組織，切成5 μm切片，用于HE染色以及天狼星紅染色；取血清，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)用于檢測(cè)CK-MB以及LDH血清學(xué)指標(biāo)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 22.0以及GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析以及作圖。所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 PL可減輕高糖誘導(dǎo)的心肌H9C2細(xì)胞炎癥以及纖維化

心肌H9C2細(xì)胞用不同濃度的PL作用48 h，根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出PL的半數(shù)抑制濃度為35.05 μmol/L，見(jiàn)圖1，因此我們選取1、2.5和5 μmol/L的濃度進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

Figure 1. The IC50of PL for the viability of H9C2 cells.

圖1 PL影響H9C2細(xì)胞生長(zhǎng)的半數(shù)抑制濃度

1.1 PL可抑制高糖誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞炎癥因子的水平 將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9C2細(xì)胞接種于6孔板中，上述濃度PL預(yù)處理1 h后，加入終濃度為33 mmol/L的葡萄糖溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞提取RNA進(jìn)行qPCR。結(jié)果顯示高糖(high glucose,HG)組較空白組炎癥因子TNF-α 和 IL-6的mRNA水平顯著升高(P<0.01)，PL處理后TNF-α和IL-6的mRNA水平較HG組均有所下降，并呈劑量依賴性，見(jiàn)圖2。在充分考慮藥物毒性的前提下，為了讓實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加明確，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，我們選取2.5 μmol/L和5 μmol/L 2個(gè)濃度的PL。

Figure 2. PL attenuated HG-induced cardiac inflammation in the H9C2 cells. The mRNA expression of TNF-α and IL-6 was detected by qPCR. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsHG group.

圖2 PL可抑制高糖誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞炎癥因子的mRNA水平

1.2 PL可減輕高糖誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞纖維化 將H9C2細(xì)胞用不同濃度PL預(yù)處理后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集蛋白。結(jié)果顯示，高糖可增加纖維化標(biāo)志蛋白TGF-β及collagen IV的表達(dá)(P<0.01)，PL處理后表達(dá)下降，并呈劑量依賴性(P<0.01),見(jiàn)圖3。

Figure 3. PL alleviated HG-induced cardiac fibrosis. The protein levels of collagen IV and TGF-β were determined by Western blot. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsHG group.

圖3 PL可減輕高糖誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞纖維化的蛋白表達(dá)

2 PL可緩解糖尿病心肌病小鼠的心肌損傷及纖維化

PL給藥過(guò)程中并不影響糖尿病小鼠的血糖,見(jiàn)圖4。HE染色顯示T1DM組心肌排列紊亂，細(xì)胞肥大，PL可逆轉(zhuǎn)此變化,見(jiàn)圖5。

Figure 4. PL didn’t change the weight and blood glucose (BG) levels in STZ-induced T1DM mice. Mean±SD.n=5.

圖4 PL不改變STZ造模的1型糖尿病小鼠的血糖和體重

超聲心動(dòng)圖提示，在造模(T1DM)組，室間隔厚度較正常(control)組增加(P<0.01)，PL給藥后可以減輕室壁增厚(P<0.01)。功能性指標(biāo)如射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction，EF)也反映出相同特征，T1DM組小鼠的射血分?jǐn)?shù)低于control組，PL可增加糖尿病心肌病小鼠的射血分?jǐn)?shù)(P<0.01)，從而改善心功能，見(jiàn)表2。

2.1 PL緩解糖尿病心肌病小鼠心肌損傷 心肌損傷的血清學(xué)指標(biāo)如CK-MB及LDH在T1DM組小鼠中升高，然而使用PL可以使CK-MB及LDH均明顯下降(P<0.01)，見(jiàn)圖6。

2.2 PL緩解糖尿病心肌病小鼠的心肌纖維化 天狼星紅染色所示，T1DM組膠原纖維較control組增多，在應(yīng)用PL后，膠原纖維較造模組明顯減少，見(jiàn)圖5。

討 論

糖尿病心肌病是指發(fā)生于糖尿病患者，不能用高血壓性心臟病、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病及其它心臟病變來(lái)解釋的心肌疾病，包括心肌結(jié)構(gòu)以及心臟功能的改變[9-10]。研究表明，多種因素參與了糖尿病心血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展，如慢性炎性、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、胰島素抵抗和內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)等等[11-13]，相互交織共同作用，造成了心臟損害。炎癥，特別是慢性炎癥在糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。長(zhǎng)期糖尿病導(dǎo)致的高糖環(huán)境可導(dǎo)致炎癥因子如TNF-α和IL-6等在體內(nèi)釋放增多，反復(fù)長(zhǎng)期慢性炎癥刺激，導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大、凋亡，心肌間質(zhì)纖維化等改變，可能是糖尿病心肌病結(jié)構(gòu)和功能異常的主要原因[14]。

Figure 5. PL alleviated disorder of basic structure (HE staining, ×200) and cardiac fibrosis (Sirius red staining, ×200) in the diabetic cardiomyopathy mice.

圖5 PL可緩解糖尿病心肌病小鼠的心肌結(jié)構(gòu)紊亂及纖維化等病理變化

表2 心臟超聲心動(dòng)圖測(cè)量數(shù)據(jù)

IVSd: diastolic interventricular septal thickness; FS: fraction shortening; EF: ejection fraction; ICT: isovolumic contraction time; Et: ejection time; IRT: isovolumic relaxation time.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsT1DM group.

Figure 6. PL mitigated myocardial injury in T1DM mice. Serum CK-MB and serum LDH were examined. Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsT1DM group.

圖6 PL可降低血清心肌損傷指標(biāo)肌酸激酶同工酶和乳酸脫氫酶水平

蓽茇酰胺是從胡椒科植物蓽茇的果穗中分離出的生物堿天然產(chǎn)物[15]，具有抑制腫瘤、抗炎和抗氧化等多種生物學(xué)活性[5]。已有研究成果表明，PL通過(guò)抑制NF-κB磷酸化從而緩解炎癥反應(yīng)，同時(shí)，下調(diào)MAPKs的活性可成為PL抗炎的另一可能機(jī)制[16]。本研究表明，PL可以減少高糖環(huán)境下炎癥因子的表達(dá)，從而緩解高糖環(huán)境下的心肌細(xì)胞的纖維化；在STZ誘導(dǎo)的1型糖尿病小鼠模型中，PL可降低心肌損傷指標(biāo)CK-MB和LDH水平，改善心臟功能,減輕心肌纖維化。抑制炎癥因子的釋放，可能是PL緩解糖尿病心肌病的主要機(jī)制。

本研究證實(shí)，高糖誘導(dǎo)的慢性炎癥可以促進(jìn)糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展，PL可以抑制炎癥因子的釋放，我們可以推測(cè)PL對(duì)糖尿病心肌病可以產(chǎn)生保護(hù)性作用。但本研究并未涉及更深層次的機(jī)制，具體機(jī)制有待進(jìn)一步探索。

綜上所述，本項(xiàng)研究揭示了，PL通過(guò)其抗炎作用緩解心肌纖維化和心肌損傷，從而對(duì)糖尿病心肌病小鼠的心肌產(chǎn)生保護(hù)性作用。因此，PL可能成為糖尿病心肌病的潛在治療藥物，抑制炎癥可能成為治療糖尿病心肌病的潛在靶點(diǎn)。