王慶霞， 陳會剛， 孫 晶， 石玉珍， 王殿文△

(1 山東大學(xué)第二醫(yī)院藥學(xué)部藥品調(diào)劑科， 山東 濟南 250000； 2諸城市婦幼保健院病理產(chǎn)科， 山東 諸城 262200； 3山東大學(xué)第二醫(yī)院臨床實驗室， 山東 濟南 250000)

糖尿病心臟病，包括冠狀動脈粥樣硬化、心肌病、微血管病變和植物神經(jīng)功能紊亂所致的心率失常，是糖尿病患者致死的主要因素[1]。研究表明，糖尿病伴隨心肌病與2型糖尿病患者發(fā)生心力衰竭密切相關(guān)，是2型糖尿病患者死亡率升高的原因之一[2]。目前，糖尿病尤其是2型糖尿病發(fā)病率逐漸增高，且療效仍不理想，因此需深入認(rèn)識糖尿病發(fā)病機制，尋找新型2型糖尿病的治療藥物。我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)對糖尿病引起的心臟病變也有一定認(rèn)識：《諸病源候論》中即有“消渴重，心中疼”的記載；《醫(yī)砭》中亦有“心火太盛津液耗涸，在上…甚則消及肺臟，在中…甚則消及脾臟，在下…甚則消及腎藏，在外…甚則消及筋骨，四藏皆消，則心自焚而死矣……”的論述。現(xiàn)代中醫(yī)根據(jù)糖尿病心肌病的臨床表現(xiàn)將其歸屬于“消渴”、“胸痹”、“心痛”、“驚悸”和“怔忡”等范疇，其中，“消渴”為本，其病機多為氣陰兩虛，目前已有許多中藥組方成功開發(fā)并應(yīng)用于臨床消渴病的治療，取得良好效果[3]，黃芪和葛根作為益氣養(yǎng)陰的常見藥對，用于消渴病的治療亦能取得一定療效。研究表明黃芪注射液聯(lián)合葛根素注射液對2型糖尿病動物KKAy小鼠腎臟過強的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)有良好的抑制作用[4]，但其機制尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病小鼠心肌組織中存在高活性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)(endoplasmic reticulum stress, ERS)[5-7]，提示2型糖尿病伴隨的病理學(xué)改變?nèi)缧募》屎窈屠w維化與ERS的激活密切相關(guān)。研究表明，ERS通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣平衡以及葡萄糖代謝參與糖尿病心肌病的發(fā)生和發(fā)展[8]，但ERS信號通路激活與糖尿病心肌病發(fā)生的因果關(guān)系及意義仍不清楚。本項工作聯(lián)合黃芪注射液和葛根素注射液治療2型糖尿病小鼠，探討其對2型糖尿病小鼠心臟病變發(fā)生發(fā)展過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路和caspase通路的激活情況，進(jìn)一步分析其與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及細(xì)胞凋亡的關(guān)系，為臨床糖尿病心肌病相關(guān)新藥的研發(fā)與應(yīng)用提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

1.1 實驗動物 SPF級KKAy小鼠，雄性，8～10周齡，體重22～25 g，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所[合格證號：KYLL-2017(GJ)A-0028]，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，自由飲水和進(jìn)食。高脂飼料(10%豬油+20%蔗糖+2.5%膽固醇+0.5%膽酸鈉+67%基礎(chǔ)飼料)購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司，普通飼料購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心。

1.2 主要試劑 葛根素注射液(批號：1009056，成都地奧九泓制藥廠)；黃芪注射液(批號：1404163，湖南五洲通藥業(yè)有限責(zé)任公司)；無水乙醇和二甲苯購自國藥試劑；HE染液購自索萊寶公司；TRIzol購自Invitrogen；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega；power sybrgreen購自ABI；引物設(shè)計應(yīng)用Primer5軟件設(shè)計并交由寶生物工程(大連)有限公司合成；抗葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologusprotein, CHOP)和p53調(diào)凋亡調(diào)控因子(p53 up-regulated modulator of opoptosis,PUMA)抗體購自Abcam;抗caspase-3、cleaved caspase-3、caspase-9、cleaved caspase-9抗體購自Novus；抗多腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly(ADP-ribose) polymerase,PARP]和cleaved PARP抗體購自Cell Signaling Technology；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和Real-time PCR 試劑盒購自 TaKaRa；BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自Thermo；其它試劑為國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 2型糖尿病動物KKAy小鼠模型的建立 用高脂飼料和普通飼料喂養(yǎng)KKAy小鼠，飼養(yǎng)溫度為22～25 ℃，相對濕度控制在50%～60%之間；每日12 h光照維持，晝夜循環(huán)，自由進(jìn)食、飲水。實驗鼠的處理遵循國家科學(xué)技術(shù)委員會1988年頒布的《實驗動物管理條例》，并得到我校動物管理委員會的批準(zhǔn)。待12周齡時，將隨機血糖≥13.9 mmol/L的KKAy小鼠視為糖尿病模型建立成功[9]。

2.2 實驗動物分組及給藥 實驗分為對照(control)組、模型(model)組和治療(treatment)組，將造模成功的KKAy小鼠(12周齡)隨機分為模型組和治療組，具體分組情況如下：對照組(18只)：給予普通飼料飼喂；模型組(18只)：KKAy小鼠給予高脂飼料飼喂，12周齡起每日給予與治療組相同劑量的生理鹽水(4.3 mL/kg)，腹腔注射;治療組18只： KKAy小鼠給予高脂飼料，每日腹腔注射黃芪注射液(3.0 mL/kg)和葛根素注射液(1.3 mL/kg)，2種藥物先后注射。以上各組動物均為單籠飼養(yǎng)，均自由飲食，飲水，每日換墊料，分別于21、24和28周齡各處死6只。

2.3 采集心肌組織樣品 分別于21周齡、24周齡和28周齡時分批處死各組小鼠，用剪刀打開小鼠胸腔，將心臟剪下，以冰生理鹽水沖洗殘留血液，去除大血管，快速切留心尖組織，保存于液氮罐中備用。

2.4 HE染色法觀察心肌的形態(tài)變化 經(jīng)4%多聚甲醛固定的心臟組織常規(guī)石蠟制片，進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織病理學(xué)變化。

2.5 TUNEL染色法檢測心肌細(xì)胞凋亡 24周齡處死的小鼠心臟組織經(jīng)4%甲醛固定、脫水、包埋制備石蠟切片(10 μm)。按照TUNEL試劑盒檢測心肌細(xì)胞凋亡，于光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，以細(xì)胞核呈棕褐色為陽性細(xì)胞，隨機取5個視野，分別記錄每個視野中陽性細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞總數(shù)，計算每個視野的凋亡指數(shù)，凋亡指數(shù)(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%，求平均值。

2.6 Real-time PCR 采集的心肌組織按照TRIzol試劑說明書提取總RNA，分光光度計測定其吸光度(A)值。按照RT-PCR試劑盒說明書合成cDNA，反應(yīng)條件為：42 ℃ 1 h；70 ℃ 5 min；4 ℃放置10 min后置于-80 ℃保存。取2 ng cDNA進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)，引物見表1，反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min； 95 ℃ 20 s；58 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。IQ5TMReal-Time PCR Detection System(Bio-Rad)進(jìn)行real-time PCR數(shù)據(jù)分析，結(jié)果經(jīng)內(nèi)參照β-actin校正，各基因相對含量用 2-ΔΔCt表示。

表1 Real-time PCR引物

2.7 Western blot 采集的心肌組織50 μg，加入300 μL RIPA裂解液，超聲破碎、15 000 ×g，4 ℃離心10 min，按照BCA試劑盒說明書測定總蛋白濃度。每個樣本取30 μg進(jìn)行SDS-PAGE，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別孵育Ⅰ抗(GRP78，CHOP，PUMA，caspase-3，cleaved caspase-3，caspase-9，cleaved caspase-9，PARP，cleaved PARP和β-actin)，4 ℃過夜。洗膜、孵育Ⅱ抗(室溫1 h)。ECL顯影后掃描，蛋白相對表達(dá)量經(jīng)內(nèi)參照β-actin校正后經(jīng)ImageJ軟件分析。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 HE染色觀察心肌形態(tài)變化

各周齡對照組小鼠心肌細(xì)胞排列致密、整齊，心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、清晰，細(xì)胞核呈卵圓形，大小一致;隨周齡增加，模型組小鼠心臟組織病變逐漸加重;與同周齡模型組相比，治療組小鼠心肌組織病變減輕，可見輕度肌漿溶解。以24周為例，見圖1。

Figure 1. Morphological changes of myocardial tissue were observed using HE staining.

圖1 24周齡各組小鼠心肌組織形態(tài)學(xué)觀察

2 TUNEL 染色觀察小鼠心肌細(xì)胞凋亡

TUNEL染色結(jié)果顯示，對照組小鼠心肌細(xì)胞排列有序，細(xì)胞核圓而大，核仁清晰，TUNEL陽性細(xì)胞少；與對照組比較，模型組小鼠TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)目顯著增多(P<0.01)；與模型組比較，治療組小鼠心肌細(xì)胞 TUNEL 陽性細(xì)胞數(shù)目顯著減少(P<0.01),見圖2。

Figure 2. Myocardial apoptosis in type 2 diabetic mice was observed by TUNEL staining. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsmodel group.

圖2 TUNEL 染色觀察2 型糖尿病小鼠心肌細(xì)胞凋亡

3 各組小鼠心臟組織中GRP78、 CHOP和PUMA的mRNA表達(dá)水平

Real-time PCR結(jié)果顯示：21周、24周和28周時，模型組小鼠心肌組織中GRP78、CHOP和PUMA mRNA表達(dá)水平顯著高于對照組(P<0.01)；與模型組比較，治療組小鼠心肌組織中GRP78，CHOP和PUMA mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，但仍高于對照組，差異不顯著，見圖3。

Figure 3. The expression of GRP18, CHOP and PUMA mRNA in each groups were detected by real-time PCR. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

圖3 Real-time PCR檢測各組小鼠目的基因mRNA表達(dá)

4 各組小鼠心臟組織中GRP78、 CHOP和PUMA 蛋白的表達(dá)情況

Western blot結(jié)果顯示：21周、24周和28周時，模型組小鼠心肌組織中GRP78、CHOP和PUMA 蛋白表達(dá)水平顯著高于對照組(P<0.01)；與模型組比較，治療組小鼠心肌組織中GRP78、CHOP和PUMA 蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，見圖4。

5 聯(lián)合治療對2型糖尿病小鼠心肌組織凋亡相關(guān)通路的影響

Western blot結(jié)果顯示，與對照組組比較，模型組小鼠心肌組織中cleaved caspase-3、cleaved caspase-9和cleaved PARP蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)，而caspase-3、 caspase-9和PARP蛋白表達(dá)水平無明顯變化；與模型組比較，治療組小鼠心肌組織中cleaved caspase-3、cleaved caspase-9和cleaved PARP蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，見圖5。

討 論

高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致糖尿病心肌損傷的重要原因。心肌細(xì)胞凋亡增多引起心肌細(xì)胞數(shù)量的相對減少也是糖尿病心肌損傷發(fā)生的重要原因之一[10]。本研究結(jié)果顯示黃芪注射液聯(lián)合葛根素注射液治療能緩減2型糖尿病小鼠心肌損傷病情，表明黃芪注射液聯(lián)合葛根素注射液聯(lián)具有心肌保護(hù)功能；進(jìn)一步觀察到治療組小鼠心肌組織中凋亡的細(xì)胞明顯減少，提示黃芪注射液聯(lián)合葛根素注射液發(fā)揮心肌保護(hù)功能至少部分通過抑制2型糖尿病小鼠心肌細(xì)胞凋亡而實現(xiàn)。

ERS在糖尿病心臟病變的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用[11]，GRP78、CHOP和PUMA共同調(diào)控ERS介導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程[12-14]。GRP78是ERS發(fā)生的標(biāo)志物[15]，其通過促進(jìn)蛋白質(zhì)的正確折疊、協(xié)助跨膜轉(zhuǎn)運至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、降低細(xì)胞對Tc細(xì)胞的敏感性，抑制細(xì)胞凋亡[16-17]。ERS發(fā)生后通過激活PERK和ATF4信號通路誘導(dǎo)CHOP表達(dá)，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)促凋亡蛋白Bid和PUMA的表達(dá)，從而激活細(xì)胞線粒體凋亡途徑[18]。PUMA在p53誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[19]，研究證實PUMA蛋白通過翻譯后修飾而易于與Bcl-2家族抗凋亡蛋白結(jié)合，進(jìn)而被蛋白酶體降解而抑制細(xì)胞凋亡[20]。本研究結(jié)果顯示模型組GRP78、CHOP和PUMA mRNA表達(dá)水平顯著高于對照組，表明模型組發(fā)生了ERS；治療組GRP78、CHOP和PUMA表達(dá)的減少表明ERS反應(yīng)程度減輕；Western blot結(jié)果顯示，模型組小鼠心肌組織中GRP78、CHOP、PUMA、cleaved PARP蛋白水平顯著增高，進(jìn)一步證實ERS通路被激活；同時caspase通路也被激活(cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白水平顯著增加)，表明2型糖尿病小鼠心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)通路被激活，心肌細(xì)胞凋亡增多；而給予黃芪注射液聯(lián)合葛根素注射液治療后，小鼠心肌組織中的caspase通路和PARP通路被抑制，幾乎恢復(fù)到基礎(chǔ)水平，與對照組比較無明顯差異，說明黃芪注射液聯(lián)合葛根素注射液能抑制2型糖尿病小鼠心肌細(xì)胞凋亡。

Figure 4. Expression of GRP78, CHOP and PUMA proteins in each group were measured by Western blot. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsmodel group.

圖4 Western blot檢測各組小鼠心肌組織中目的蛋白表達(dá)

Figure 5. Effects of combination therapy on apoptosis-related protein expression in myocardium of type 2 diabetic mice. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsmodel group.

圖5 聯(lián)合治療對2型糖尿病小鼠心肌組織凋亡相關(guān)通路的影響

本研究結(jié)果證實在2型糖尿病心臟病變過程中，發(fā)生了心肌細(xì)胞的病變、細(xì)胞凋亡及ERS，其凋亡相關(guān)通路caspase和PARP通路被激活。黃芪注射液與葛根素注射液聯(lián)用可以通過抑制ERS和caspase通路的激活、減少心肌細(xì)胞的凋亡，從而減緩2型糖尿病心臟病變。