劉勇志， 張 童， 沈 毅， 鄧 爽

[核工業(yè)四一六醫(yī)院(成都醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院)胸外科， 四川 成都 610000]

非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)屬于世界高發(fā)的惡性腫瘤之一，以手術(shù)治療、放療和化療為主要治療手段[1]。然而NSCLC早期癥狀不明顯，患者就診時多數(shù)已是晚期，此時化療是唯一有效的治療方式[2]。順鉑(cisplatin，DDP)是化療中常用的化學(xué)藥物，能夠阻礙DNA復(fù)制，影響細(xì)胞周期，從而誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤生長[3-4]。但長期使用易使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，影響治療效果。因此，尋找克服腫瘤細(xì)胞耐藥性的方法，對改善NSCLC的治療具有重要意義。

微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是一種高度保守的非編碼RNA序列，廣泛存在于生物體內(nèi)，參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡等生物過程，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及腫瘤細(xì)胞的耐藥性密切相關(guān)[5-6]。已有多項研究表明，miRNA在胃癌[7]和卵巢癌[8]等多種腫瘤中差異表達，調(diào)控癌細(xì)胞增殖和凋亡并影響細(xì)胞耐藥性。其中，miR-125a-5p與多種腫瘤的化療耐藥性有關(guān)[9-10]，但其在NSCLC化療耐藥中的作用機制尚未報道。本文以A549/DDP細(xì)胞為研究對象，通過檢測miR-125a-5p對細(xì)胞活力及凋亡的影響并預(yù)測其潛在靶基因，探討miR-125a-5p影響A549/DDP細(xì)胞順鉑耐藥性的作用機制。

材 料 和 方 法

1 臨床資料

選取2015年3月～2017年12月就診于核工業(yè)四一六醫(yī)院(成都醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院)經(jīng)病理科確診為非小細(xì)胞肺癌的患者共52例，其中男性33例，女性19例，年齡45～81歲，收集患者經(jīng)手術(shù)切除的腫瘤組織及對應(yīng)的癌旁組織(距離病灶≥5 cm)，所有組織切除迅速放入液氮中，帶回后存放于-80 ℃ 冰箱。本實驗獲得醫(yī)學(xué)倫理委員會審批同意，所有患者術(shù)前未接受放療、化療等相關(guān)治療并簽署知情同意書。

2 材料

人支氣管上皮細(xì)胞株16-HBE和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫；順鉑耐藥細(xì)胞株A549/DDP購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫。胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶和DDP購自Sigma；MTT和Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自賽默飛世爾科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒和SDS-PAGE 試劑盒購自江蘇碧云天生物技術(shù)公司；TRIzol試劑購自北京天根生化科技有限公司；LipofectamineTM2000購自Invitrogen；TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒購自TaKaRa；miR-125a-5p mimics、miR-125a-5p inhibitor、mimics NC、inhibitor NC、si-NC和si-LIMK1購自Invitrogen； I 抗和II 抗購自Abcam；螢光素酶載體購自Promega。

3 方法

3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 使用含10% 胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)，其中A549/DDP細(xì)胞培養(yǎng)基中含終濃度1 mg/L的DDP，每隔2 d更換1次新鮮培養(yǎng)基，細(xì)胞融合度約85% 時進行傳代。收集對數(shù)生長期的細(xì)胞，加入適量胰酶消化，接種至6孔培養(yǎng)板常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至融合度約50%，參照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書將mimics NC、miR-125a-5p mimics、inhibitor NC、miR-125a-5p inhibitor、si-NC和si-LIMK1分別轉(zhuǎn)染至A549/DDP細(xì)胞并標(biāo)記為mimics-NC組、mimics-miR-125組、inhibitor-NC組、inhibitor-miR-125組、si-NC組和si-LIMK1組。

3.2 RT-qPCR檢測miR-125a-5p表達 適量組織或細(xì)胞充分研磨后，加入TRIzol試劑提取總RNA。使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，TaKaRa熒光定量試劑盒配制反應(yīng)體系，置于實時熒光定量PCR儀上進行擴增。以β-actin為內(nèi)參照，所用引物及序列見表1，mRNA相對表達量用2-ΔΔCt表示。

表1 RT-qPCR引物序列

3.3 MTT法檢測細(xì)胞活力及DDP的半數(shù)抑制濃度(IC50) 收集轉(zhuǎn)染的A549/DDP細(xì)胞和常規(guī)培養(yǎng)的A549細(xì)胞，加入適量胰酶消化，以每孔2×104個的密度接種于96孔板中常規(guī)培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)0 h、24 h、48 h和72 h時加入20 μL MTT(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸出培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，室溫振蕩反應(yīng)10 min，使用酶標(biāo)儀測定490 nm的吸光度(A)值。細(xì)胞存活率(%)=(對照組A值-實驗組A值)÷實驗組A值×100%。藥物對細(xì)胞的抑制率(%)=(1-實驗組A值/對照組A值)×100%，計算IC50值。

3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 轉(zhuǎn)染的A549/DDP細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，使用PBS緩沖液洗滌3次，胰酶消化后離心收集。加入500 μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，分別加入Annexin V-FITC和碘化丙啶，染色20 min后使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

3.5 Western blot實驗 收集轉(zhuǎn)染的A549/DDP細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min取上清，BCA試劑盒測定蛋白濃度。取50 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDG膜，5% 脫脂奶粉封閉液封閉1 h，分別加入 I 抗4 ℃ 孵育過夜，TBST洗膜后加入 II 抗孵育1 h。TBST洗膜后ECL發(fā)光顯影。

3.6 螢光素酶報告基因檢測 收集A549/DDP細(xì)胞，按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書將LIMK1-3’UTR野生型質(zhì)粒與mimics NC和miR-125a-5p mimics共轉(zhuǎn)染，將LIMK1-3’UTR突變型質(zhì)粒與mimics NC和miR-125a-5p mimics共轉(zhuǎn)染，常規(guī)培養(yǎng)48 h。裂解液裂解后4 ℃、 12 000 r/min離心10 min收集上清，檢測細(xì)胞中螢光素酶活性。

4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學(xué)分析

實驗中每個樣本重復(fù)3次， 運用SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)進行描述，兩組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，多組數(shù)據(jù)總體比較采用單因素方差分析，總體有差異再用SNK-q檢驗進行多重比較。偏態(tài)數(shù)據(jù)采用中位數(shù)(下四分位數(shù)，上四分位數(shù))[median (Q1,Q3)]描述，兩組數(shù)據(jù)比較采用Mann-WhitneyU檢驗,多組數(shù)據(jù)比較采用Kruskal-WallisH檢驗,發(fā)現(xiàn)差異再用Nemenyi法進行多重比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 miR-125a-5p在非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞中的表達

MTT法檢測細(xì)胞活力發(fā)現(xiàn)，A549/DDP細(xì)胞活力明顯高于A549細(xì)胞(P<0.05)，見圖1A，提示A549/DDP細(xì)胞具有DDP耐藥性。RT-qPCR檢測結(jié)果表明，與癌旁組織相比，miR-125a-5p在非小細(xì)胞肺癌組織中表達下調(diào)(P<0.05)，見圖1B；與16-HBE細(xì)胞相比，A549細(xì)胞和A549/DDP細(xì)胞中miR-125a-5p表達均顯著下調(diào)(P<0.05)，見圖1C。

Figure 1. The expression of miR-125a-5p in the non-small-cell lung cancer (NSCLC) tissues and cells. A: the viability of A549 and A549/DDP cells was detected by MTT assay. Mean±SD.n=3. B: the expression of miR-125a-5p in the paracancerous (PC) and NSCLC tissues. Median (Q1,Q3).n=52. C: the expression of miR-125a-5p in various cell lines. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsA549 cells;#P<0.05vsPC group;△P<0.05vs16-HBE cells.

圖1 miR-125a-5p在非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞中的表達

2 過表達miR-125a-5p降低A549/DDP細(xì)胞耐藥性

與control組和mimics-NC組相比，轉(zhuǎn)染miR-125a-5p mimics的A549/DDP細(xì)胞中miR-125a-5p的表達上調(diào)(P<0.05)，細(xì)胞活力下降(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率增加(P<0.05)，DDP對細(xì)胞的IC50值減小(P<0.05)，耐藥相關(guān)蛋白P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶π(glutathioneS-transfe-rase π, GST-π)蛋白表達下調(diào)(P<0.05)，見圖2。

3 抑制miR-125a-5p表達提高A549/DDP細(xì)胞耐藥性

與control組和inhibitor-NC組相比，轉(zhuǎn)染miR-125a-5p抑制劑的A549/DDP細(xì)胞中miR-125a-5p的表達下調(diào)(P<0.05)，細(xì)胞活力升高(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)，DDP對細(xì)胞的IC50值增大(P<0.05)，P-gp和GST-π的表達上調(diào)(P<0.05)，見圖3。

Figure 2. Up-regulation of miR-125a-5p inhibited the drug resistance of A549/DDP cells. A: the expression of miR-125a-5p in va-rious groups; B: the cell viability in various groups; C: the apoptotic rate in various groups; D: IC50values of DDP in va-rious groups; E: the protein expression of P-gp and GST-π. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group and mimics-NC group.

圖2 過表達miR-125a-5p降低A549/DDP細(xì)胞耐藥性

Figure 3. Inhibition of miR-125a-5p enhanced the drug resistance of A549/DDP cells. A: the expression of miR-125a-5p in various groups; B: the cell viability in various groups; C: the apoptotic rate in various groups; D: IC50values of DDP in various groups; E: the protein expression of P-gp and GST-π. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group and inhibitor-NC group.

圖3 抑制miR-125a-5p提高A549/DDP細(xì)胞耐藥性

4 LIMK1是miR-125a-5p的靶基因

過表達miR-125a-5p的A549/DDP細(xì)胞中LIMK1的表達較mimics-NC組下調(diào)(P<0.05)；敲減miR-125a-5p表達的A549/DDP細(xì)胞中LIMK1的表達較inhibitor-NC組上調(diào)(P<0.05)，證明miR-125a-5p能夠調(diào)控LIMK1表達，見圖4A、B。通過TargetScan在線預(yù)測，發(fā)現(xiàn)LIMK1-3’UTR上存在miR-125a-5p的結(jié)合位點，見圖4C。進一步使用螢光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-125a-5p和LIMK1的靶向性，發(fā)現(xiàn)與mimics-NC組相比，轉(zhuǎn)染miR125a-5p模擬物的LIMK1野生型細(xì)胞的螢光素酶活性降低(P<0.05)，而LIMK1突變型細(xì)胞的螢光素酶活性無明顯變化，見圖4D，表明LIMK1是miR-125a-5p的靶基因。miR-125a-5p與LIMK1表達呈負(fù)相關(guān)(r=-0.7823，P<0.01)，見圖4E。

Figure 4. miR-125a-5p regulated the expression of LIMK1. A: the mRNA expression of LIMK1 in various groups; B: the protein expression of LIMK1 in various groups; C: the complementary sequences of miR-125a-5p and LIMK1; D: the result of dual-luciferase assay; E: the negative correlation between miR-125a-5p and LIMK1. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmimics-NC group;#P<0.05vsinhibitor-NC group.

圖4 miR-125a-5p靶向調(diào)控LIMK1表達

5 敲減LIMK1表達降低A549/DDP細(xì)胞對DDP的耐藥性并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

對比癌旁組織，NSCLC組織中LIMK1表達上調(diào)(P<0.05)，見圖5A；A549細(xì)胞和A549/DDP細(xì)胞中LIMK1的表達較16-HBE細(xì)胞上調(diào)(P<0.05)，見圖5B。與control組和si-NC組相比，敲減LIMK1表達后A549/DDP細(xì)胞中的LIMK1表達下調(diào)(P<0.05)，細(xì)胞活力下降(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)，DDP對細(xì)胞的IC50值減小(P<0.05)，P-gp和GST-π 蛋白的表達下調(diào)(P<0.05)，見圖5C～G。

Figure 5. Silencing ofLIMK1inhibited A549/DDP cell resistance to DDP and induced apoptosis. A: the expression of LIMK1 in paracancerous (PC) and NSCLC tissues [median (Q1,Q2),n=52]; B: the expression of LIMK1 in different cell lines; C: the protein expression of LIMK1 in various groups; D: the cell viability in various groups; E: the apoptosis in various groups; F: IC50values of DDP in various groups; G: the protein expression of P-gp and GST-π in various groups. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsPC group;#P<0.05vs16-HEB cells;△P<0.05vscontrol group and si-NC group.

圖5 敲減LIMK1表達降低A549/DDP細(xì)胞對DDP的耐藥性并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

6 過表達LIMK1能逆轉(zhuǎn)miR-125a-5p降低A549/DDP細(xì)胞對DDP的耐藥性并誘導(dǎo)凋亡的作用

MTT法檢測細(xì)胞活力，結(jié)果顯示，LIMK1組較vector組細(xì)胞活力升高(P<0.05)，mimics-miR-125+LIMK1組較mimics-miR-125+vector組細(xì)胞活力升高(P<0.05)，見圖6A。進一步檢測細(xì)胞凋亡率、DDP的IC50值及P-gp和GST-π蛋白表達，結(jié)果顯示，與vector組或mimics-miR-125+vector組相比，過表達LIMK1或共表達miR-125a-5p和LIMK1，A549/DDP細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)，DDP對細(xì)胞的IC50值增大(P<0.05)，P-gp和GST-π 蛋白的表達上調(diào)(P<0.05)，見圖6B～D。

討 論

化療是晚期NSCLC患者延長壽命、改善生活質(zhì)量的希望,其中順鉑已被廣泛應(yīng)用于腫瘤的臨床治療，然而治療過程中癌細(xì)胞對順鉑耐藥性的產(chǎn)生限制了順鉑的療效[11]。已有報道表明，miRNA可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和凋亡影響NSCLC細(xì)胞對順鉑的敏感性[12]。Li等[13]研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-196a表達可逆轉(zhuǎn)A549/DDP細(xì)胞的順鉑耐藥性；此外，Zhang等[14]通過實驗證明，miR-181c能夠通過靶向調(diào)控WIF-1表達增強癌細(xì)胞順鉑抗性。

miR-125a-5p在胰腺癌、宮頸癌和胃癌等多種腫瘤組織中差異表達，影響腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡和遷移，具有抑癌因子的作用[15-17]；在NSCLC組織中miR-125a-5p表達下調(diào)并調(diào)控癌細(xì)胞的遷移和侵襲[18]。隨著不斷的研究，發(fā)現(xiàn)miR-125a-5p不僅能影響腫瘤細(xì)胞生長和遷移，對腫瘤細(xì)胞在化療中產(chǎn)生的耐藥性也有一定影響，但相關(guān)研究較少。Naidu等[10]發(fā)現(xiàn)在NSCLC中，miR-125a-5p能通過靶向調(diào)控KRAS等腫瘤基因而增強癌細(xì)胞藥物敏感性。為探討miR-125a-5p對NSCLC順鉑耐藥性的影響及作用機制，本文通過檢測miR-125a-5p在NSCLC組織和細(xì)胞中的表達及其對A549/DDP細(xì)胞凋亡和耐藥蛋白表達的影響，發(fā)現(xiàn)miR-125a-5p在NSCLC組織及細(xì)胞株中表達下調(diào)，過表達miR-125a-5p能抑制A549/DDP細(xì)胞中耐藥P-gp和GST-π蛋白表達，降低細(xì)胞活力，促進細(xì)胞凋亡并使IC50值減??；抑制miR-125a-5p表達則得到相反的結(jié)果，表明miR-125a-5p能夠影響A549/DDP細(xì)胞順鉑耐藥性。通過TargetScan在線預(yù)測及螢光素酶報告基因?qū)嶒灒Y(jié)果顯示miR-125a-5p能靶向調(diào)控LIMK1表達，兩者呈負(fù)相關(guān)。

Figure 6. Over-expression of LIMK1 reversed the effects of miR-125a-5p on the drug resistance and apoptosis of A549/DDP cells. A: the cell viability in various groups; B: the apoptosis in various groups; C: IC50values of DDP in various groups; D: the results of Western blot for determining the protein levels of P-gp and GST-π in various groups. Mean±SD.n=3.#P<0.05vsvector group;*P<0.05vsmimics-miR-125+vector group.

圖6 過表達LIMK1能逆轉(zhuǎn)miR-125a-5p降低A549/DDP細(xì)胞耐藥性并誘導(dǎo)凋亡的作用

LIMK1屬于LIM激酶(LIM kinase，LIMK)蛋白家族，能夠使肌動蛋白結(jié)合蛋白cofilin磷酸化而調(diào)控細(xì)胞的有絲分裂、遷移和侵襲[19]。在乳腺癌和非小細(xì)胞肺癌組織中，LIMK1表達顯著上調(diào)，促進癌細(xì)胞遷移和侵襲[20-21]。為進一步研究LIMK1與腫瘤細(xì)胞耐藥性是否相關(guān)，陳瑞等[22]研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)LIMK1表達能增強人骨肉瘤細(xì)胞的耐藥性。并且在NSCLC細(xì)胞順鉑耐藥性的研究中，Chen等[23]發(fā)現(xiàn)，敲低LIMK1能降低肺癌細(xì)胞對順鉑的敏感性。為進一步驗證miR-125a-5p與LIMK1在NSCLC細(xì)胞耐藥性中的共同作用，我們使用RT-qPCR和Western blot實驗進行檢測，結(jié)果表明LIMK1在NSCLC及其細(xì)胞株中表達上調(diào)。敲減LIMK1表達能夠抑制A549/DDP細(xì)胞活力并誘導(dǎo)凋亡，使IC50值減小，抑制耐藥相關(guān)蛋白P-gp和GST-π的表達，與上述結(jié)論一致；而共表達miR-125a-5p和LIMK1，則miR-125a-5p對A549/DDP細(xì)胞活力及P-gp和GST-π蛋白表達的抑制作用減弱，對細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用亦減弱，DDP的IC50值回升。

綜上所述，在NSCLC組織及其細(xì)胞株中，miR-125a-5p表達下調(diào)而LIMK1表達上調(diào)，LIMK1是miR-125a-5p的靶基因，且miR-125a-5p可靶向LIMK1而逆轉(zhuǎn)肺癌A549/DDP細(xì)胞對順鉑的耐藥性。這一結(jié)論補充了NSCLC順鉑耐藥的機制，為尋找克服NSCLC順鉑耐藥性的新方案提供可能途徑。